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1、氨基酸与多肽,氨基酸的通式和构型(氨基酸，L构型)几种特殊的氨基酸(酸性、碱性、带芳香环)氨基酸的两性电离和等电点pI氨基酸氨基参与的反应(凯式定氮法，烃基化)氨基酸羧基和氨基参与的反应(茚三酮显色)氨基酸R基参与的反应(Folin-酚反应，二硫键转化)氨基酸分离分析的原理，蛋白水解制备氨基酸多肽的命名常见多肽(谷胱甘肽),蛋白质分子结构,一、蛋白质的结构层次二、蛋白质的一级结构三、蛋白质的二级结构四、超二级结构和结构域五、蛋白质的三级结构六、蛋白质的四级结构,一、蛋白质的结构层次,二、蛋白质的一级结构 Primary structure,1定义：,蛋白质的一级结构是指蛋白质多肽链中氨基酸的排
2、列顺序(sequence)，一级结构的主要连接键是肽键，通常将二硫键也归属于一级结构,2结构特点：,蛋白质的序列具有方向性，一般书写顺序是从N-端到C-端，其主要作用是决定蛋白质分子的高级结构和功能,二硫键的形成,胰岛素的一级结构,蛋白质的一级结构举例,21aa,30aa,蛋白质一级结构的测定步骤,三.肽链氨基酸组成分析,一.蛋白质中肽链的拆离(亚基与分子间二硫键),五.肽链的部分降解及肽片断的分离,四.氨基酸末端分析,六.肽段氨基酸组成分析及末端分析,七.肽段序列重叠,二.肽链分子内二硫键的断裂,八.二硫键的定位,(1)样品准备：均一性、纯度、相对分子量、肽链数目、氨基酸组成(2)一般步骤：
3、单条多肽链准备 至少两套肽段序列测定 蛋白质分子序列重建,一级结构的测定主要用小片段重叠的原理,蛋白质一级结构的测定,肽链间的结合,非共价键,血红蛋白（四聚体）烯醇化酶（二聚体）,共价键结合,胰岛素免疫球蛋白等,蛋白质中肽链的拆离,非共价键连接的多肽链,温和条件下可以解离(变性剂或高浓度盐),通过二硫键连接的多肽链,需要较强的条件将二硫键切断,还原法(巯基化合物),氧化法(过氧酸),蛋白质中肽链的拆离,蛋白质的氨基酸组成分析,蛋白质完全水解后采用氨基酸自动分析仪进行分析,化学裂解法,酶水解法,溴化氰法,羟胺法,肽链的部分降解,溴化氰法,溴化氰对Met羧基形成的肽键特异,肽链的部分降解,羟胺法,
4、羟胺能专一地裂解Asn-Gly的肽键，酸性条件下裂解Asn-Pro肽键,肽链的部分降解,酶水解法,常用的酶有:,胰蛋白酶,胰凝乳蛋白酶,胃蛋白酶,嗜热菌蛋白酶等,优越性:,较高专一性,水解产率较高,肽链的部分降解,酶解方法,Lys,Arg残基羧基形成的肽键,疏水残基羧基形成的肽键,疏水残基之间的肽键,胰蛋白酶(trypsin)只断裂Lys、Arg残基的羧基参与形成的肽键 以马来酸酐可以保护Lys侧链的-NH2，得到只含Arg羧基端的肽链；或者用1,2-环已二酮修饰Arg的胍基，得到只含Lys羧基端的肽链 胰凝乳蛋白酶(糜蛋白酶,chymotrypsin)只断裂Phe、Trp和Tyr等疏水氨基酸
5、残基的羧基端肽键。如果断裂点邻近的基团是碱性的，裂解能力增强；是酸性的，裂解能力将减弱,蛋白酶的水解专一性,蛋白酶的水解专一性,胃蛋白酶(pepsin)与胰凝乳蛋白酶类似，要求断裂点两侧的残基都是疏水性氨基酸，如Phe-Phe，最适pH值为2，胰蛋白酶则为89。由于二硫键在酸性条件下稳定，因此确定二硫键位置时常用该酶处理 嗜热菌蛋白酶(thermolysin)含Zn和Ca的金属酶，Zn是酶活力必需的，Ca与酶的热稳定性有关。该酶作用专一性较差，常用于较短的多肽或大肽段,N-末端分析,C-末端分析,氨基酸末端分析,N-末端分析,二硝基氟苯法(FDNB或DNFB法),二甲氨基萘磺酰氯法(DNS法)
