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1、2010年暑假中学骨干教师培训 基因工程和细胞工程,生物材料,DNA,mRNA,一定大小范围DNA,PCR,cDNA（互补DNA）,反转录,基因组文库 cDNA文库,基因文库,包括,人工合成,限制酶切割,获取目的基因,构建表达载体,导入受体细胞,得到转基因生物,目的基因检测与鉴定,第一步,第二步,第三步,第四步,基因工程的基本操作程序,获取目的基因,生物材料,PCR,cDNA,mRNA,DNA,基因组文库,cDNA文库,一定大小范围DNA,人工合成,逆转录,限制酶切割,获取目的基因,构建表达载体,导入受体细胞,得到转基因生物,目的基因检测与鉴定,第一步,第二步,第三步,第四步,基因文库(gen
2、e library)概念,又称DNA文库，是指某个生物的基因组DNA或cDNA片段与适当的载体在体外重组后，转化宿主细胞，通过筛选后得到大量的阳性菌落(或噬菌体)，所有菌落或噬菌体的集合即为该生物的基因文库。基因文库由外源DNA片段、载体和宿主细胞组成。,mRNA 结构图,DNA 结构图,基因组文库(Genomic library),将某种生物体的全部基因组DNA用限制性内切酶或机械力量切割成一定长度范围的DNA片段，再与合适的载体在体外重组并转化相应的宿主细胞获得的所有阳性菌落。该文库以DNA片段的形式贮存着该生物全部基因组的信息，可用于分离目的基因和保存某种生物的全部基因。,基因组文库,c
3、DNA文库(cDNA library),提取某生物组织或发育时期的总mRNA，经反转录产生的cDNA片段分别与克隆载体重组，储存于受体菌中，该群体就称该生物基因组的cDNA文库。cDNA(complementary DNA，互补DNA)：是由生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内的mRNA经体外反转录后形成的互补DNA。,结构基因,外显子,内含子,转录、加工修饰,mRNA,cDNA文库,反转录酶,cDNA,克隆、转化、培养、鉴定,构建基因文库的基本程序,1)提取研究对象基因组DNA，制备合适大小的DNA片段，或提取组织或器官的mRNA并反转录成cDNA；2)DNA片段或cDNA片段与经特殊处理
4、的载体连接形成重组DNA；3)重组DNA转化宿主细胞或体外包装后侵染受体菌；4)阳性重组菌落或噬菌斑的筛选。,基因组DNA文库,cDNA文库,基因组文库的类型,根据所选用的载体可以分为：质粒文库、噬菌体文库、人工染色体文库（细菌人工染色体文库、酵母人工染色体文库）。,基因组文库的质量标准,一个理想的基因组文库应具备下列条件：重组克隆的总数不宜过大，以减轻筛选工作的压力；载体的装载量最好大于基因的长度，避免基因被分隔克隆；克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域，以利于克隆排序；克隆片段易于从载体分子上完整卸下；重组克隆能稳定保存、扩增、筛选。,cDNA文库的主要优点,cDNA文库特别适用于某些
5、RNA病毒的基因组结构研究及有关基因的克隆分离；cDNA文库较小，易于筛选；cDNA文库可用于在细菌中表达真核生物的基因；cDNA文库结合基因组文库可用于真核细胞mRNA的结构和功能研究。,cDNA克隆的主要的缺点,cDNA文库所包含的遗传信息远少于基因组DNA文库，并且受细胞来源或发育时期的影响；cDNA文库不能直接获得基因内含子序列和基因编码区外大量调控序列的结构与功能方面信息；在cDNA文库中，高丰度mRNA的cDNA克隆所占的比例比较高，分离起来比较容易，而低丰度mRNA的cDNA克隆所占的比例则比较低，因此分离也就比较困难。,从基因文库中筛选目的基因,1.通过克隆序列筛选：核酸杂交(
