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1、感染性疾病病原体快速诊断,Wenen LIU,2,概 述,感染性疾病：由某种病原体所致，通过不同方式引起人体发生感染并出现临床症状的疾病,主要表现为发热。病原体：细菌（含TB）、支原体、衣原体 病毒 真菌 原虫等,Wenen LIU,3,感染的诊断依据,临床表现：感染的全身中毒症状：畏寒、发热、皮疹等实验室常规检查：血常规：WBC、DC影像学检查：X-RAY、B超病原学检查：染色、培养血清学检查：抗原或抗体检测,危重病人：临床表现、WBC+DC 不典型,Wenen LIU,4,感染的分类,按病原学分类细菌感染（包括结核）真菌感染病毒感染支原体、衣原体按部位分类局部感染全身感染,Wenen LI
2、U,5,临床希望第一时间知道的信息,感染或非感染细菌感染或非细菌感染是结核感染或普通细菌感染酵母样真菌感染或丝状真菌感染白色假丝酵母或其他念珠菌感染曲菌感染或毛霉菌感染因为上述感染治疗方法不同,Wenen LIU,6,感染标志物,细菌感染标志物白细胞计数与分类血沉C-反应蛋白（CRP）白介素-6降钙素元内毒素真菌感染标志物:G试验、GM试验结核感染证据：夹层杯、T-SPOT,Wenen LIU,7,内容提要,临床常见细菌感染快速诊断技术,结核分枝杆菌的快速诊断技术,1,2,3,临床常见真菌的快速诊断技术,Wenen LIU,8,临床常见细菌感染快速诊断技术,降钙素原检测,内毒素检测,分子诊断,
3、Wenen LIU,9,降钙素原(Procalcitonin PCT),降钙素原是正常人血清中存在的含116个氨基酸组成的糖蛋白，最初由甲状腺细胞产生，血清水平很低。在非感染或病毒性感染疾病时保持非常低的血清水平，在细菌性感染时含量升高，并与感染程度和预后呈正相关。PCT含量的变化稳定，并出现在疾病的早期（3-4h）。短半衰期(24h)国外把 PCT作为最敏感的感染标志。正常血清水平:100-150pg/ml,Wenen LIU,10,降钙素原 PCT:分子结构,血清降钙素(CT)的前肽物质分子量：14.5 kDa由116个氨基酸组成的糖蛋白质无激素活性,11号染色体上的单拷贝基因,转录,甲状
4、腺滤泡细胞,降钙素原前体,内源多肽酶,降钙素原 PCT,分解,细胞内特殊蛋白酶,正常情况下,降钙素,Wenen LIU,11,Linscheid P,et al Crit Care Med 04;32:1715-21Endocrinology 03;144:5578-84 146:2699-708,在病毒感染时，大量产生的IFN-，将会抑制PCT的激活及产生.因此，病毒感染时，PCT的浓度将会保持在较低的水平,),IL-6,IL-6,Wenen LIU,12,细菌感染后PCT快速升高,Kinetics of procalcitonin in iatrogenic sepsis Brunkhor
5、st F.M et al,Intens Care Med 1998,24:888-892,Wenen LIU,13,PCT来源,Left Lane:正常组,在不存在感染的情况下，甲状腺外CALCI表达被抑制，而主要局限于甲状腺和肺的神经内分泌细胞有一定程度的表达Right Lane:脓毒症组,在细菌感染时可诱导全身各种组织多种类型细胞CALCI表达和PCT连续性释放,Wenen LIU,14,PCT动力学,2-3h开始增加；6-8h快速升高；12h-48到达峰值；2-3d 正常血浆浓度在0.05ng/ml-1000ng/ml半衰为15-20h左右,且不受肾功能影响,Wenen LIU,15,P
