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1、蛋白质工程与食品产业,内容,一、蛋白质的功能与结构二、蛋白质工程的诞生三、蛋白质工程的基本步骤和改造方法四、蛋白质工程在食品产业中的应用,一、蛋白质的功能与结构,1.1蛋白质的功能1.2蛋白质的结构,1.1蛋白质的功能,(1)蛋白质是构成生命的重要物质之一 蛋白质是一类重要而复杂的生物大分子，它广泛地存在于所有生物界的机体之中，具有许多重要的作用：构成生物体新陈代谢的几乎全部的化学反应都是在活性蛋白质-酶的催化下进行的；高等动物的免疫反应，也主要是通过蛋白质即抗原和抗体来完成的；运动时的肌肉收缩靠的是某些蛋白质的相互作用来完成的；运输氧和二氧化碳的是血红蛋白；具有代谢和调节功能的是多种蛋白质激
2、素。,(2)蛋白质的应用 蛋白质是人类赖以维持生命的重要营养来源之一。人们需要从各种肉、蛋、奶、豆类等主要食品中获得所需的蛋白质营养。用蛋白质诊断和治疗某些疾病。淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶用于帮助消化，治疗某些消化不良性疾病；胰岛素用于治疗严重的糖尿病；转氨酶作为肝病变的指标等。食品工业和轻工业中主要应用蛋白质或利用蛋白质的性质制造各种产品。例如，酿造业要用蛋白酶来增加酱油的鲜味等。用于人类衣着的羊毛、纺织品和皮革主要组成是蛋白质。,1.2蛋白质的结构,氨基酸是蛋白质的基本结构单位，各种氨基酸之间通过肽键彼此按直线形头尾相连，构成不同长短的肽链。,肽键的形成,肽链又以一定方式折叠盘绕成独特的空间结
3、构，这时才产生具有生物活性的天然蛋白质。多肽链的折叠可分为四种不同层次的结构。一级结构：仅指肽链中的氨基酸线型排列顺序，不考虑空间的排列。,牛胰岛素的氨基酸序列,二级结构：主链原子的局部空间排列，不包括侧链构象和与其他链段的相互关系，如-螺旋、-折叠等主链构象单元就是二级结构。,-螺旋,三级结构：蛋白质的多肽链在各种二级结构的基础上再进一步盘曲或折叠形成具有一定规律的三维空间结构。,碳酸酐酶的多肽骨架示意图,四级结构：具有二条或二条以上独立三级结构的多肽链组成的蛋白质，其多肽链间通过次级键相互组合而形成的空间结构。其中，每个具有独立三级结构的多肽链单位称为亚基。四级结构实际上是指亚基的立体排布
4、、相互作用及接触部位的布局。如血红蛋白分子中四个亚基之间的空间关系。,血红蛋白的结构,内容,一、蛋白质的功能与结构二、蛋白质工程的诞生三、蛋白质工程的基本步骤和改造方法四、蛋白质工程在食品产业中的应用,二、蛋白质工程的诞生,蛋白质工程是指基于蛋白质结构功能的研究结果，通过基因工程技术，改造现有蛋白质和设计制造新蛋白质，因而也称为第二代基因工程。,美国斯坦福大学的Charles Yanofsky教授，在1987年的美国微生物学会的年会上说，生物理论和技术在下列九方面的发展促进了蛋白质工程的诞生。新的克隆技术，特别是完整的cDNA的克隆技术；快速测定DNA序列的方法；从DNA序列推算蛋白质序列的较
5、好的计算机程序系统；蛋白质序列数据库的建立，使一级结构相似的蛋白质能被很快地鉴定出来，并由此研究其功能上的相似性；对原核生物和真核生物基因表达调控的进一步深入了解；用于基因体外诱变的化学、酶学和合成技术的进展；X-光晶体学的进展，包括较好的长晶体策略、同步辐射的应用、电子区域检测器的出现，以及计算机辅助的数据分析；用计算机图像系统为工具直接观察晶体数据；核磁共振技术的改进，使溶液中的原子分布能得到直接检测。,内容,一、蛋白质的功能与结构二、蛋白质工程的诞生三、蛋白质工程的基本步骤和改造方法四、蛋白质工程在食品产业中的应用,三、蛋白质工程的基本步骤和改造方法,3.1 蛋白质工程研究的基本步骤3.
