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1、第三章 二维电泳的蛋白质提取与样品制备,制备目的,完全溶解解离变性还原蛋白选择细胞破碎方法、蛋白解聚、溶解方法、去污剂和裂解液的成分,样品制备原则,尽可能采用简单方法进行样品处理，以避免蛋白丢失细胞和组织样品的制备应尽可能减少蛋白的降解，低温和蛋白酶抑制剂可以防止蛋白的降解样品裂解液应该制备，并且分装冻存-80，勿反复冻融已制备好的样品通过超速离心清除所有的杂质加入尿素之后加温不要超过37，防止氨甲酰化而修饰蛋白,第一节细胞裂解方法,温和裂解方法剧烈裂解方法用蛋白酶抑制剂防止蛋白裂解蛋白沉淀步骤清除影响二维电泳图谱杂质裂解液组分,一、温和裂解法,组成较简单样品渗透裂解血细胞、组织培养细胞低渗溶
2、液悬浮细胞冻融裂解细菌、组织培养细胞液氮迅速冷冻细胞，随后在37 融化，反复几次,去污剂裂解组织细胞溶解细胞膜、裂解细胞，释放内容物酶裂解法消化细胞壁溶菌酶 细菌纤维素酶、果胶酶 植物溶细胞酶 酵母在等渗溶液中处理细胞,二、剧烈裂解法,超声裂解法细胞样品通过切应力裂解细胞 迅速超声重悬细胞，并在冰上冷却弗氏压碎器（French Pressure cell）含有细胞壁的微生物在高压下迫使细胞穿过小孔径而产生剪切力,研磨法固体组织、微生物冻存于液氮中，随后研磨成粉末机械匀浆法固体组织将组织切成小片，加入预冷的匀浆缓冲液，简单匀浆，通过过滤或离心获得裂解液玻璃珠匀浆法细胞悬液、微生物剧烈震荡的玻璃珠
3、打破细胞壁,三、蛋白酶抑制剂防止蛋白裂解,蛋白酶抑制剂鸡尾酒（protease inhibitor cocktail）苯甲基磺酰氟(Pheylmethylsulfonyl fluoride，PMSF)：不可逆的抑制剂，使用浓度为1mmol/L，抑制丝氨酸蛋白酶和一些半胱氨酸蛋白酶，但在水溶液中迅速失活AEBSF：丝氨酸抑制剂，使用浓度为4mmol/L，AEBSF的抑制活性与PMSF相近，但它更易溶于水而且毒性低，AEBSF可能改变蛋白的等电点,EDTA，EGTA：使用浓度为1mmol/L，通过鳌合蛋白酶维持活性所必需的金属离子来抑制金属蛋白酶。多肽蛋白酶抑制剂：使用浓度为2-20ug/ml 亮
4、抑酶肽（Leupeptin）能抑制多种丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶；胃蛋白酶抑制剂（pepstatin）抑制天冬氨酸蛋白酶；抑酶肽（aprotinin）能抑制许多丝氨酸蛋白酶；苯丁抑制剂（bestatin）能抑制氨基多肽酶,甲苯磺酰赖氨酰氯甲酮（TLCk），甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮（TPC）K：使用浓度为0.1-0.5mmol/L，不可逆的抑制丝氨酸和半胱氨酸的蛋白酶苄脒（Benzamidine）：使用浓度为1-3mmol/L，抑制丝氨酸蛋白酶,四、蛋白沉淀步骤,1、硫酸铵沉淀（盐析）原理：在高盐溶液中，蛋白质倾向于聚合，并从溶液中沉淀下来，许多潜在的杂质（如核酸）将保持在溶液中步骤：蛋白浓度大于1m