6、,苯异硫氰酸酯法(Edman法),氨基酸末端分析,氨肽酶(Amino peptidase)法,二硝基氟苯法(FDNB法),1945年由Sanger发明此法,曾用此方法测定了胰岛素的N-末端,氨基酸N末端分析,DNP-氨基酸(黄色)对酸水解远比肽键稳定 多肽链上的-NH2、酚OH也能与DNFB反应，但是产物经过有机溶剂萃取后与游离氨基酸留在水相，易与-DNP氨基酸区分开,二甲氨基萘磺酰氯法(DNS法),1956年由Hartley等提出,灵敏度较高(具有荧光性质，比FDNB法提高100倍),样品量小于1纳摩尔,DNS-氨基酸稳定性较高,此法优点,氨基酸N末端分析,苯异硫氰酸酯法(Edman法),氨
7、基酸N末端分析,反应分为偶联、环化断裂和转化三步 Edman测序一次能连续测定6070个残基的序列,亮氨酸氨肽酶（Leucine amino peptidase,LAP）,专一性:,A=非极性氨基酸时 快,A=其它氨基酸时 慢,A=Leu时 最快,氨基酸N末端分析,氨基酸N末端分析,多肽N端封闭,在序列测定中，经常会碰上N端残基的氨基被封闭，不能与PITC试剂反应N端封闭的种类很多，如焦谷氨酸酰化、乙酰化以及某些环肽(如短杆菌肽S)的N和C末端连接成环等,C-末端分析,肼解法,还原法,羧肽酶法,氨基酸末端分析,肼解法,氨基酸C末端分析,蛋白质或多肽与无水肼加热发生肼解，反应中除C端氨基酸以游离
8、形式存在外，其他的氨基酸都转化为相应的氨基酸肼化物 反应中生成的氨基酸酰肼可与苯甲醛作用生成不溶于水的二苯基衍生物而沉淀，上清中的游离C端氨基酸可借助FDNB或DNS法以及层析技术鉴定 Gln,ASn,Cys被破坏不易测出，C端Arg转变为鸟氨酸,还原法,氨基酸C末端分析,肽链C端氨基酸用硼氢化锂还原成相应的-氨基醇。肽链完全水解后，可用层析法加以鉴定 Sanger早期采用该法鉴定胰岛素A链和B链的C端残基,羧肽酶法,主要方法,根据氨基酸释放的动力学曲线，可确定该肽链的C端氨基酸顺序,氨基酸C末端分析,羧肽酶(Carboxypeptidas)法,A-B,氨基酸C末端分析,4种羧肽酶的来源和专一
9、性,则其氨基酸排列顺序为：Thr-Val-Lys-Ala-Ala-Trp-Gly-Lys,如测一个八肽,测得N端氨基酸残基为Thr,又分别测得片断:Ala-Ala-Trp-Gly-Lys Val-Lys-Ala-Ala-Trp Thr-Asn-Val-Lys,二硫键的定位,二硫键的定位,将含二硫键的肽段进行酶解，分离出含二硫键的肽，对该肽进行氧化或还原，切断二硫键，生成二个小肽段，将这两个小肽段与原肽链氨基酸顺序进行比较，即可确定二硫键位置,二硫键位置的确定,对角线电泳,1.胃蛋白酶水解(专一性低，切点多，作用pH在酸性范围，有利于保持二硫键完整)2.对角线电泳(a)pH 6.5条件下 一相电
10、泳(b)暴露于过甲酸蒸汽后，断裂二硫键,形成含磺基丙氨酸的肽，进行第二相电泳,如何区分分子间和分子内的二硫键？,问题：,蛋白质一级结构测定流程,完整蛋白,拆分亚基,亚基蛋白,多肽片段,水解分离片段,多肽序列,亚基蛋白序列,多肽序列测定,片段重叠,蛋白质一级结构,二硫键测定,氨基酸组成分析,末端测序,蛋白质测序新方法,生物质谱法 软电离方式结合惰性气体碰撞的多级串联质谱(MS/MS or MSn)核酸序列测定法 通过基因中核苷酸的序列推测蛋白质的氨基酸顺序,牛胰岛素的化学结构,蛋白质测序举例,(1)已知一个八肽完全降解后，分析其组成为 Ala，Gly(2)，Lys，Met，Ser，Thr，Tyr