6、探针）和PCR（引物）2.通过表达产物筛选：免疫学检测（抗原抗体反应）,探针,探针是一小段带标记的单链DNA或者RNA片段（大约是20到500bp），用于检测与其互补的核酸序列。最初是使用带放射性的DNA探针，通过放射自显影来显示位置。后来又发明了免疫探针法，将探针核苷酸的侧链加以改造，探针杂交后，其侧链可被带有荧光标记的抗体所识别，从而显示出位置。,菌落原位杂交法（核酸杂交）,直接把菌落印迹转移到硝酸纤维素滤膜上,经溶菌和变性处理后使DNA暴露出来并与滤膜原位结合,再与特异性DNA探针杂交,筛选出含有目的序列的菌落。,对应的菌斑或噬菌斑位置不变，可以直接找出阳性菌落。,特点：,PCR筛选法,
7、利用合适的引物，以从初选出来的阳性克隆中提出的质粒为模板进行PCR，通过对PCR产物的电泳分析，确定目的基因序列所在克隆。,免疫筛选法,放射性抗体检测法,滤膜（固定抗体）,+,免疫沉淀检测法,菌落,沉淀素,高等生物的基因组DNA十分复杂,单个基因在基因组或某个特定发育阶段或特定组织中所占比例很小。因此，要想从庞大的基因组中分离某个特定的未知基因非常困难，因此先把材料DNA分成若干易于处理的片段，然后确定目标序列在哪一片段，再进一步从该片段寻找目标序列，事情就变得容易了。,为什么要建基因文库？,PCR法获取目的基因,已知基因：设计合成一对引物，直接从基因组DNA（或文库）中扩增该目的基因。未知基
8、因：参照其他物种中该基因的两末端设计引物，从基因组DNA（或文库）中扩增该目的基因；依照其他物种中该基因的保守区段序列设计引物，扩增出一段DNA，标记为探针，从基因组文库、cDNA文库中钓出该基因。PCR法获取目的基因的前提是：要有足够制备合适引物的信息,PCR法获取目的基因优点,1.简便快速：在有足够引物信息的情况下，可直接从基因组DNA中克隆目的基因，大大减少了基因分离的工作量；2.灵敏度高：可从极微量的模板扩增出目的片段；3.对起始材料质量要求低：由于其灵敏度高和特异性强，极微量的材料或者混合的组织、部分已降解的DNA材料都可以作为起始材料；4.也可用于基因文库的构建。,化学合成制备目的
9、基因,磷酸二酯法亚磷酸三酯法,获取目的基因的方法,一般来说：目的基因的获得通常采用PCR法；化学合成法由于合成的片段较短，一般用于引物和探针的合成；基因文库一般用于保存基因资源。,目的基因检测与鉴定,通常采用分子杂交的方法。分子杂交：采用已知标记的核酸分子或蛋白质分子检测混合样品中未知核酸分子或蛋白质分子。根据其检测对象的不同可分为 Southern 杂交（DNA）、Northern 杂交（RNA）和 Western 杂交（蛋白质）。,分子杂交可在DNA与DNA、RNA与RNA或RNA与DNA的二条单链之间进行，也可以在蛋白质与蛋白质之间进行。核酸分子杂交是指核酸分子(DNA或RNA)在变性以
10、后，在复性的过程中两个不同来源的且同源的核酸分子形成杂合双链的过程。蛋白质之间的杂交通过抗原抗体反应进行。,通常通过各种方法将核酸（蛋白质）分子固定在固相支持物上，然后用放射性元素等标记的探针（抗体）与被固定的分子杂交，经显影（显色）后显示出目的核酸（蛋白质）分子。,Southern杂交的操作步骤,(1)酶切DNA，凝胶电泳分离各酶切片段,然后使DNA原位变性。(2)将DNA片段转移到固体支持物(硝酸纤维素滤膜或尼龙膜)上。(3)预杂交滤膜,掩盖滤膜上非特异性位点。(4)让探针与同源DNA片段杂交，然后漂洗除去非特异性结合的探针。(5)通过显影检查目的DNA所在的位置。,将RNA分子从电泳凝胶
