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1、端粒酶逆转录酶活性的调节机制与抗肿瘤药物的筛选,端粒重复扩增法(telomeric repeat amplificatlon protocol，简称TRAP),什么是端粒酶？,端粒酶(telomerase)是一种细胞RNA 依赖的DNA聚合酶，其功能是维持真核细胞染色体末端端粒的长度。由高度重复的TTAGGG序列构成的端粒，具有保护染色体末端被降解以及和其他染色体连接的作用。,端粒酶的组成？,具有酶活性的端粒酶主要由两部分组成：RNA组分(hTR)含有与端粒酶重复序列结合的模板区具有逆转录酶活性的蛋白催化亚基(hTERT),hTR亚单位在大多数组织细胞中表达，而hTERT常常只在增殖的细胞中表
2、达。端粒酶的活性与hTR mRNA的表达水平无关，但在肿瘤中端粒酶的活性与hTERT mRNA水平密切相关。因此，hTERT的表达是端粒酶活化和细胞癌变的限速步骤。,转染hTERT可改变核基质与端粒的结合，产生基因调节信号，下调细胞衰老相关基因的表达，上调DNA修复相关基因活性，增加端粒的稳定性，减低染色体自发伤。,端粒酶调节的主要机制（hTERT的转录调节）,hTERT mRNA与端粒酶活性存在良好的相关性，提示hTERT的表达是通过转录比率的变化来调节的，这种方式被认为是端粒酶调节的主要机制。两者并非总是呈正相关。,经研究，在体内发现高水平的hTERT启动子活性伴低拷贝数的hTERT mR
3、NA，进一步发现了4个参与hTERT基因调节的重要区域。第一区域从翻译起始位(+1)(一300)，为核心启动子，具有双向活性。有多个E盒和Spl结合位点。cMyc和Max蛋白形成异二聚体后与，E盒结合活化hTERT 的转录。Mad蛋白是c-Myc的拮抗剂，可将MycMax结合转变成MadMax结合，从而降低hTERT 启动子活性。Spl也是通过与核心启动子中富含GC的位点结合而活化hTERT 的转录。Spl和c-Myc的共同作用可完全活化hTERT启动子，这些重要转录因子的上调，可能与癌变过程中端粒酶的活化有关。有人推测在正常细胞中存在端粒酶抑制物，在肿瘤中其功能和表达丧失，导致端粒酶再活化。
4、此区有hTERT 的负调节剂wilms 肿瘤抑制基因产物(wilms tumor supressor gene product，Wt 1)的结合位点。,第二区从(-1821-81lbp)，功能上涉hTERT第一个内含子的剪切，对hTERT的特异剪切起关键作用。第三区从(-800-300bp)为抑制区，含有hTERT的负调节剂骨髓特异性锌指蛋白2(myeloid-specific zinc finger protein 2，MZF-2)的结合位点，能降低hTERT的转录活性。第四区位于结构基因外显子1的起始位置(+1+1077)bp(含外显子2的大部分)。在抑制hTERT启动子活性中发挥主要作用
5、。,hTERT转录后剪切,现已发现有6种不同的hTERT的剪切变异体。、为缺失型，另4个有内含子插入。这些变异体均无催化活性。在人类生长过程中，hTERT的剪切具有组织特异性屡特定成人组织中的激素应答性。这表明hTERT的剪切不是随机的。a变异体是主要的端粒酶活性抑制剂，通过精细地调节a变异体和全长的转录体之间的比例平衡来调节端粒酶的活性。,转录后修饰,hTERT转录后可在其特定的丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸残基处磷酸化。研究发现，尽管未受刺激的淋巴细胞没有端粒酶活性，但有可检测的蛋白水平。受刺激后hTERT 蛋白量仅轻度增加，但hTERT蛋白磷酸化比例及活性大大增加，在细胞中的分布发生变化。推测h