5、g/ml，缓冲液浓度大于50mmol/L，并含有EDTA,缓慢加入硫酸铵至饱和，搅拌1030min，通过离心沉淀蛋白只能预分离或富集蛋白，残存的硫酸铵会干扰等电聚焦硫酸铵中常含有少量的重金属离子，对蛋白质巯基有敏感作用,2、三氯醋酸（TCA）沉淀原理 在酸性条件下与蛋白质形成不溶性盐 作为蛋白质变性剂使蛋白质构象发生改变，暴露出较多的疏水性基团,使之聚集沉淀,2、三氯醋酸（TCA）沉淀,原理 随着蛋白质分子量的增大，其结构复杂性与致密性越大，TCA 可能渗入分子内部而使之较难被完全除去，在电泳前样品加热处理时可能使蛋白质结构发生酸水解而形成碎片，而且随时间的延长这一作用愈加明显 电泳图谱显示，
6、BSA、HSA 单体谱带有较明显的展宽现象，这可能是由于TCA 的结合，使SDS 与蛋白质的结合量产生偏差，从而造成蛋白质所带电荷的不均一性，造成迁移率的不一致,2、三氯醋酸（TCA）沉淀,有效的沉淀方法：将TCA加到提取液中，终浓度高达1020%，冰上沉淀30min；组织样可直接用1020%TCA进行匀浆；最后用丙酮清洗沉淀，以除去TCA蛋白质再溶解很困难，且不能完全再溶,3、丙酮沉淀,沉淀机理：降低水的介电常数，导致具有表面水层的生物大分子脱水，相互聚集，最后析出优点：分辨能力比盐析法高，沉淀不用脱盐，过滤较为容易在常温下，沉淀的蛋白质往往引起变性,4、在丙酮中用TCA沉淀,两者联合更加有
7、效10%TCA在丙酮中重悬裂解的样品溶液(含有0.01%-巯基乙醇溶液或20mmol/L DTT)，至少-20沉淀45min仍然存在难再溶现象,5、用苯酚提取，随后在甲醇中用醋酸铵沉淀,杂质含量高的植物样品很有效蛋白质被提取到饱和酚中，然后在甲醇中用醋酸铵从酚相中沉淀蛋白此法较复杂，并且耗时较多,五、清除影响二维电泳图谱的杂质,1、盐离子、痕量缓冲液和其他带电荷的小分子在IPG胶条中，盐离子可导致溶液的电导率增大胶条中的盐离子可能导致较大区域不能聚焦透析、旋转透析、凝胶过滤和沉淀/重悬进行脱盐处理,样品中太多盐离子干扰IEF,丙酮沉淀去除盐和杂质,A.蛋白提取物未经处理,B.经脱盐处理,C.商
8、品化试剂盒沉淀处理,带电荷杂质,样品不纯,2、内源性小分子（如核酸、代谢物和磷脂）,带负电荷，能发生偏阳极侧的聚焦不全TCA/丙酮沉淀除去这类物质特别有效,3、离子去污剂,与多肽形成复合物不能正确聚焦重泡胀溶液可稀释含SDS样品丙酮沉淀可去除部分SDS高温下沉淀将最大限度除去SDS,但在-20沉淀会更完全,4、核酸（RNA、DNA）,核酸增加样品的黏度，并导致背景弥散高分子质量的核酸能阻滞凝胶孔径核酸可通过电稳态相互作用与蛋白结合，阻碍聚焦核酸也将被银染染色，导致高背景DNase/RNase A混合物处理超离,5、多糖,阻碍凝胶孔径、导致沉淀、延长聚焦时间、出现水平条纹、与蛋白质形成复合物硫酸
9、铵或苯酚/醋酸铵沉淀，随后离心超速离心,6、脂类,膜蛋白与脂类形成复合物，降低溶解性，影响等电点和分子量脂类与去污剂形成复合物，减低其效率强变性剂和去污剂最大程度减少蛋白与脂类的相互作用,7、酚类组分,通过酶催化的氧化反应来修饰蛋白应用还原剂防止苯酚的氧化通过沉淀方法迅速从酚组分中分离蛋白用抑制剂灭活多酚氧化酶PVP或PVPP吸收酚来清除酚组分,8、不溶物质,阻碍凝胶孔径，导致聚焦不良阻碍蛋白进人IPG胶条先除去不溶物质,六、裂解液的组分,基本成分：尿素、一种或几种去污剂尿素：中性离液剂，可溶解和解折叠大多数蛋白质，形成完全随机的构象，使所有的离子基团暴露于溶液中去污剂：确保蛋白完全溶解，防止