11、转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，进行核酸杂交的一种实验方法。,Northern杂交,Northern杂交的过程,提取总RNA 分离mRNA，利用亲和层析的原理纯化mRNA。制备RNA探针，根据mRNA序列合成同源DNA探针，或以cDNA为探针。Northern杂交，通过显影检查目的DNA所在的位置。,Southern杂交和Northern杂交过程示意图,Western杂交,中文一般称为蛋白质印迹技术。其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳分离的细胞或生物组织蛋白样品进行检测。Western Blot与Southern杂交或Northern杂交方法类似，但Western Blot采
12、用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。,Western杂交过程,经过SDS-PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素膜）上，以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的目的蛋白。根据检测结果，从而可得知被检细胞内目的蛋白表达与否、表达量及分子量等情况。,第一步 抗体识别抗原,第二步 第二抗体识别第一抗体,第三步 颜色反应,Western杂交结果图,建立文库需要重组子的数目,N=ln(1-P)/ln(1-1/n)N：重组子数目；P：文库中包括任意
13、DNA片段的概率；n：总基因组碱基数/克隆片段碱基数。例：假如重组片段大小为20kb，要使文库包含该基因组任一片段的概率达到99%，则N大肠杆菌=ln(1-0.99)/ln(1-1/4.6/20103)=1.1103N人=ln(1-0.99)/ln(1-1/2.8/20106)=6.5105,常见载体容量,（二）细胞工程,细胞融合与单克隆抗体,细胞融合（cell fusion)，又称体细胞杂交（somatic hybridiazation），是指两个或更多个相同或不同细胞通过膜融合，形成单个细胞的过程。,细胞融合的意义,理论上说任何细胞，都有可能通过体细胞杂交而成为新的生物资源。这对于种质资源
14、的开发和利用具有深远的意义。绕开了种间生殖隔离的限制，为远缘物种间的遗传物质交换提供了有效途径。体细胞杂交产生的杂种细胞含有来自双亲的核外遗传系统，在杂种的分裂和增殖过程中双亲的叶绿体、线粒体DNA亦可发生重组，从而产生新的核外遗传系统。淋巴细胞杂交瘤和单克隆抗体的制备。,显微镜下细胞融合过程,细胞融合的常用方法,一、灭活病毒法两种细胞在一起培养，加入灭活病毒，在4条件下病毒附着在细胞膜上。并使两细胞相互凝聚；在37中，病毒与细胞膜发生反应，细胞膜受到破环，此时需要Ca2+和Mg2+，最适PH为8.0一8.2；细胞膜连接部穿通，周边连接部修复，此时需Ca2+和ATP；融合成大细胞，需ATP。,
15、二、聚乙二醇（PEG）法,PEG,PEG分子式：HOH2C（CH20CH2）nCH2OH，分子量大于200小于6000者均可用作细胞融合剂.PEG分子具有轻微的负极性，故可以与具有正极性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形成H键，从而在在质膜之间形成分子桥，其结果是使细胞质膜发生粘连进而促使质膜的融合.,PEG诱导融合的特点：其优点是融合成本低，不需特殊设备；融合子异核率较高；融合过程不受物种限制。其缺点是融合过程繁琐，PEG可能对细胞有毒害。,三、电融合法,电融合法是在直流电脉冲的诱导下，细胞膜表面的氧化还原电位发生改变，使异种细胞粘合并发生质膜瞬间破裂，进而质膜开始连接，直到闭和成完整的膜，形
