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1、林 红五台校区1号教学楼147室,细胞培养概述,内 容,细胞培养基本理论细胞培养基本要求（无菌操作)细胞培养基本技术,第一部分 细胞培养基本理论,细胞培养概述细胞培养简史细胞类型及其形态生长特点和生长过程,一 细胞培养概述,医学中泛指的体外培养（In Vitro）,细胞培养（cell culture）模拟机体内生理条件，将细胞从机体中取出，在人工条件下使其生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。群体培养（mass culture）将大量细胞置于培养瓶中，让其贴壁或悬浮生长，形成均匀的单层细胞或单细胞悬液。克隆培养（clone culture）即将少数的细胞加入
2、培养瓶中，贴壁后彼此间隔距离较远，经过繁殖每一个细胞形成一个集落，称为克隆。,ht-1080 人皮肤纤维肉瘤细胞株,黑色素瘤细胞 单克隆,组织培养（tissue culture）指把活体的组织取出，分成小块，直接置于培养瓶底或通过胶原纤维血浆支持物的培养瓶底来进行培养。特点：组织不失散，细胞保持原有的组织关系。形成生长(cut growth)或形成由扁薄细胞构成的单层细胞培养物。在体外生长时，细胞间呈相互依存、互相影响的关系。,器官培养（organ culture）将活体中器官或器官一部分取出，在体外生长、生存，并使其保持器官原有的结构和功能特征的培养。特点：培养的器官在合适的条件下能生长和分
3、化，存活数周或1 年。观察受限，只能用组织切片的方法观察或用透射电镜、扫描电镜观察。,细胞培养定义,优点：1活细胞：同时、大量、均一性、重复性；2可控制：各种物理、化学、生物等因素可调控；3研究方法多样：倒置、荧光、电子、激光共焦显微镜、流式细胞术、免疫组织化学、原位杂交、同位素标记；4应用广：不同物种、年龄、组织，正常或异常（肿瘤）；缺点：人工所模拟的条件与体内实际情况仍不完全相同；当细胞被置于体外培养后，生活在缺乏动态平衡的环境中，时间久了，必然发生变化。,二 细胞简史,动物细胞体外培养的历史可追溯到1907年，美国生物学家Harrison在无菌条件下，以淋巴液为培养基成功地在试管中培养了
4、蛙胚神经组织达数周，创立了体外组织培养法。在随后的近一个世纪里，随着细胞生物学、培养系统及培养方法等领城的不断丰富和完善，动物细胞培养技术得到了很大的发展。发展至今已成为生物、医学研究和应用中广泛采用的技术方法，利用动物细胞培养生产具有重要医用价值的酶、生长因子、疫苗和单抗等，已成为医药生物高技术产业的重要部分。大规模动物细胞培养在生物技术产业化进程中显示出强大的潜力。,细胞培养简史,Historical events in the development of cell culture,1878:Claude Bernard proposed that physiological syste
5、ms of an organism can be maintained in a living system after the death of an organism.1885:Roux maintained embryonic chick cells in a saline culture.1897:Loeb demonstrated the survival of cells isolated from blood and connective tissue in serum and plasma.1903:Jolly observed cell division of salaman
6、der leucocytes in vitro.1907:Harrison cultivated frog nerve cells in a lymph clot held by the hanging drop method and observed the growth of nerve fibers in vitro for several weeks.He was considered by some as the father of cell culture.1910:Burrows succeeded in long term cultivation of chicken embr
7、yo cell in plasma clots.He made detailed observation of mitosis.,Contd.,1911:Lewis and Lewis made the first liquid media consisted of sea water,serum,embryo extract,salts and peptones.They observed limited monolayer growth.1913:Carrel introduced strict aseptic techniques so that cells could be cultu