6、CT检测方法,快速半定量法（PCT-Q）全自动快速定量法（VIDAS),Wenen LIU,16,快速半定量法（PCT-Q）,样本：200l血清/血浆结果：30min,同胶体金免疫层析法，即在标准品上结合有胶体金的小鼠单克隆抗降钙素抗体和绵羊多克隆抗降钙素抗体，待检标本加上后，示踪元素即与标本中的PCT结合，形成一个“三明治式”的复合物，然后通过发光比色判断PCT浓度当PCT浓度0.5g/ml时，夹心复合物呈红色带，颜色深浅与样品中的PCT浓度成正比例，未结合的示踪物扩散到对照区，结合并产生了红色的对照带。,Wenen LIU,17,全自动快速定量法,仪器：法国梅里埃公司VIDAS全自动酶联荧
7、光分析仪及配套试剂标本要求：静脉抗凝血注意无菌操作，使用新鲜标本，如果4小时内不使用，应将标本放置-20保存。血浆中的PCT非常稳定，收集标本24h后，PCT浓度在室温下大约下降12，在4大约下降6,Wenen LIU,18,PCT用于细菌感染和脓毒症诊断是一种非常有价值的标志物,细菌感染/脓毒症诊断及严重程度判断 脓毒症治疗效果监测及预后评估 抗生素的有效管理,Wenen LIU,19,细菌感染诊断及严重程度判断,脓毒性休克,严重脓毒症,系统性感染(脓毒症),局部感染,正常值,PCT的浓度随感染的扩散和感染严重程度的加重而升高,Wenen LIU,20,脓毒症患者治疗效果及预后监测,(n=1
8、09),F.Stber,University Bonn,Lecture at ISICEM,Brussels 2001,通过PCT不断在体内衰减，反映出抗生素治疗策略的成功,随着患者对抗生素治疗的响应，引起了PCT血中浓度水平的典型变化过程,AB-antibiotics,Wenen LIU,21,抗生素有效管理,Wenen LIU,22,PCT的临床应用,急诊住院病房外科手术血液科内科ICU外科ICU儿科急诊儿科病房儿科ICU新生儿科,严重细菌感染或脓毒症的检测（鉴别诊断）疾病或治疗反应的监测局部与全身性感染脓毒症的诊断和监测新生儿脓毒症的检测,Wenen LIU,23,生理性一过性峰值创伤后
9、炎症综合症:多发性创伤,大面积烧伤,大手术后(心脏,移植,腹部)使用致炎细胞因子治疗后(OKT3,注射 TNF,IL-2,抗淋巴细胞球蛋白)某些肿瘤(甲状腺髓样细胞癌,肺小细胞癌和支气管癌)长时间循环衰竭(心源性休克,出血性休克,热休克),PCT水平增加但没有系统细菌感染的几种情况,Wenen LIU,24,感染早期(-6-12 小时后重复检测!)亚急性心内膜炎局部感染,细菌感染而PCT不升高的情况,Wenen LIU,25,对PCT检测的影响,受以下因素影响*甲状腺功能 是功能性甲状腺髓样癌的肿瘤标志物*肾功能 严重肾功能受损者中水平较高不受以下因素影响*类固醇药物*自身免疫性疾病*年龄、性
10、別*免疫功能低下状态:肝硬化、HIV感染,Wenen LIU,26,细菌内毒素,Wenen LIU,27,Wenen LIU,28,细菌内毒素检测,原理：仪器检测试管内反应物的光密度OD值，取当OD上升到0.02的点的时间作为反应时间，该点在反应曲线上的位置为浊度开始快速变化的时期，该取值能够快速、稳定的获得反应时间，从而判断内毒素的含量,动态浊度法,Wenen LIU,29,仪器和试剂,BET-24A细菌内毒素分析仪 MB-80微生物快速动态监测系统,Wenen LIU,30,标本要求,患者早上尚未进行药物静脉治疗时:MB-80：“无热源真空采血管”,静脉抗凝血，采血量2-4ml，30min