16、成融合体。电融合法的优点：融合率高，重复性强，对细胞伤害小；装置精巧，方法简单，可在显微镜下观察或录像观察融合过程；免去PEG诱导后的洗涤过程，诱导过程可控性强。,细胞杂交瘤技术与单克隆抗体,抗体,由抗原刺激B淋巴细胞产生的，并能与刺激其产生的抗原发生特异性结合的、具有免疫功能的糖蛋白。,抗原决定簇,抗原分子中存在的能与抗体Fab片段特异性结合的特殊化学基团，是免疫应答特异性的物质基础。,构象决定簇与线性决定簇,单克隆抗体,定义：由单一克隆B细胞杂交瘤产生的、只识别抗原分子某一特定抗原决定簇的高度特异性的抗体。每种单克隆抗体其分子结构完全相同。,多克隆抗体,定义：抗原分子通常具有多个抗原决定簇
17、，动物免疫后可刺激多种具有相应抗原受体的B细胞发生免疫应答，因而可产生多种针对不同抗原决定簇的抗体。这些由不同B细胞克隆产生的抗体称为多克隆抗体（polycolonal antibody,PcAb）。,单克隆抗体技术的核心是用骨髓瘤细胞与经特定抗原免疫刺激的B淋巴细胞融合得到杂交瘤细胞，杂交瘤细胞既能象骨髓瘤细胞那样在体外无限增殖，又具有B淋巴细胞产生特异性抗体的能力。因此，单克隆抗体技术又称为杂交瘤技术。,骨髓瘤细胞选择,骨髓瘤细胞本身不能分泌抗体选择次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷型（HGPRT-）或胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）瘤细胞,在旁路合成途径中，HGPRT负责催化磷酸核糖焦磷
18、酸和嘌呤基形成嘌呤单磷酸核苷酸，而TK可催化胸苷转化为5-单磷酸胸苷，作为胸苷脱氧核苷酸合成的材料。,HAT选择培养基,含次黄嘌呤（H）、氨基蝶呤（A）和胸腺嘧啶核苷（T）的培养基，是动物杂交细胞筛选中最常用的方法。在这种培养基中细胞只能利用旁路途径合成DNA，因而只有具有HGPRT+或/和TK+的细胞才能生长。,细胞内DNA的合成途径,从头合成途径：以氨基酸和其他小分子起始合成核苷酸，进而合成DNA 的过程；可被叶酸类似物氨基蝶呤（A）阻断；旁路合成途径：胸腺嘧啶脱氧核苷激酶（TK）利用胸腺嘧啶核苷（T）合成DNA；次黄嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）利用次黄嘌呤（H）合成DNA。,单克隆抗
19、体的大量制备,体内法：单克隆细胞注入到小鼠腹腔培养；细胞培养：体外克隆培养.,单克隆抗体的应用,1.作为亲合层析的配体单克隆抗体能与其相应的抗原特异性结合，因而能够从复杂系统中识别出单个成分。只要得到针对某一成分的单克隆抗体，利用它作为配体，固定在层析柱上，通过亲合层析，即可从复杂的混和物中分离、纯化这一特定成分。如用抗人绒毛膜促性腺激素(hCG)亲合层析柱，就可从孕妇尿中提取到纯的hCG。与其它提取方法(沉淀法、高效疏水色谱法等)相比，具有简便、快速、经济、产品活性高等优点。,2.作为生物治疗的导向武器,将针对某一肿瘤抗原的单克隆抗体与化疗药物或放疗物质连接，利用单克隆抗体的导向作用，将化疗
20、药物或放疗物质携带至靶器官，可直接杀伤靶细胞。另外，将放射性标记物与单克隆抗体连接，注入患者体内可进行放射免疫显像，协助肿瘤的诊断。,治疗用脂质体,3.检验医学诊断试剂,单克隆抗体以其特异性强、纯度高、均一性好等优点，广泛应用于酶联免疫吸附试验、放射免疫分析、免疫组化和流式细胞仪等技术，目前，应用单克隆抗体制作的商品化试剂盒广泛应用于：病原微生物抗原、抗体的检测；肿瘤抗原的检测；免疫细胞及其亚群的检测；激素测定；细胞因子的测定。,4.作为研究抗原的探针,例如前面讲的Western blotting。,5.作为免疫抑制剂,抗人T淋巴细胞单抗(McAb)作为一种新型免疫抑制剂，已广泛应用于临床治疗自身免疫疾病和抗器官移植的排斥反应。注射抗小鼠Thy-1抗原的单抗，可以抑制小鼠同种皮肤移植的排斥反应。此外，对用于同种骨髓移植的供体骨髓，在体外经抗T细胞单抗加补体处理，能减轻移植物抗宿主病的发生。,谢谢！,