6、TERT蛋白在未受刺激的细胞中以无活性的去磷酸化状态存在于细胞浆中，受刺激后磷酸化，并使其转移至细胞核中装配成有活性的端粒酶，在端粒处发挥功能。现认为转录后hTERT经PKC、ERK12和Akt激酶的磷酸化后，通过PKC依赖的信号转导途径，增加cMyc的表达而活化端粒酶。其调节与hTERT蛋白水平无关。如果用蛋白磷酸化酶2A(protein phosphatase 2A，PP2A)去磷酸化，则端粒酶活性明显降低，提示去磷酸化可使端粒酶变成无活性的构象。对端粒酶修饰后其功能改变的进一步研究，有利于研制针对这一过程的特异的抑制剂，开发新的抗肿瘤药物。,伴侣蛋白介导的调节,hTERT与蛋白结合对其在
7、细胞核的装配及活化是必须的。热休克蛋白(heat shock protein，HSP)伴侣复合物包括HSP90、HSP70、P23，与hTERT功能相关。HSP90的靶标多是信号蛋白，它可使不稳定的信号传导蛋白保持构象改变而维持其活性。加入HSP伴侣复合物的纯化成分，有助于hTERT蛋白的折叠、装配，显著增强端粒酶活性。HSP90可与Akt结合，保护Akt免受PP2A诱导的去磷酸化作用，保持其活化的磷酸化状态。这对维持端粒酶活性、抑制凋亡是必须的。,其他分子和药物对hTERT的调节,激素：雌激素在雌激素阳性的细胞中可上调hTERT mRNA 的表达。雌激素原通过激活cMyc的表达有助于hTER
8、T 的活化。孕酮开始时通过RasMEKERK信号途径上调hTERT mRNA 的表达，随后诱导P21的表达，抑制hTERT的转录。,组蛋白去乙酰基酶(histone deacetylase，HDAC)抑制剂：HDAC抑制剂能诱导肿瘤细胞生长停滞、分化及凋亡细胞的死亡，高浓度时可抑制端粒酶活性。被认为是治疗肿瘤潜在的有效制剂。细胞周期调节因子：P53可与Spl形成复合物，抑制Spl与核心启动子结合，过度表达P53能下调hTERT 的转录。在hTERT启动子转录起始区推测有E2F-1结合位点，E2F-1可降低hTERTmRNA 的表达，为非典型转录抑制剂。生长因子：上皮生长因子(epidermal
9、 growth factor，EGF)通过特异的信号传导通路(MAP激酶信号途径)作用于hTERT的启动子，上调hTERT mRNA的表达。,肿瘤病毒：在正常细胞中hTERT启动子近端E盒位置存在端粒酶抑制复合物(如USF1和USF2)的结合位点，人乳头瘤病毒(human papilloma virus，HPV)E6癌蛋白可作用于这些抑制复合物，使c-Myc代替抑制物与启动子结合，活化hTERT 的转录。另有人发现，乙肝病毒和HPV 有4个整合出现在hTERT启动子及其上游区域，第五个整合出现在内含子3中，插入不改变hTERT的编码序列，但可活化hTERT的表达。其他对hTERT有抑制作用的因
10、子有抗癌药物如顺铂，分化诱导因子如维生素D、视黄酸等，其作用机制有待进一步研究。,针对hTERT的生物学功能及其调节机制，目前已有数种方法抑制端粒酶活性。如针对hTERT及hTER的反义核酸、核酶等。采用hTERT启动子与凋亡诱导基因相连形成嵌和载体，这种载体能诱导肿瘤细胞的凋亡而对正常细胞无损害。抗hTERT的抗体对端粒酶抑制的有效性和特异性尚未搞清。另外，一些小的双链RNA 可在哺乳动物细胞内高效、特异地阻断特定基因的表达，促使mRNA降解，介导特异性基因沉默，称为RNA干扰(RNA interference，RNAi)，可能成为关闭基因的有效手段。采用RNAi技术抑制hTERT的表达，不