10、通过疏水相互作用导致蛋白聚合还原剂：断裂二硫键，以保持蛋白处于一种还原状态载体两性电解质、IPG buffer:通过电荷与电荷之间的相互作用减少蛋白聚合以增加溶解性,1、可溶性样品,血清、血浆、尿样、脑脊液以及细胞和组织的水溶性提取物，经很少的前处理便可进行2-DE蛋白质浓度较高的样品，适量样品裂解缓冲液稀释后直接分析较低的蛋白质浓度或较高盐浓度的样品，可透析或液相色谱脱盐，通过冻干、聚乙二醇的透析、超滤、TCA/丙酮沉淀浓缩样品,导致蛋白酶失活，进而减少蛋白质降解，去除杂质、富集碱性蛋白质,七、样品制备,2、组织样品,组织在液氮中冷冻后破碎组织样品的异质性免疫亲和技术激光捕获微量切割技术（L
11、CM）,3、细胞,体外悬浮培养细胞或周期性细胞样品：离心收集，随后用磷酸盐缓冲液清洗并溶于样品缓冲液固体基质中培养的细胞：去除培养基质，PBS或等渗蔗糖溶液清洗细胞层，刮擦方法收获细胞，避免使用蛋白裂解酶；或加入少量体积裂解缓冲液，将附着在基质上的细胞直接裂解核酸含量过高，用不含蛋白酶的DNase/RNase混合物来处理样品,4、样品分级,目的：降低样品的复杂性并富集低拷贝蛋白质亚细胞收集、液相电泳、吸附色谱、选择性沉淀蛋白质在一系列溶解能力逐渐增强的缓冲液中溶解性能的不同,八、溶解,理想的2-DE溶解应能达到破坏所有非共价结合蛋白质复合物和聚积体，形成各个多肽的溶解液样品中结合牢固的蛋白质复
12、合物可能使2-DE中出现新的蛋白质点，相应地表示单个多肽的点强度将下降必须允许去除可能干扰2-DE分离的盐、脂类、多糖和核酸等物质样品中蛋白质在2-DE过程中必须保持可溶性,增加样品溶解性手段,变性剂：通过改变溶液中的氢键结构使蛋白质充分伸展，使其疏水中心完全暴露，降低接近疏水残基的能量域 尿素硫脲表面活性剂：经过变性剂处理而暴露蛋白质的疏水基团后，还需要至少一种表面活性剂来溶解疏水基团 CHAPS、SDS还原剂：在变性剂和表面活性剂联用的条件下，加用还原剂可使蛋白质展开更完全，溶解更彻底 含自由巯基的DDT、巯基乙醇、不带电荷的三丁基膦（TBP）,起载体作用的两性电解质：即使在变性剂和表面活
13、性剂存在的情况下，某些蛋白质质也需要在盐离子的作用下才能保持其处于溶解状态，否则在其pI点时会发生沉淀 两性电解质的浓度应小于0.2%(w/v)，过高会使IEF速度降低 两性电解质的pH应与IPG胶条的pH范围相符,增加样品溶解性手段,第二节 蛋白质分步提取技术,分步提取法所采用裂解液的溶解性能是逐渐增加的第一步裂解液：只含有40mmol/L Tris，其余为去离子水，只溶解偏亲水性的蛋白质第二步裂解液：属传统的裂解方法，含有表面活性剂CHAPS、还原剂DTT、解聚剂Urea等成分，具有良好的溶解能力，可以溶解亲水性、中性和较疏水性的蛋白第三步裂解液：添加了能促进疏水性蛋白质溶解的成分（表面活