11、内送检BET-24A：抽取1mL静脉抗凝血，配1mL1号处理液其它体液如脑脊液胸腹水与血标本要求相同。注意无菌操作,Wenen LIU,31,内毒素活性定量检测意义,G-所致脓毒症早期鉴别诊断指导抗生素正确使用判定抗感染治疗效果帮助判断患者的预后,Wenen LIU,32,内毒素定量检测的适应症,各种急、慢性病理性发热患者各种类型“中重度感染、肝病、休克、肠道疾病、脏器功能衰竭、大手术术后”患者慢性疾病长期卧床、免疫力低下患者急诊及ICU病房收治的生命体征不稳定的患者,Wenen LIU,33,分子诊断技术检测致病菌,PCR技术扩增16srRNA基因鉴定常见致病菌,革兰阳性球菌,革兰阴性杆菌,
12、mecA基因,VanA/VanB基因,PBP2b基因,PCR扩增耐药基因特异性基因,ESBLs基因,AmpC基因,碳青霉烯酶基因,mecA：耐甲氧西林葡萄球菌属（MRS）特异性基因Van A VanB：耐万古霉素肠球菌（VRA）特异性基因PBP2b：青霉素不敏感肺炎链球菌（pNSSp）特异性基因ESBLs基因：主要包括TEM、SHV、CTX-M、OXAAmpC基因包括质粒介导型和染色体诱导型。其中前者主要包括MOX、CMY、DHA、ACC、ACT、FOX等亚型，后者主要包括：ADC。碳青霉烯酶基因：A类酶，以KPC为代表；金属酶，以IMP、VIM、NDM为代表；D类酶，以OXA-23、OXA-
13、24、OXA-51和OXA-48为主。,Wenen LIU,34,16S rRNA具有多拷贝多信息的特点,Wenen LIU,35,结核分枝杆菌的快速诊断,是引起结核病的病原菌。它可侵犯全身各器官，但以肺结核为最多见。结核病至今仍为重要的传染病。估计世界人口中1/3感染结核分枝杆菌。结核分枝杆菌生长缓慢，一般需2-4周长成肉眼可见的落菌。抗酸染色法是检测TB的传统方法，但存在假阳性因此，快速诊断对TB至关重要。,Wenen LIU,36,结核感染现状,全球范围内结核病疫情急剧恶化结核病与艾滋病同时流行结核菌耐药现象益发严重人口大规模流动我国是世界上仅低于印度的第二结核病大国结核菌感染率44.5
14、%新发活动性结核患者130万/年死亡13万/年早期快速诊断与治疗成为制约结核病控制的关键常规实验室诊断结核病方法阳性率不到60%,Wenen LIU,37,全球结核疫情,Wenen LIU,38,结核检测方法,一、现有实验室常规检测技术细菌学诊断 涂片、培养免疫学诊断 抗原、抗体胶体金分子生物学诊断 PCR二、其它检测技术PPD（TST）实验影像学检查,Wenen LIU,39,结核分枝杆菌的快速诊断,Wenen LIU,40,结核夹层杯技术,原理：通过专用消化灭活液消化组织细胞和粘蛋白等，将结核杆菌裸露出来，并结合高速震荡，使痰标本充分液化而有利于其中的抗酸杆菌沉淀于特制彭氏杯底部的菌膜上，
15、在夹层杯中直接抗酸染色、干燥，并用取片针顶出内底，经封片等步骤后，镜下检测抗酸杆菌。,Wenen LIU,41,检测流程示意图,Wenen LIU,42,镜下比较,图2.夹层杯法（新方法）：菌量多，背景清晰，易于观察,图1.直接涂片法（传统方法）：菌量少，背景不清晰,Wenen LIU,43,夹层杯诊断技术的优点,阳性率高,背景清晰，易于观察,易于标准化,检测速度快,生物安全性好,夹层杯诊断技术的优点,Wenen LIU,44,结核夹层杯技术,标本要求：（1）痰液要求新鲜，留取清晨深咳出的第一口痰液，留痰时，患者以清水漱口次，然后用力咳出气管深处的痰（2）用氢氧化钠处理完全。临床应用：用于结核