11、仅可直接降低端粒酶活性，而且还可通过基因及蛋白表达的变化寻找与之相作用的蛋白或信号传导分子，对端粒酶在肿瘤发生、发展中的作用、调控机制、抗肿瘤药物的开发等具有重要意义。,肿瘤细胞端粒酶,已发现在正常的体细胞和良性肿瘤组织中端粒酶活性是阴性(除了生殖细胞外)；而在人体恶性肿瘤组织和人的肿瘤细胞株中都表达了很高的活性。因此，认为端粒酶与恶性肿瘤的发生发展有着密切的关系，有可能成为肿瘤治疗的靶点。,端粒重复扩增法(TRAP),利用PCR扩增端粒重复序列，通过电泳和银染色测定扩增产物，电泳胶中6bp梯状条带确定端粒酶活性。温度30反应时间60 min时可使酶提液与未知化合物作用后还保持着酶的活性，从电
12、诛的上样量及不同浓度细胞酶提液酌结果表明，最低上群量10l 和细胞酶提液0.5g时能得到清晰6bp的梯状条带。RNase0.05g对端粒酶活活性显示抑制作用，而对TaqDNA酶没有影响。,细胞培养,人肿瘤细胞株(Bel一7402、Hela),细胞均在5%CO2，37培养箱中培养，培养液为RPMI 1640(GIBCO产品)，其中含小牛血清10%，青霉素100 IUml和链霉素100gml。,人肿瘤细胞端粒酶的提取,取生长状态好的肿瘤细胞1X 107ml，经离心、洗涤后，加入冷的裂解液200l100 mmolL Tris-HCI(pH7.5)；1 mmolL MgCl2；1 mmolL EGTA
13、；0.1 mmolL苯甲基磺酰氟(phenyI methylsulfonyl fluoride)；5mmolL-巯基乙醇(-mereaplc,exhanol)；0.5 CHAPS；10%甘油(glyceroI)，在冰浴中放置30min,然后16 000g离心4，20min，取上清液按Brodford方法 测定细胞裂解液蛋白量。分装，放置一80 C保存。,RNase与端粒酶的反应,取细胞酶提液1l加入不同浓度(终浓度为1，0.5，0.05，0.01，0.005 g)的RNase，在37条件下,反应20 min 然后加入PCR扩增系统中。,端粒酶活性测定(TRAP法),端粒酶产物的扩增：取细胞酶提
14、液1l分别加入TS引物036mol/L,dNTP50mol，Taq DNA多聚酶lIU，CX引物0.28mol/LMg2+15mmol。在25l反应液中进行PCR扩增。扩增程序为在30反应30min7230 s，然后在94变性30 s，55退火30 s，72延伸30 s。进行30个循环。,聚丙烯酰胺凝胶电泳分析扩增产物：用12%丙烯酰胺灌胶，胶聚合后，取扩增产物1025l加入加样孔中，以180 v的电压进行电泳2 h左右。银染显色：用10%乙醇和0.5%冰醋酸固定聚丙烯凝胶35 min，然后加入硝酸银溶液(最终浓度为0.2%)，在37水搭上振荡染5 min,用超纯水洗涤三次。再加入显色液(30
15、%氢氧化钠和0.1%甲醛)振荡直至DNA条带出现，一般为20min。最后将显色凝胶移至固定液中固定5min。普通光源照像。,RNA酶对Taq酶活性的影响,结果判断：以6bp梯状条带为阳性，即以PCR扩增产物间接反映端粒酶活性。本文结果均重复23次。,DNA扩增系统 在反应体系中加入不同浓度的RNase。,需要研究的因素？,不同温度对端粒酶活性的影响端粒酶提取液热稳定性试验不同反应时间对端粒酶活性的影响不同量细胞酶提液的端粒酶活性PCR扩增产物的不同上样量电泳结果RNase对Taq DNA酶和端粒酶的影响,恶性肿瘤治疗的理想靶点应该是寻找到一种对肿瘤细胞生长所必须，但又不存在于正常细胞的物质。端粒酶就是一种在许多肿瘤组织中处于高表达活性，而在正常组织中却没有酶活性表达的特殊核糖核蛋白物质(除生殖和造血干细胞外)。它在维持肿瘤细胞的高度增殖时，对端粒的缩短起着重要的作用，从而提示端粒酶可能在恶性肿瘤组织中是一个标志。,谢谢！,
