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1、细胞工程实验技术（动物细胞培养部分）目录实验一 实验器材的清洗、包装和消毒2.实验二常用的仪器设备介绍3.实验三 常用动物细胞培养用液的配制4.实验四组织块原代培养、传代培养及生物学检测6.实验五 心肌细胞的原代培养、传代培养及培养细胞的常规检查8实验实验器材的清洗、包装和消毒一、实验目的1、掌握细胞培养常用实验器材的清洗要领、清洗步骤和注意事项。2、掌握细胞培养常用器材的包装要领和要求。3、掌握正压滤器的安装、使用和拆除方法及操作注意事项。二、实验用品以组为单位包装物品1、量筒（100mL、500mL）2、大、小烧杯3个3、1000mL 容量瓶 X14、移液管1mLX3 （灭菌）5、（100
2、mL、250mL、500mL）盐水瓶、（500mL）广口瓶 X 各 4 （灭菌）6、 眼科剪刀、眼科镊子各2把（灭菌）7、 细胞培养瓶X3 （灭菌）其它：饭盒、青霉素瓶、牛皮纸、离心管、滴 管、注射器、磁棒、绳、标签纸等杂干。三、实验内容1、2、3、（一）清洗要领：浸泡、刷洗、酸泡。步骤：洗衣粉浸泡12h刷洗 流水震荡冲洗1520遍 漓水 蒸馏水洗荡2次37C烘干待包装。T TT T注意事项：T（1）使用后的器材要立即投入水中。（2）器皿内要充满液体，不得有气泡。（3）器材要用流水震荡干净。（二）包装1、大的器材如：量筒、广口瓶、培养皿、吸管等要包装。2、小的器材如：注射器、剪刀、镊子放入饭盒
3、。3、注意事项：（1）包装时手指与器材接触面积要小，手指不能触及器材使用端。（2）封闭器材使用端，标记器材手持端。（3）小包装（4）玻璃管道口加棉花。（三）湿热消毒：高压灭菌锅消毒作业1、清洗的要求为何较高？你认为该如何保证器皿中无杂质？2、器材包装有何要求？3、实验二常用的仪器设备介绍一、实验目的了解动物细胞培养中常用仪器设备的使用方法、注意事项和保养方法二、实验用品1）超净工作台2）自动双重纯水蒸馏器3）高压蒸气灭菌器4）过滤器5）电热恒温干燥箱6）二氧化碳培养箱7）冰箱8）倒置显微镜三、实验内容1了解超净工作台的工作原理、2自动双重纯水蒸馏器结构、使、3高压蒸气灭菌器的工作原理、4正压过
4、滤器的使用方法、5二氧化碳培养箱的使用方法作业叙述超净工作台的工作原理2、正压过滤器为何会除菌实验三 常用动物细胞培养用液的配制一、实验目的掌握常用动物细胞培养用液的组成及酉己制方法。二、实验用品与仪器量筒、烧杯、广口瓶、天平、各种无机盐、三、实验内容（一）平衡盐溶液的己己制 1平衡盐溶液的己己方如下:NaClKClCaCl2MgSO4 7H2ONa2HPO4 2H2Okh2po4NaHCO3葡萄糖苯酚红Hanks8.000.400.140.200.060.060.351.000.02D-Hanks8.000.400.060.060.350.02I组9己 Hanks（1000mL）, V组己己
5、D-Hanks （ 1000mL ），其他各组不己己平彳!爵盐溶液。2、己己制方法：（以Hanks液为例）（1）甲液：用约100mL蒸馏水溶解CaCl2，（2）乙液：用约 750mL 蒸馏水溶解 W2HPO42H2O、KH 2PO4、MgSO4 7H2O、葡萄糖、NaCI、 KCI。（3）将甲液徐徐加入乙液中。（4）将O.35gNaHCO4溶解在100mL蒸馏水中用数滴NaHCO4液溶解0.02克酚红。将4、5液移入3液中。 用双蒸水定容至1000mL,充分混匀，调节PH为7.4。4 C冰箱过夜。（8）滤过消毒，小瓶分装（500mL、250mLX2）,冷藏。3、己己制求（1）己己制后液体呈桃红
6、色，PH7.4左右，没有混浊和沉淀。（2）含Ca、Mg的物质要单独溶解。用于分离细胞的消化液宜用无 Ca、Mg离子的D-Hanks液或PBS液己己制。（二）200mmol/l , L-谷氨酰胺（10mL）（ II 组己己）方法：称取0.292g （M146.12 ） +双蒸水10m滤过除菌-20C保存。T吏用：每100mL培养基加1mL L-谷氨酰胺。（三）抗菌素液（青霉素、链霉素）（山组己己）1、方法：10mL Hangks液或双蒸水溶解100万链霉素，再用8mL链霉素溶解80万u 的青霉素，成每毫升青霉素、链霉素各10万单位的母液。2、T吏用：100mL培养液加青、链霉素母液0.1mL。（