8、red for long periods.1916:Rous and Jones introduced proteolytic enzyme trypsin for the subculture of adherent cells.1923:Carrel and Baker developed Carrel or T-flask as the first specifically designed cell culture vessel.They employed microscopic evaluation of cells in culture.1927:Carrel and Rivera
9、 produced the first viral vaccine-Vaccinia.1933:Gey developed the roller tube technique.,Contd.,1940s:The use of the antibiotics penicillin and streptomycin in culture medium decreased the problem of contamination in cell culture.1948:Earle isolated mouse L fibroblasts which formed clones from singl
10、e cells.Fischer developed a chemically defined medium,CMRL 1066.1952:Gey established a continuous cell line from a human cervical carcinoma known as HeLa(Helen Lane)cells.Dulbecco developed plaque assay for animal viruses using confluent monolayers of cultured cells.1954:Abercrombie observed contact
11、 inhibition:motility of diploid cells in monolayer culture ceases when contact is made with adjacent cells.1955:Eagle studied the nutrient requirements of selected cells in culture and established the first widely used chemically defined medium.1961:Hayflick and Moorhead isolated human fibroblasts(W
12、I-38)and showed that they have a finite lifespan in culture.1964:Littlefield introduced the HAT medium for cell selection.1965:Ham introduced the first serum-free medium which was able to support the growth of some cells.,Contd.,1965:Harris and Watkins were able to fuse human and mouse cells by the
13、use of a virus.1975:Kohler and Milstein produced the first hybridoma capable of secreting a monoclonal antibody.1978:Sato established the basis for the development of serum-free media from cocktails of hormones and growth factors.1982:Human insulin became the first recombinant protein to be licensed
14、 as a therapeutic agent.1985:Human growth hormone produced from recombinant bacteria was accepted for therapeutic use.1986:Lymphoblastoid IFN licensed.1987:Tissue-type plasminogen activator(tPA)from recombinant animal cells became commercially available.1989:Recombinant erythropoietin in trial.1990:
15、Recombinant products in clinical trial(HBsAG,factor VIII,HIVgp120,CD4,GM-CSF,EGF,mAbs,IL-2).,细胞培养技术的发展,三 细胞的形态和类型,细胞的多形性 细胞形态上表现为多种多样，如呈圆形、椭圆形、正方形、柱形、扁平形、梭形、星形和多边形等。此外，有些细胞如吞噬细胞没有固定的形态。由不同生长方式造成的差异 呈悬浮生长时，因生长在液体环境中，胞内渗透压高于周围液体环境，因此胞体基本呈圆形。呈贴附于支持物上生长的细胞，开始为圆形，很快过渡成扁平形，并逐渐恢复至原先的细胞形态。,细胞来源,成纤维型细胞（Fibro
16、blast-liked cells）上皮型细胞（Epithelium-liked cells）其它，不定型,细胞培养的形态与结构,上皮细胞 来源于皮肤及其衍生物、乳腺、肝、消化道上皮等组织的细胞，由上皮性肿瘤(鳞状细胞癌)等的培养的细胞均呈上皮样。形态为扁平的多角形，胞质近中央处有圆形的细胞核。细胞紧密相靠、互相衔接成片，极性不明显。,口腔上皮细胞,细胞培养的形态与结构,成纤维细胞 起源于中胚层的细胞，体外培养似成纤维细胞型，如纤维结缔组织、平滑肌、心肌、血管内皮、人胚肺等细胞。具有长短不等的数个细胞突起，因而多呈纤维状、梭形，少数呈现不规则三角形或扇形，核为卵圆形，位于靠近胞质的中央。细胞排
17、列为漩涡状、放射状或似栅栏状。,鼠成纤维细胞（NIH3T3）,细胞生长方式和类型,按生长方式贴壁型细胞（Monolayer cells）悬浮型细胞（Suspension cells）绝大多数有机体细胞属贴壁型细胞，只有少数细胞类型如某些肿瘤细胞和白细胞可在悬浮状态下生长。按细胞形态(贴壁细胞）成纤维型细胞（Fibroblast-liked cells）上皮型细胞（Epithelium-liked cells）其它，不定型,处于体外培养状态下的贴附生长型细胞在形态上表现单一而失去了在体内原有的某些特征。形态各异反映其胚层起源。如来源于内外胚层的细胞多呈上皮型；来自中胚层的则易呈成纤维细胞型。成纤
18、维型细胞皮型细胞游走型细胞多形型细胞,贴壁型生长细胞或锚着依存性细胞（anchorage-dependent cells）,成纤维型细胞梭形或不规则三角形中央有卵圆形核胞质向外伸出长短不同的突起中胚层间质起源,上皮型细胞扁平不规则多角形细胞中央有圆形核紧密相连单层膜样生长内、外胚层细胞如皮肤、表皮衍生物、消化管上皮等,游走型细胞散在生长，一般不连成片细胞质经常伸出伪足或突起活跃的游走或变形运动羊水细胞培养的早期,多形细胞型 难以确定规律和稳定的形态 如神经组织的细胞等,贴壁型细胞形态,生长方式和类型,成纤维型细胞 胞体呈梭形或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质向外伸出23 个长短不同的突起，细
19、胞呈放射状、火焰状或漩涡状生长。,生长方式和类型,上皮型细胞 胞体呈扁平不规则多角形，中有圆形核，细胞紧密相连成单层膜。,生长方式和类型,游走型细胞 在支持物上散在生长，胞质经常伸出伪足或突起，呈活跃的游走或变形运动，运动速度快而不规则，细胞形态不稳定，有时难以与其他型细胞相区别。,生长方式和类型,多形型细胞 由于难以确定其形态而得名。如吞噬细胞常属此类。,生长方式和类型,悬浮型生长细胞 由于悬浮在培养液中生长，生存空间大，可维持对数生长期，也允许长时间生长，传代繁殖方便，能繁殖更多细胞，饱和度大，可达高密度，适合大量生产，有工业应用价值。传代时只需稀释，无需消化处理，易于收获，便于做细胞代谢
20、等研究。,更多精彩图片请上网搜索，如“生物秀”。,细胞培养的形态与结构,细胞的形态与培养条件的关系 初代培养的正常二倍体细胞，除大体形态外，其构造和生物学性状与原体内细胞极相近，细胞均质性和透明度都很强。若随体外培养时间延长及反复传代，细胞会出现轮廓增强、核仁增多，甚至出现双核或多核等变化。,细胞培养的形态与结构,细胞超微结构的观察（电镜）三层膜结构、脂质双分子层 由微丝、微管构成的骨架系统CSS 线粒体、溶酶体、高尔基复合体、中心体和内质网 有双层结构的核膜，核内有一个或数个核仁，也能看到 核孔,细胞培养的形态与结构,用普通显微镜观察，细胞功能健康活跃时，呈现均质而透明的，结构极不明显。用相
21、差显微镜观察，可看清细胞的轮廓和内部结构。用固定染色法和特殊技术可显示细胞器等结构。,观察正常情况下的细胞,用anti-vimentin和TRITC染中间丝vimentin蛋白（红色），FITC-Phalloidin染F-actin（绿色），DAPI染核（蓝色）。（荧光显微镜40X）,细胞培养的形态与结构,一般显微镜下细胞轮廓会增强，反差增大。用相差显微镜可看到在胞质中出现颗粒、脂滴和空泡等，反差很大的暗色小颗粒是变形的线粒体。,观察功能不良的细胞,四 贴壁型细胞的生长特点,贴壁型细胞的生长特点,贴附和伸展接触抑制生长的密度限制,贴附和伸展（attached and strench),多数体外