6、2 蛋白质改造方法,3.1 蛋白质工程研究的基本步骤,分离纯化目的蛋白，使之结晶并作X晶体衍射分析，结合核磁共振等其他方法的分析结果，得到其空间结构的尽可能多的信息。对目的蛋白的功能作详尽的研究，确定它的功能域。通过对蛋白质的一级结构、空间结构和功能之间的相互关系的分析，找出关键的基团和结构。在蛋白质结构与功能研究的基础上，借助于计算机图像显示和分子辅助设计，提出对目的蛋白分子的改建或构建方案，并用基因工程的方法去实施。对经过改造的蛋白质进行功能性测定，看看改造的效果如何。,蛋白质工程的程序,3.2 蛋白质改造方法,3.2.1 天然蛋白质的改造3.2.1.1 基因的定向诱变技术3.2.1.2
7、结构域的拼接,3.2.1.1 基因的定向诱变技术,一般，含有单一或少数几个突变位点的基因定向改变可以采用M13-DNA寡聚核苷酸介导诱变技术、寡核苷酸介导的PCR诱变技术、随机诱变技术和盒式突变技术。,（1）M13-DNA寡聚核苷酸介导诱变技术,.将要改造的蛋白质的目的基因插入到M13单链DNA中,作为模板，以含有要改变的碱基的一段寡聚核苷酸作为引物，在体外用DNA聚合酶进行双链DNA的合成，用DNA连接酶连接成环状,将杂合DNA双链再转入大肠杆菌中,将含突变目的基因的M13噬菌体筛选出来，提取它们的DNA，用限制性内切酶把突变目的基因切下，并重组到表达质粒中,（2）寡核苷酸介导的PCR诱变技
8、术,将目的基因克隆到质粒载体上,设计两对引物,由于两个反应物中引物的位置不同，PCR扩增后，产物有不同的末端,将两管PCR产物混合、变性、复性、退火，形成有两个切口的环状DNA，转入大肠杆菌。,（3）随机诱变技术,将待突变基因克隆到质粒上，使基因旁有两个特殊的限制性酶切位点,用大肠杆菌核酸外切酶EIII从3-凹陷端降解DNA,用修复后的质粒转化大肠杆菌,大肠杆菌DNA聚合酶的Klenow片段是完整的DNA聚合酶的一个片段，只有在53聚合酶活性和35外切酶活性，失去了53外切酶活性,反应一段时间后终止反应，再用Klenow片段补平,（4）盒式突变技术,在目标基因中选择合适的限制性内切酶位点,用含
9、有突变序列的DNA片段来置换目标基因上的一段DNA序列,产生突变序列被集中在目标基因的一个特定区域的突变家族,产生突变序列被集中在目标基因的一个特定区域的突变家族,进行盒式突变，需要解决两个关键问题：一个是在目标基因序列中，要有适当的限制性内切酶识别位点，使得用以取代天然DNA序列的盒式突变序列可以有效地插入到目标基因中。另一个是，如何得到各种合适的、用以取代目标基因中特定DNA片段的突变DNA片段。值得注意的是，突变序列的两端必须分别具有与目标基因上相匹配的的限制性内切酶识别位点。,盒式突变技术的实际应用：加酶洗衣粉是人们日常生活中常用的东西，在洗衣粉中常加入的酶是枯草杆菌蛋白酶。枯草杆菌蛋