14、性剂SB3-10、还原剂DTT、解聚剂thiourea,）主要溶解偏疏水性的蛋白质,蛋白样品,40mmol/L Tris,收集上清,冷冻干燥,8mol/L Uter,4%CHAPS,100mmol/L DTT,40mmol/L Tris,0.5%CA,在40mmol/L Tris中不溶的沉淀,8mol/L Uter,4%CHAPS,2mmol/L TBP,40mmol/L Tris,0.5%CA,收集上清,在8mol/L Uter,4%CHAPS,100mmol/L DTT,40mmol/L Tris,0.5%CA中不溶的沉淀,5mol/L Uter,2mol/L thiourea,2%CHA
15、PS,2%SB3-10,2mmol/L TBP,40mmol/L tris-base,0.5%CA,收集上清,在5mol/L Uter,2mol/L thiourea,2%CHAPS,2%SB3-10,2mmol/L TBP,40mmol/L tris-base,0.5%CA不溶的沉淀,分步提取法示意图,第三节 亚细胞分离与蛋白质提取,亚细胞的纯化和分级可获得高度纯化和富集的蛋白最基本的方法：依据蛋白的大小和密度差异来进行亚细胞分级低速离心，从胞质细胞器中分离出细胞核和未破碎的细胞，获得所需上清通过各种密度梯度从上清中分离出各种细胞器二维电泳分离，计算机帮助图像分析显示出差异蛋白,一、膜蛋白的
16、提取和分离,一、膜蛋白的提取和分离,膜蛋白：多肽链跨越脂双分子层数次的蛋白，为膜整合或膜内在蛋白膜内在蛋白结构域必须折叠成螺旋或片层的二级结构跨膜蛋白占细胞总蛋白的30%膜蛋白处于细胞的边界，在细胞的各种生命活动中发挥重要的作用信号转导、细胞粘附、代谢、离子交换、内吞等,提取膜蛋白应注意：,膜蛋白的纯度沉淀或分级技术也分离膜连的细胞器（如线粒体）样品的制备中，并不是每一个蛋白质都是膜蛋白应用盐：溴化钾使与膜相互作用较弱的蛋白分离出来而富集内在蛋白应用去污剂分级除去膜蛋白制品中的可溶性杂质,膜蛋白很难出现二维电泳凝胶图谱中膜蛋白是低丰度的、多为偏碱性、难溶于等电聚焦的水相介质中的蛋白必须实现3个
17、条件必须保证膜的脂类环境，还应避免多余脂类对等电聚焦的干扰必须以一种可溶的形式（去污剂-蛋白复合物）从膜中分离出来所提取的膜蛋白必须在等电聚焦过程中维持可溶状态，特别是在等电点的位置,当pH7时，膜蛋白斑点数多于胞外蛋白；随着pH的增大，膜蛋白的优势越来越明显。,结核分枝杆菌胞外蛋白和膜蛋白2DE图谱,二、核蛋白的提取和分离,普遍存在于各种生物的细胞核中的特殊形态的蛋白质，由核酸与组蛋白、精蛋白等的碱性蛋白结合而成为细胞核的主要成分核蛋白中的蛋白质包括组蛋白(或精蛋白)和非组蛋白蛋白质。组蛋白含碱性氨基酸如精氨酸、赖氨酸等丰富的碱性蛋白，带正电荷。精蛋白仅出现于真核细胞中，含较多的天门冬氨酸、
18、谷氨酸等酸性氨基酸，是酸性蛋白，带负电荷,二、核蛋白的提取和分离,核蛋白属于中等溶解度联合尿素、硫脲和去污剂裂解核蛋白，可达到足够的分辨率核蛋白是强碱性蛋白（pI10）与二维电泳的第一维等电聚焦相容程度较低核基质核表面核纤层蛋白、多种低丰度核蛋白、核内不均一核糖核蛋白、与基质相关的DNA结合区,在含有0.05%TritonX-100和1.2mmol/L蛋白酶抑制剂缓冲液中匀浆数分钟，离心去除脂类和可溶性蛋白（Fey和Penman建立的核基质提取方法）,多发性骨髓瘤耐药细胞株核基质蛋白 2-D图,二、核蛋白的提取和分离,核膜的组成与内质网连续的核外膜、由核纤层支撑的核内膜、由核纤层蛋白组成的中间网格、位于核孔复合体的连接内外核膜的核孔膜参照Dreger M方法,