22、培养细胞的基本生长特点。,接触抑制（Contact inhibition）,细胞相互接触时，将停止增长；细胞停留在细胞周期的G0期；正常细胞并不互相重叠生长，但转化的细胞或肿瘤细胞却可以继续生长导致细胞重叠堆积生长。,生长的密度限制（Density Inhibition）（又称：密度依赖性调节）,正常细胞接触汇合成单层后，虽发生接触抑制，只要营养充分，细胞仍然能够进行增殖分裂，因此细胞数量仍在增多。但当细胞密度进一步增大，培养液中营养成分减少，代谢产物增多时，细胞因营养的枯竭和代谢物的影响，则发生密度抑制导致细胞分裂停止。而转化细胞或肿瘤细胞的密度依赖性调节常常降低，能生长至较高的终末细胞密度
23、。,生长过程,单个细胞的生长过程细胞周期（cell cycle）细胞系的生长过程培养细胞的生命周期（Life Span of Culture Cells）每代细胞的生长过程,细胞系的生长过程,原代培养（初代培养）期传代期衰退（老）期,原代培养（Primary Culture）期,也称初代培养。即从体内取出组织按种培养到第一次传代阶段，一般持续14 周。此期细胞呈活跃的移动，可见细胞分裂，但不旺盛。初代培养细胞与体内原组织在形态结构和功能活动上相似性大。细胞群是异质的（Heterogeneous），也即各细胞的遗传性状互不相同，细胞相互依存性小。如把这种细胞群稀释分散成单细胞，在软琼脂培养基中进
24、行培养时，细胞克隆形成率（Cloning Efficiency）很低，即细胞独立生存性差。,原代培养（primaryculture）从动物机体取出的进行培养的细胞群。生长缓慢，繁殖一定的代数后（一般10代以内）停止生长。,克隆（clone）亦称无性繁殖系或无性系。对细胞来说，克隆是指由同一个祖先细胞通过有丝分裂产生的遗传性状一致的细胞群。,细胞系（cellline）从肿瘤组织培养建立的细胞群或培养过程中发生突变或转化的细胞，在培养条件下可无限繁殖,细胞株（cellstrain）从原代培养细胞群中筛选出的具有特定性质或标志的细胞群，能够繁殖50代左右，在培养过程中其特征始终保持。,原代培养期与细
25、胞系,The American Type Culture Collection(ATCC)ATCC（American Type Culture Collection）为美国典型培养物保藏中心，是世界上最大的保存生物种类和数量最多的机构，保存微生物藻类、原生动物、细胞株等约29000株。细胞株价格一般在4000人民币/株左右，一般1到2个月到货，基本上以冻存管的形式提供。The European Collection of Animal Cell Culture(ECACC)National Institute of Health(NIH),USA National Cancer Institu
26、te(NCI),USA,细胞系资源,传代培养期（Passage）,在培养条件较好情况下，细胞增殖旺盛，并能维持二倍体核型，呈二倍体核型的细胞称二倍体细胞系（Diploid Cell Line）。细胞应在初代培养期或传代后早期冻存。一般情况下当传代1050次左右，细胞增殖逐渐缓慢，以至完全停止，细胞进入衰退期。,体外培养的细胞增殖能力不是无限的，传代次数有一定的界限，称为“Hayflick极限”。传代次数与物种寿命有关：小鼠寿命3年，传代12次；龟寿命200年，传代140次。传代次数与个体年龄成反比：人胚胎，40-60代；幼年，20-40代；成年，10-30代；早老病儿童，2-10代。,细胞传代
27、次数（Passage Number）,衰退（老）期（senescence）,一般有限细胞系在此期的细胞增殖缓慢，并逐渐完全停止，进而发生衰退和死亡。其特点是端粒酶进行性缩短，直到最后细胞不能再进一步分裂。例外：生殖细胞、干细胞和转化细胞（肿瘤细胞）,无限细胞系,度过“危险期”,自发转化,组织培养细胞一代生存期,指从细胞接种到分离再培养时的一段时间，这已成为培养工作中的一种习惯说法，它与细胞倍增一代非同一含义。如某一细胞系为第153代细胞，即指该细胞系已传代153次。它与细胞世代（Generation）或倍增Doubling）不同；在细胞一代中，细胞能倍增36次。分为潜伏期；指数增生期；停滞期,
28、潜伏期（Latent Phase）,细胞接种培养后，先经过一个在培养液中呈悬浮状态的悬浮期。此时细胞胞质回缩，胞体呈圆球形。接着是细胞附着或贴附于底物表面上，逐渐伸展、贴壁，悬浮期（潜伏期）结束。细胞种类、培养基成分和底物的理化性质等。支持物；底物表面光洁度；底面电荷；纤维连接素（Fibronectin）；细胞表面蛋白（Cell Surface Protein：CSP）；促贴附物质。,指数增生期（Logarithmic Growth Phase）,细胞增值最旺盛的阶段，细胞分裂相增多，该数量可作为判定细胞生长旺盛与否的一个重要标志，是进行实验研究的最佳时期。一般以细胞分裂（Mitotic Index：MI）表示，即细胞群中每1000个细胞中的分裂相数。0.1%0.5%受细胞种类、培养液成分、pH、培养箱温度等影响。,停滞期（Stagnate Phase）,细胞数量达饱和密度后，细胞遂停止增殖，进入停滞期或平顶期（Plateau）。需做立即分离培养即传代 否则细胞会中毒，发生形态改变，甚至脱落死亡。传代过晚（已有中毒迹象）能影响下一代细胞的机能状态。,细胞培养概念细胞培养简史细胞类型及其形态生长特点和生长过程,本课小结,Thank you!,