10、白酶有一个弱点，一遇到漂白剂，就会被破坏而失去活性。枯草杆菌酶氧化失活的原因是由于第222位的甲硫氨酸的被氧化造成的，但还不知道哪一种氨基酸替换甲硫氨酸能维持酶的活性，并同时使它具有抗氧化的特性。使用盒式突变技术，1985年发现只有半光氨酸取代的突变酶活力比原酶提高138%，并可在过氧化氢（一种氧化剂）存在小时不丢失酶活力。这样就制成了合乎需要的漂白加酶洗衣粉了。,3.2.1.2 结构域的拼接,结构域是蛋白质构象中二级结构与三级结构之间的一个层次。在较大的蛋白质分子中，由于多肽链上相邻的超二级结构紧密联系，形成二个或多个在空间上可以明显区别它与蛋白质亚基结构的区别。结构域拼接是通过基因操作把位
11、于两种不同蛋白质上的几个结构域连接在一起，形成融合蛋白，它兼有原来两种蛋白的性质。,金属硫蛋白是一类小分子量的球蛋白，哺乳动物中的金属硫蛋白分子由61个氨基酸残基组成，分为两个结构域，分别叫结构域和结构域。结构域能结合4个金属离子，趋向于与镉和汞结合；而结构域能结合3个金属离子，趋向于与锌和铜结合。实验表明，结构域结合镉的能力比结构域高出1000倍以上。用计算机分子模型软件对金属硫蛋白的空间结构进行分析表明，天然金属硫蛋白的两个结构域之间具有较大的独立性，是可以拆分和构建的，因而构建结构域的“二倍体”的设想是可行的。用化学合成的方法分别合成结构域和连接肽段的基因，并设法将它们拼接起来。再插入载
12、体并转入植物细胞中，使金属硫蛋白的结构域多倍体基因在植物中表达。,3.2.2 合成全新蛋白质,基于天然蛋白质结构改造的蛋白质工程可以优化蛋白质的活性，而全新蛋白质设计是合成具有新奇的结构与功能的新蛋白质。,从头设计一个蛋白质的基本步骤：,构建一个多肽链骨架模型,从已知三维结构的数据库中挑选出一个合适的片段，进行修改和组合,依据氨基酸残基的统计学数据和排列的优先顺序，确定每个残基位置上的氨基酸,优化目标蛋白的三维模型,检验和考核所给定的目标蛋白质结构是否合理，对所设计的模型做进一步修正,几轮的设计、检验和再设计，获得一个正确折叠和带有人们预期功能的目标蛋白质,内容,一、蛋白质的功能与结构二、蛋白
13、质工程的诞生三、蛋白质工程的基本步骤和改造方法四、蛋白质工程在食品产业中的应用,四、蛋白质工程在食品产业中的应用,在实际生产中，可以应用蛋白质工程对一些生产中重要酶或蛋白质性质加以改造，提高现有酶或蛋白质的工业实用性，如提高酶的热稳定性、改变酶的最适pH值条件、提高酶的催化活性等。例如，通过引入二硫键，改善酶的热稳定性。,溶菌酶是一种广泛应用于食品工业的酶制剂，其催化速率随温度升高而升高，因此，它的热稳定性是提高其应用潜力的重要标准。蛋白质晶体结构研究表明，T4溶菌酶分子的一个重要特性是在第97位和54位残基上是两个未形成二硫键的半胱氨酸，所以，设想通过在分子中增加一对或数对二硫键，来提高酶热稳定性。研究表明，采用定位突变技术使该菌肽链第9位和第164位氨基酸残基转变为半胱氨酸，并形成一对二硫键，获得的突变体的酶活性高于天然酶6%，熔点温度提高6.4度，显然，新引入的“工程二硫键”能够稳定两个结构域之间的相对位置，进而稳定了由两个结构域所形成的活性中心。,思考题,1.什么是蛋白质工程？它与基因工程有何关联？2.什么是定位突变技术？它包括哪些常用方法？,