16、分枝杆菌的初筛,Wenen LIU,45,结核感染T细胞检测技术,是以ELISPOT技术 检测结核感染的新方法，ELISPOT是近20 年发展起来的检测抗原特异性T细胞的技术，是目前最敏感的检测抗原特异性T细胞的方法之一。,Wenen LIU,46,原 理,结核感染的免疫应答反应以细胞免疫为主，作为免疫应答的一部分，T细胞受结核抗原刺激致敏，形成活化的效应T细胞，包括CD4和CD8。结核杆菌感染者外周血单核细胞中存在结核特异的活化T淋巴细胞，这些淋巴细胞在体外再次受到结核杆菌特异抗原刺激后分泌-干扰素，通过检测 体外分泌的IFN-来诊断是否存在结核感染。,Wenen LIU,47,活动性结核与
17、潜伏感染,接触活动性结核病患者,暴露程度不足，结核杆菌被机体免疫力清除,没有症状,结核杆菌仍旧存在而不能被发现 X-光/CT 扫描显示正常没有抗体应答诊断困难传统的结核感染检测只有 TST（PPD）,机体被感染,受机体免疫力抑制没有临床症状,终身处于感染状态,潜伏感染,有临床症状具有传染性,结核杆菌可以通过涂片、培养检测出胸部的 X-光或 CT 扫描显示异常 肺外结核难以诊断(特别是儿童),活动性结核,5%,5%,再次激活,Wenen LIU,48,活动性结核与潜伏感染,新发TB病例来自潜伏性结核感染人群潜伏性结核感染（hidden epidemic）人群数量巨大“定时炸弹”若想控制活动性TB
18、，必须先控制潜伏性结核感染鉴别高危人群预防性治疗免疫接种,活动性TB 每年900万新发病例 仅为冰山一角,Latent TB-“hidden epidemic”-2 billion people infected,Wenen LIU,49,结核感染T细胞检测,Wenen LIU,50,-干扰素释放实验（IGRA，interferon-gamma release assay）酶联免疫斑点技术（ELISPOT，Enzyme-Linked ImmunoSpot assay）结核杆菌特异抗原 早期抗原靶6（ESAT-6）early secreted antigenic target 6 培养滤液蛋白1
19、0（CFP 10）culture filtrate protein 10）,技 术 背 景,Wenen LIU,51,结核感染者体内存在特异的效应T淋巴细胞，效应T淋巴细胞再次受到结核抗原刺激时会分泌多种细胞因子（IFN-）。因此，检测效应T淋巴细胞可用于结核病或结核潜伏感染者的诊断。由于效应T细胞存活时间很短，而且具有特异性，因此可以作为机体是否正处于被感染的指标，无论是否有临床症状。基于IGRA原理的检测项目目前已被美国、加拿大、英国、德国、意大利、瑞士、法国、荷兰、日本等二十余个国家写入本国的结核诊疗指南中,-干扰素释放实验（IGRA）,Wenen LIU,52,酶联免疫斑点技术（ELI
20、SPOT）,Wenen LIU,53,酶联免疫斑点技术（ELISPOT）,近二十多年来，随着技术改良，ELISPOT 分析技术已经是当世公认的最灵敏的抗原特定T细胞的体外检测技术结合了细胞培养技术与酶联免疫吸附技术（即ELISA 技术），能够在单细胞水平检测细胞因子的分泌情况，灵敏度高。其技术原理，可一句话概括为：用抗体捕获培养中细胞所分泌的细胞因子，并以酶联斑点显色方式将其表现出来（Sedgwick JD 2005）。,Wenen LIU,54,结核杆菌特异抗原,ESAT-6与CFP10抗原,由结核杆菌基因组RD1区相同的操纵子编码的蛋白所有的卡介苗（BCG）均丢失该基因序列绝大多数的环境分
21、枝杆菌也不存在RD1区,Wenen LIU,55,操作步骤,Wenen LIU,56,操作步骤,孵育1小时,Wenen LIU,57,实 际 效 果 图,阴性结果,阳性结果,空白对照抗原 AESAT-6抗原 BCFP10阳性对照（PHA）,Wenen LIU,58,T-SPOT.TB 特点,特异性好，不受卡介苗（BCG）接种和环境分枝杆菌影响灵敏度高，在免疫力低下/受抑制人群中有很高的检出率快速，24小时报告结果,Wenen LIU,59,写入诊疗指南的国家（Guidelines）,美国（CDC和儿科学会）；加拿大（加拿大结核病委员会）；巴西（卫生部）英国（国家卫生和临床协会）；法国（国家卫生