11、(2)该八肽用溴化氰（CNBr）处理得到以下2个片段，组成分 别如下：(a)Ala，Gly，Lys，Thr(b)Gly，Met，Ser，Tyr(3)用胰蛋白酶处理得到以下2个片段，组成分别如下：(a)Ala，Gly，(b)Gly，Lys，Met，Ser，Thr，Tyr，(4)用胰凝乳(糜)蛋白酶处理得到以下2个片段，组成分别如下：(a)Gly，Tyr，(b)Ala，Gly，Lys，Met,Ser,Thr，(5)经分析：N-末端残基是：Gly，C-末端残基是：Gly，请确定该八肽的氨基酸序列,习 题,(1)CNBr水解Met羧基形成的肽键，故可得：Gly-(Tyr,Ser)-Met,(Thr,L
12、ys,Ala)-Gly(a)Ala，Gly，Lys，Thr(b)Gly，Met，Ser，Tyr(2)胰蛋白酶水解Lys和Arg羧基形成的肽键，故可得：Gly-(Tyr,Ser,Met,Thr)-Lys,Ala-Gly(a)Ala，Gly，(b)Gly，Lys，Met，Ser，Thr，Tyr(3)糜蛋白酶水解Phe,Trp,Tyr等疏水氨基酸羧基形成的肽 键,故可得：Gly-Tyr,(Ser,Met,Thr,Lys,Ala)-Gly(a)Gly，Tyr，(b)Ala，Gly，Lys，Met,Ser,Thr，综合以上情况，根据片段重叠，推测该肽的序列为：Gly-Tyr-Ser-Met-Thr-Ly
13、s-Ala-Gly,答 案,课 后 习 题,已知一个七肽 经分析它的氨基酸组成为：Lys、Pro、Arg、Phe、Ala、Tyr和Ser;此肽未经糜蛋白酶处理时，与FDNB反应不产生-DNP-氨基酸;经糜蛋白酶处理后可以得到两个肽段，其氨基酸组成分别为Ala、Tyr、Ser和Pro、Phe、Lys、Arg，这两个肽段与FDNB反应后分别得到DNP-Ser和DNP-Lys;此肽与胰蛋白酶反应后同样能生成两个肽段，它们的氨基酸组成分别是Arg、Pro和Phe、Tyr、Lys、Ser、Ala。请分析该七肽的一级结构怎么样？,概念：蛋白质中多肽链主链自身盘绕折叠形成的在一维方向上有规律性的结构基本类型
14、：-螺旋、-折叠、-转角、无规结构稳定二级结构的作用力：氢键,三、蛋白质的二级结构 Secondary structure,构型与构象,构型：,化合物分子中原子和基团在空间的取向，构型的改变涉及共价键的形成与破坏，但与氢键无关。,化合物分子中原子沿共价单键旋转而产生的不同空间排列，构象的改变不涉及非共价键的形成与破坏。,构象：,肽键的特点,酰胺键中C-N键具有部分双键(40%)性质，不能自由旋转。肽键(-CONH-)中的个原子和个碳原子(C)被约束在一个刚性平面（即肽键平面）上，构成一个肽平面,C-N 键长为0.145nmC=N 键长为0.125nm酰胺键中C-N键长为0.133 nm,三、蛋