7、RPMI-1640基础培养液的己己制（IV甲 RPMI-164010.4gHepes2.7g双蒸水700mL搅拌至颗粒完全溶解（橙红色）乙NaHCO32.2g双蒸水30mL30min颗粒完全溶将甲、乙两液混合，加水至终1000mL定容，4C冰箱静止23h，滤过除菌，分装 （250mL、250mL、500mL ）无菌试验，写好组号，-20 C保存。注意：用三天内制备的蒸馏水酉己制，培养基各成分是否完全溶解的判断方法： 将 培养液置室温或4C冰箱静止30min，观察瓶底有无颗粒产生。（五）5.6 %NaHCO4 液（100mL） （V 组己己）方法：用双蒸水100mL己己制，滤过除菌，分装于广口瓶
8、，4C冰箱保存，使用时，NaHCO4液要逐滴加入，并不时搅动培养液，以防PH过高。（六）0.25%胰蛋白酶溶液（400mL）（VI组己己）1: 250的胰蛋白酶（Trypsin）粉1.0gD-Hanks先用少量D-Hanks溶解胰蛋白酶，（待400mL再将剩下的液体加入混合，置37 C水浴中1h左右彻底溶解，液体呈透明为止），用5.6% NaHCO4调整pH至7.6 7.8，用0.22微型滤膜抽 滤，分装置4 C冰箱中保存。（七）0.02%EDTA （乙二胺四乙酸二钠）溶液（200mL） （VI组己己）方法：称取EDTA 4g + 200mL D-Hanks 液 0.02%,滤过除菌，备用。四
9、、思考题：1、己己制后液体呈黄色意味着液体的PH发生了什么变化？2、用于分离细胞的消化液为什么宜用无Ca、Mg离子的D-Hanks液或PBS液己己制3、L-谷氨酰胺在营养液中有何作用？4、营养液制备后为什么要小剂量分装？实验四组织块原代培养、传代培养及生物学检测一、实验 目的 掌握组织块原代培养、传代培养的基本方法和操作特点及生物学检 测的基本方法和操作要点。二、实验器材与用品1肝组织2、平衡盐（BSS ）液（各组自己酉己的）xiOOmL 3、细胞培养皿4、完全培养液 5、灭菌培养皿X1个/人6、眼科剪、镊子、吸管等 7、0.4%台盼 蓝8、血球计数板和盖玻片三、实验步骤（一）组织块原代培养1
10、、 将一小块肝组织置于灭菌培养皿中，用Hanks或D-Hanks液漂洗表面，吸净Hanks 或D-Hanks，用目艮科剪反复剪成12mm3大小（约需2030min）。2、吸管吸取12mL Hanks或D-Hanks液吹下剪刀中的碎块，然后，反复吹打，静置片 刻，吸除上清BSS。3、用吸管吸取小块肝组织于培养瓶底部，均匀，间距离0.5cm为宜，加少量培养液 （维持湿润即可）。4、次日，组织贴壁后，再补加营养液。5、37c温箱培养，2448后观察。（二）组织块传代培养1、将长成单层的原代培养组织块从二氧化碳培养箱中取出，在超净工作台中倒掉瓶内的 培养液，加入少许消化液0.25%胰蛋白酶溶液。（以液
11、面盖住细胞为宜），静置510分钟。2、在倒置镜下观察被消化的细胞，如果细胞变园，相互之间不再连接成片，这时应立即 在超净工作台中将消化液倒掉，加入35mL 新鲜培养液，吹打，制成细胞悬液。3、将细胞悬液吸出2mL 左右，加到另一个培养瓶中并向每个瓶中分别加3mL 左右培养 液，盖好瓶塞，送回二氧化碳培养箱中，继续进彳亍培养。（三）组织培养细胞的常规检查1、营养液PH值的检查（1）新鲜的培养液呈橙红色。（2）细胞生长旺盛，代谢酸性产物增多，营养液酸性变黄。（3） 培养瓶若刷洗不洁，残留碱性物质，致营养液PH增高，呈紫红色。一般情况 下，每周换液2次，每次换半量或1/3量。2、微生物的污染与排除（
12、1）细菌污染对培养细胞的影响及污染物的检测污染的细菌量比较大，增殖的细菌就可以导致培养液外观浑波，肉眼就可以判断。 细菌污染大多数可以改变培养液pH，使培养液变浑波、变色。用相差显微镜观察， 可见满视野都是 点状的细菌颗粒。原来的清晰培养背景变得模糊，大量的细菌甚至 可以覆盖细胞，对细胞的生存构成威胁。用青霉素、链霉素可以预防细菌污染有 效。（2）真菌污染对细胞的影响及污染物的检测 大多呈白色或浅黄色小点漂浮于培养液表面，肉眼可见；有的散在生长，镜下可见呈丝状、管状、树枝状，纵横交错穿 彳亍于细胞之间。(3) 支原体污染对细胞影响及污染物的检测支原体污染后，因为它们不会使细胞死亡可以与细胞长期