22、局）；西班牙（西班牙肺病和胸部手术协会）；德国（德国抗结核病中央委员会）；意大利；瑞士（瑞士肺科协会）；荷兰（实用结核病控制委员会）；丹麦（丹麦肺部医学会）；挪威（挪威公共卫生协会）；芬兰（国家卫生和福利协会）；爱尔兰（国家结核病咨询委员会）；葡萄牙；捷克共和国；斯洛伐克；波兰；保加利亚；克罗地亚澳大利亚（国家结核病咨询委员会、传染病协会和澳大利亚风湿病协会）；沙特阿拉伯；南朝鲜；日本（日本结核病预防协会）WHO和ECDC 中国（专家组推荐）,Wenen LIU,60,1、结核病辅助诊断/疗效评价“菌阴”结核病患者的辅助诊断肺外结核的鉴别诊断抗痨治疗的疗效评价2、免疫力低下/受抑制患者的结核诊
23、断/感染筛查使用生物制剂/免疫抑制剂患者的结核感染筛查HIV感染者/肾透析患者/器官移植患者3、儿童结核病的辅助诊断4、结核密切接触者/高危人群的结核感染筛查结核病患者的家属/医务工作者/监狱囚犯5、接触追踪,临床应用,Wenen LIU,61,结核相关疾病,肺结核菌阳（痰涂片、痰培养）-结核专科医院菌阴-感染科、呼吸科、胸外科、结核科肺外结核淋巴结结核-外科、血液科、感染科结核性胸膜炎-感染科、呼吸科、结核科结核性腹膜炎-外科、消化科、感染科结核性脑膜炎-感染科、神经科骨关节结核-骨科、风湿科、感染科泌尿生殖系统结核-泌尿外科、肾脏科、感染科、性病科其他：如结核性心包炎、脾结核、胰腺结核等,
24、Wenen LIU,62,评 价,不能够提示临床患者的病变部位不能够根据斑点数量的多少来判断受试者是活动性结核病患者或是潜伏感染者儿童结核的辅助诊断，需要结合临床,Wenen LIU,63,基因诊断TB,特异性位点：1.rRNA基因：高度保守，主要包括23S、16S及5S基因。其中最为常用的是16SrRNA基因。2.插入序列：IS6110和IS1081。3.蛋白编码的基因：65KD热休克蛋白基因(hsp65)、32KD蛋白基因、DnaJ蛋白基因、RNA聚合酶B(rpoB)和MPB64蛋白基因(mpb64）等。基因诊断的意义主要表现在：a.区分TB与其它分枝杆菌；b.检测TB耐药基因；c.提高T
25、B的阳性检出率。,Wenen LIU,64,TB分子分型技术,IS6110-RFLP（插入序列6110限制性片段长度多态性分析）方法目前依然被认为是结核分枝杆菌基因分型的“金标准”。直接重复片段及寡核苷酸多态性分型可变数目串联重复序列及MLVA分型单核苷酸多态性和MLST分型,Wenen LIU,65,多重耐药结核分枝杆菌检测,结核杆菌产生耐药性主要是由不合理用药引起的结核杆菌内抗结核药物作用靶基因突变所致。药敏试验周期长，因此检测耐药基因成为近年来的研究热点。耐药检测包括用PCR扩增基因组内携带的耐药性区域，和进行扩增产物的突变分析。结核分支杆菌耐药性的基因检测技术分为杂交系统和放大系统两大
26、部分。多数放大系统基于杂交系统，其另一部分是PCR 扩增技术。,Wenen LIU,66,临床常见真菌的快速诊断,Wenen LIU,67,1.1,3-D-葡聚糖-G试验,1，3-D-葡聚糖是酵母和丝状真菌细胞壁的多聚糖成分，以假丝酵母菌属含量最高，而其他微生物动物及人的细胞成分和细胞外液都不含这种成分。因此，血液及无菌体液中检出1，3-D-葡聚糖在很大程度上可以视为IFI 的标志，如念珠菌、曲霉、镰刀霉、酵母和丝孢酵母感染等。目前的检测方法为G试验，其 原 理 是 1，3-D-葡聚糖有特异性激活鲎变形细胞裂解物中的G因子引 起裂解物凝固，故称为G试验。国内已经使用微生物快速动态检测系统检测。