15、白质的二级结构,(1)-螺旋（-helix）,Pauling和Corey于1965年提出,结构要点：(1)肽键平面为单位,以-碳原子为转折盘旋形成右手螺旋，螺旋的每圈有3.6个氨基酸，螺旋间距离为0.54nm，每个残基沿轴旋转100，上升0.15nm(2)主链原子构成螺旋的主体,侧链在其外部，直径约为0.5nm,-螺旋,左、右手螺旋,(3)每个肽键的羰基氧与远在第四个氨基酸氨基上的氢形成氢键(共形成n-4个氢键)，所有肽键都能参与链内氢键的形成，氢键的方向与中心轴大致平行,具有偶极距，是稳定螺旋的主要作用力,3.613(SN),(4)Pro的N上缺少H，不能形成氢键，经常出现在-螺旋的端头，它
16、改变多肽链的方向并终止螺旋,(2)-折叠(-pleated sheet),三、蛋白质的二级结构,概念：由两条或者多条几乎完全伸展的肽链平行排列，通过链间的氢键交联而成的锯齿状的折叠构象。常为两条或两条以上伸展的多肽链侧向聚集在一起形成扇面状，故又称-折叠片或-片层结构特点：(1)相邻肽键平面的夹角为110，呈锯齿状排列；侧链基团交错地分布在片层平面的两侧,()由氢键维持稳定，其方向与折叠的长轴接近垂直,()条肽段平行排列构成，肽段之间可顺向平行(均 从N-C)，也可反向平行,*纤维状蛋白中多存在反平行-折叠，主要在不同肽链之间形成氢键*球蛋白中同时存在平行与反平行-折叠，可以在不同肽链以及同一
17、肽链的不同肽段之间形成氢键,三、蛋白质的二级结构,(3)-转角(-Turn),概念：肽链出现180回折的转角处结构称为-转角结构特点：第一个残基的C=O与第四个残基的N-H形成氢键，常见于连接反平行-折叠片的端头(如Gly与Pro)，多位于球状蛋白质分子表面，约占全部残基的四分之一,烫发的生化基础(-角蛋白的变化),*角蛋白亚基由富含-螺旋的中央棒状区和两侧的非螺旋区构成(角蛋白-初原纤维-微原纤维-大原纤维),*角蛋白具有良好的伸缩性能，毛发纤维在湿热时可以拉长到原有长度的两倍，由螺旋转变为构象,*角蛋白相邻分子的螺旋由Cys残基间的二硫键交联，作为使纤维复原的恢复力,原有卷发,涂还原剂、加
18、热,涂氧化剂、冷却,新的卷发,三、蛋白质的二级结构,(4)无规卷曲（Random coil）,概念：没有确定规律性的肽键构象特点：常见于球状蛋白质分子中，在其它类型二级结构肽段之间起连接作用，有利于整条肽链盘曲折叠,蛋白质二级结构总结,多肽链折叠的规则方式,超二级结构,超二级结构(Supersecondary Structure,Motif)是指若干相邻的二级结构中的构象单元彼此相互作用，形成有规则的，在空间上能辨认的二级结构组合体。是蛋白质二级结构至三级结构层次的一种过渡态构象层次 在多数情况下，只有非极性残基侧链参与构成超二级结构的相互作用，而极性残基多在分子的外表面,常见的超二级结构1、
19、（复绕-螺旋）2、（曲折和希腊钥匙拓扑结构）3、,超二级结构(motif),超二级结构,-花式,-loop-花式,-loop-花式,结构域,结构域(Domain)是球状蛋白质的折叠单位，多肽链在二级结构和超二级结构的基础上进一步曲折叠成紧密的近似球形的结构，具有部分生物功能。对于较大的蛋白质分子或亚基，多肽链往往由两个以上结构域缔合而成三级结构,结构域的特点（结构上）：结构域通常是几个超二级结构的组合，对于较小的蛋白质分子，结构域与三级结构等同，即这些蛋白为单结构域；较大的蛋白质分子或亚基往往由两个以上结构域缔合而成三级结构,结构域一般由100200个氨基酸残基组成，但大小范围可达 40400