13、共存，培养基一般不发生浑波，细外观上给人以正常感觉，实则细胞受到多方面潜在影响，如引起细抑制细胞生长等。胞无明显变化, 胞变形，影响DNA合成，、思考题1、你认为该如何操作才能保证培养过程中无微生物污染？2、你认为组织块培养成功需哪些条件？3、原代细胞和传代细胞培养有哪些区别？实验五 心肌细胞的原代培养、传代培养及培养细胞的常规检查一、实验目的掌握心肌细胞培养的基本方法和操作特点，为传代培养作好准备。二、实验器材与用品1鹤鹑的心脏2、平衡盐（BSS）液（各组自己酉己的）xiOOmL3、细胞培养瓶（每人一个）4、完全培养液5、灭菌培养皿X1个/人6、目艮科剪、镊子、吸管等7、0.25%胰蛋白酶液
14、8、0.02%EDTA液9、无菌离心管10、100目铜筛三、实验内容（一）原代培养实验步骤1、取材取一只鹤鹑，断颈处死，用75%酒精浸泡消毒。（2）（在超净工作台中操作）剪开胸壁，取出心脏，放入Hanks或D-Hanks液中。（3）用Hanks或D-Hanks液冲洗心脏后，剪去心房，取心室肌，然后，用Hanks或D- Hanks液冲洗3次。2、漂洗与剪切将心室肌置于无菌培养皿中，剪成 10块左右的小块，用Hanks或D-Hanks清洗2 次，吸去多余的液体。 用眼科剪反复剪切成1 mm3左右大小，约需2030min。3、消化 无菌培养皿中的小组织块用Hanks或D-Hanks液冲洗，移入离心管
15、中（盖好盖子， 请 注意无菌操作），低速离心（500800r/min ） X7min。 用吸管去除上清液，加入沉淀量 58倍的0.25%胰蛋白酶液，37C水浴摇晃20min， 用吸管吹打组织块，以分离细胞，然后，加入完全培养液约 5mL，终止消化。4、制备单细胞悬液（1）将上述悬液500800r/min 7min，吸除上清液。（2） 用BSS液漂吸23min （用吸管反复轻打松散组织），离心去上清液，共两次。 去上清液后加15mL细胞培养液，混匀计数约5 X105个/mL。5、接种（1） 25mL培养瓶中先加入1.5mL培养液，再接种1mL细胞悬液。持瓶左右、上下轻轻摇晃，移入37C、5%C0
16、2恒温箱培养，根据细胞生长情况，每 隔23天换液1次。（二）传代培养实验步骤1、取原代培养物，吸除原瓶内旧培养液，轻轻摇晃培养瓶，将细胞振入培养液 内，将悬浮在培养液中的细胞移入离心管中。2、消化（1）向瓶内加入胰蛋白酶（0.5mL ）和EDTA液（0.5mL ）约58min,需终止消化（加基础培养 液 1mL）o（2）收集消化下来的细胞，归入前离500800r/min X5min,去除上清液。心管中，3、分瓶培养：沉淀物加少量完全培养液，摇匀，分别接种到两个新的培养瓶内，每 瓶再补 加2.0mL培养液，十字形混匀细胞，、5%CO2恒温箱培养。（三）细胞培养的生物学检查1处理贴壁生长细胞时，吸
17、出培养液，每瓶加入消化液各 0.5mL，在 37C下消化12min 后，加入约10mL培养液，用 吸管冲洗细胞，制成细胞悬液。取0.5mL台盼蓝溶液、0.3mLHanks或D-Hanks液和0.2 mL细胞悬液，充分混匀，然后，将混合液放置515min。2、用吸管吸取少量混合液，注入血细胞计数板小室。将盖玻片放在计数板上，用 吸管吸取 少量细胞悬液，充满间隙。在显微镜100倍放大用计数器计数4个大方格中 的细胞。3、至少计数500个细胞，并计数其中的着色细胞。用双蒸水和75%酒精清洗计数板和盖玻片，然后，用檫镜纸檫干。4、结果分析：（1）细胞密度（个/mL）=（四大格细胞数/ 4）X104。每个方格的积为 &0-4肮。细胞 总数（个）二细胞浓度x细胞悬液量。（3）正常细胞不被染色。细胞死亡后，细胞膜的通透性增大，台盼蓝进入细胞内，故细胞呈兰色色。（4）细胞活力（）二（总细胞数一着色细胞数）三总细胞数X100%儿冲西中耀鼻卜边呻内”苇itMA右曲中就暮卜 生中博、思考题:1、你认为心肌细胞培养的基本操作要点是什么？2、培养瓶移入C02 I亘温箱培养时，瓶盖为何要稍松？3、如何初步判断胰蛋白酶的消化时间？4、细胞培养到一定时间为何要进彳亍传代？