27、,Wenen LIU,68,标本要求,采样过程要求无菌操作常规病人早上用药治疗前空腹采血取样（血透患者透析前采血）标本类型：抗凝静脉血，使用无热原真空采血管采血量：2-3ml，立即混匀半小时内送检。实验前未打开标本在2-8可保存5天。打开后标本需在48小时内完成检测。如需长时间储存，存储温度应为-70。血清标本最多可冻融四次。解冻标本检测之前要充分混匀,Wenen LIU,69,G试验的临床意义,早期、快速诊断侵袭性真菌感染可用于真菌感染早期筛查，适用于念珠菌、曲霉、肺孢子菌、镰刀菌、地霉、组织胞浆菌和毛孢子菌等，不能用于检测隐球菌和接合菌感染。对真菌感染症状进行诊断，阳性结果代表存在侵袭性真
28、菌感染,Wenen LIU,70,2.半乳甘露聚糖(GM),半乳甘露聚糖(GM)是一种对热稳定的水溶性的物质，是广泛存在于曲霉和青霉细胞壁中的一类多糖。一般在曲霉感染者出现临床症状和影像学检查异常前数天，其体内循环中GM 即可呈阳性表达，其灵敏度和特异度均可达到80%以上。原理：是一种微孔板双抗体夹心法，采用小鼠单克隆抗体EBA-2，检测人血清中的曲霉菌半乳甘露聚糖。,Wenen LIU,71,标本要求,标本采集：静脉采血5ml（红帽管）。检测标本：血清标本，密封，无菌操作。实验前未打开标本在2-8可保存5天。打开后标本需在48小时内完成检测。如需长时间储存，存储温度应为-70。血清标本最多可
29、冻融四次。解冻标本检测之前要充分混匀20mg/L胆红素，或2g/L甘油三酯的脂血，或165mg/L血红蛋白的溶血标本不影响检测结果,Wenen LIU,72,GM试验临床意义,1.诊断侵袭性真菌感染2.血清GM检测能区分侵袭性肺曲霉感染与白色假丝酵母菌、毛霉、肺炎链球菌感染和烟曲霉口咽定植。但不能区分曲霉菌种。3.评价疗效的可靠指标,Wenen LIU,73,G试验和GM试验提高对IFI 的诊断。阳性预测值可达100%。,Wenen LIU,74,3.念珠菌表面抗原,甘露聚糖(Mannan):念珠菌表面抗原热不稳定蛋白用LA方法,Wenen LIU,75,4.新生隐球菌,新生隐球菌循环夹膜抗原
30、是新生隐球菌病,尤其是新生隐球菌脑膜炎的诊断手段.乳胶法:5min即可出结果,特异性达90-100%,可检测35ng/ul的抗原ELISA:敏感性高于LA(乳胶凝集),可检测6ng/ul,Wenen LIU,76,分子生物学技术,PNA-FISHfluorescent in situ hybridization(FISH)using a set of peptide nucleic acid probes(PNA)：用来快速检测和鉴定血培养阳性的白念珠菌/近平滑念珠菌、热带念珠菌及光滑念珠菌/克柔念珠菌，将可能对氟康唑敏感或耐药的菌种区分开来。实时PCR检测：使用物种特异性探针或对直接来源于阳
31、性血培养基的物种基因扩增后的解链温度进行分析。,Wenen LIU,77,真菌快速诊断方法,血清学：1-3-D葡聚糖：诊断是否真菌感染，但不能区别是曲菌或酵母样真菌甘露聚糖：诊断是否念珠菌感染半乳-甘露聚糖：诊断是否曲霉菌感染循环夹膜抗原：诊断是否新生隐球菌分子生物学,总 结,临床常见细菌感染快速诊断技术,结核分枝杆菌的快速诊断技术,1,2,3,临床常见真菌的快速诊断技术,Wenen LIU,79,总 结,常规检测方法：微生物学方法速度慢，受敏感性、特异性限制，不易早期诊断，并且不易提供病原体分型方面的信息。免疫学方法和分子生物学方法：早期、快速特异地进行诊断。为临床提供快速服务。,多种方法联合可提高感染性疾病病原学诊断！,Wenen LIU,80,谢 谢,