20、 个残基。氨基酸可以是连续的，也可以是不连续的结构域之间常形成裂隙，比较松散，往往是蛋白质优先被水解的部位。结构域之间由“铰链区”相连，使分子构象有一定的柔性。,结构域,结构域的特点（功能上）：通过结构域之间的相对运动，使蛋白质分子实现一定的生物功能。酶的活性中心往往位于两个结构域的界面上 在蛋白质分子内，结构域可作为结构单位进行相对独立的运动，水解出来后仍能维持稳定的结构，甚至保留某些生物活性,结构域,三、蛋白质的三级结构(Tertiary structure),概念：蛋白质分子中所有原子(包括主链和侧链)在三维空间的排列分布，又称为空间结构、三维结构、构象,维系蛋白质结构的作用力,1.肽键
21、,共价键,2.二硫键,共价键,3.次级键,非共价键,维系蛋白质空间结构,维系蛋白质一级结构,维系蛋白质三级结构,次级键的种类：,氢键、疏水相互作用、离子键和范德华力,稳定蛋白质三维结构的作用力,a 盐键（离子键）b 氢键 c 疏水作用 d 范德华力e 二硫键,稳定蛋白质三维结构的作用力,氢键对维持二级结构特别重要 疏水作用对维持三级结构特别重要 这些非共价键以量取胜，它们不仅稳定了蛋白质的三维结构，对蛋白质的功能也有重要影响作用,稳定蛋白质三维结构的作用力,疏水核：疏水区多位于分子内部，往往 是与辅酶/基或底物结合的位点,维持蛋白质三级结构稳定的因素,亲水区：亲水区多位于分子表面，故球 形蛋白
22、质水溶性较好,蛋白质三级结构的其它特点：许多在一级结构上相差很远的氨基酸碱基在三级结构上相距很近。三级结构是蛋白质发挥生物活性所必须的。所有具有高度生物学活性的蛋白质几乎都是球状蛋白。球状蛋白的三级结构很密实，大部分的水分子从球形蛋白的核心中被排出，这使得极性基团间以及非极性基团间的相互用成为可能。,蛋白质的三级结构,许多蛋白质是由两个或两个以上独立的球状蛋白质通过非共价键结合成的多聚体，称为寡聚蛋白。寡聚蛋白中的每个独立的球状蛋白质称为亚基（subunit），亚基一般由一条肽链构成，也称为单体（monomer）。蛋白质的四级结构是指亚基的种类、数量以及各个亚基在寡聚蛋白质中的空间排布和亚基间
23、的相互作用。,四、蛋白质的四级结构(Quaternary structure),蛋白质的四级结构,四级结构的特点亚基单独存在时无生物活性，只有相互聚合成特定构象时才具有完整的生物活性亚基之间以非共价键结合，容易彼此解离一级结构规定了亚基间的结合方式，四级结构的形成遵从“自我装配”的原则大多数寡聚蛋白质分子的亚基的排列是对称的，对称性是四级结构蛋白质最重要的性质之一,四、蛋白质的四级结构,测定蛋白质在溶液中的整体或部分构象,荧光光谱,紫外差吸收光谱,近紫外圆二色性光谱,蛋白质分子全部空间结构的测定,X射线晶体衍射,多维核磁共振方法(NMR),蛋白质构象的研究方法,五、蛋白质的理化性质,蛋白质与多
24、肽的区别：分子量、空间结构 当多肽的分子量大到足够具有一定的空间结构时就称为蛋白质蛋白质的两性电离和等电点蛋白质的胶体性质蛋白质的沉淀反应,变性是指蛋白质受物理或化学因素的影响，使蛋白质分子原有的特定的空间结构发生改变，从而导致蛋白质性质的改变以及生物活性的丧失 肽链从紧密有序结构松散无序的结构,蛋白质的变性(denaturation）,变性因素：化学：酸、碱、有机溶剂、蛋白变性剂（尿素、盐酸 胍）、重金属盐等 物理：加热、紫外线、X-射线、超声波、剧烈震荡等,五、蛋白质的理化性质,变性蛋白质的主要特征,蛋白质分子中的次级键断裂，构象破坏，但不涉及共价键的破坏，一级结构不变，一些侧链基团暴露，
25、可滴定基团增加生物活性全部或部分丧失一些物理化学性质的改变：变性蛋白质的溶解度常降低、粘度增加而扩散系数减小生化性质的改变：变性蛋白质容易消化,概念：除去变性因素后，有的变性蛋白 质又可恢复其天然构象和生物活 性，这一现象称为蛋白质的复性,蛋白质的复性(renaturation),变性的可逆性,六、蛋白质的结构与功能,蛋白质的一级结构决定其空间结构蛋白质的空间结构决定其特定的生物功能氨基酸一级结构的改变可以导致蛋白功能的改变和丧失,蛋白质分子结构与功能的关系,蛋白质分子具有多样的生物学功能，需要一定的化学结构，还需要一定的空间构象,（一）蛋白质一级结构与功能的关系,1.种属差异,蛋白质一级结构
26、的种属差异十分明显，但相同部分氨基酸对蛋白质的功能起决定作用。根据蛋白质结构上的差异，可以断定它们在亲缘关系上的远近,2.分子病,蛋白质分子一级结构的氨基酸排列顺序与正常有所不同的遗传病,一级结构与功能的关系,一级结构的变异与分子病 1 2 3 4 5 6 7 8HbA:N Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-LysHbS:N Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Lys(链),正常的红细胞（左图）与镰刀状红细胞（右图）的区别,血红蛋白单个（2个）氨基酸的改变影响功能：Hb S链第六位谷氨酸突变为缬氨酸。谷氨酸：亲水、带负电荷；缬氨酸：疏水、不带电 Hb
27、S分子表面多了一个疏水侧链 Hb S分子三维结构发生改变,镰刀型红细胞贫血的分子基础,HbA:Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-LysHbS:Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Lys链 1 2 3 4 5 6 7 8,结果：荷负电的Glu变为疏水性的Val，使HbS分子表面的负电荷减少，亲水基团变为疏水基团，使HbS分子聚合，溶解度降低，红细胞变形，呈镰刀状，并易于破裂溶血治疗：体外，氰酸钾(KCNO)共价修饰链N端Val残基，使亲水性增加，可防止HbS分子间的缔和,蛋白质结构与功能的关系,肌红蛋白的结构与功能 肌红蛋白的功能为储存氧气，原因为它能结
28、合和释放氧气（与氧气的可逆结合）,O2的结合改变了肌红蛋白的构象，构象的改变影响肌红蛋白的生物功能O2与亚铁离子的结合 O2的结合使亚铁离子的位置与卟啉环平面的关系发生改变 这一改变通过His F8进一步影响蛋白质的亚基构象和亚基之间的相互作用（肌红蛋白的两个半分子彼此滑移）肌红蛋白的构象态由T态（与O2的亲和力低）变为R态（与O2的亲和力高）。,蛋白质空间结构与功能的关系,CaM的基本性质,148个残基 分子量16700 Da,CaM的一级结构,CaM的三级结构,蛋白质结构与功能的关系,+Ca2+,+MLCK,CaM与靶酶的构象,CaM结合Ca2+以及小肽后的构象变化,apoCaM,Ca-CaM,Ca-CaM-MLCK,蛋白质结构与功能的关系,蛋白质化学作业,1、举例说明氨基酸的反应类型2、蛋白质的酸水解和碱水解分别得到哪些氨基酸，各有何特点？3、举例说明蛋白质结构与功能的关系（包括一级结构、高级结构与功能的关系）。4、说明蛋白质一级结构测定的内容和方法5、什么是蛋白质的变性？变性的机制是什么？举例说明蛋白质变性在实践中的应用。名词解释 等电点（pI）肽键和肽链 一级结构 二级结构 构型与构象 三级结构 超二级结构 结构域 蛋白质变性与复性 分子病,
