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1、第6章 食品安全学,6.1食品安全学原理,食品安全的概念“民以食为天”，饮食是人类生存发展的第一需要。“病从口入”，饮食不卫生、不安全，又是百病之源。随着我国城乡经济的发展，食品数量与种类日益丰富，同时，随着科学技术的发展，各种农药、兽残及添加剂在食品生产中的广泛应用、各种新技术在食品工业中的渗透，使得我国食品的质量与安全性的问题也日益突出。深入认识食品安全问题的诸多方面，理顺影响食品安全链条上的各种关系，建立保证食品安全的有效监控管理体系，是包括生产者、消费者、经营者和管理者在内的全社会的重要课题。,食品安全的历史问题回顾,早在古罗马时代食品交易中就出现了制伪、掺假、掺毒和欺诈现象。中世纪的
2、英国为解决石膏掺入面粉、出售变质肉类等事件，在1266年颁布了面包法。18世纪中叶英国杜松子酒中查出掺假物有：浓硫酸、杏仁油、石灰水等。直到1960年，英国通过了新的食品法，再次对食品安全加强控制。20世纪对食品安全影响最为突出的事件，当推有机合成农药的发明、大量生产和使用。包括滴滴涕、六六六在内的有机氯农药的广泛应用。20世纪末叶，新的致病微生物引起食物中毒，畜牧业中滥用兽药、抗生素、激素类物质的副作用，食品的核素污染以及英国疯牛病事件，都是有代表性的。,食品安全的现代问题展现,社会的发展提出了在达到温饱以后如何解决吃得好、吃得安全的要求。食品安全问题就是在这种背景下提出的，而且涉及的内容也
3、越来越广，并且因国家、地区、和人群的不同而有不同的侧重。以下是英国（1993）对当代发达和较发达社会或国家提出的一张饮食风险清单：（1）营养过剩或营养失衡；（2）酗酒；（3）微生物污染；（4）环境污染物（包括核污染）；（5）自然产生的食品毒素；（6）农药及其他农用化学品残留物；（7）兽用药物残留；（8）包装残留污染；（9）食品添加剂和饲料添加剂,（10）新开发食品及新工艺产品（如生物技术食品、辐照处理食品等）；（11）其他化学物质引起的饮食风险（如工业事故污染食品）。此外，假冒伪劣食品（劣质、掺杂毒物异物等）在食品安全问题中也占有重要地位。以上可归纳为现代食品安全的六大类问题，即营养失控、微生
4、物致病、自然毒素、环境污染物、人为加入食物链的有害化学物质和其他不确定的饮食风险。,食品安全的监控,1）建立和完善确保食品安全的社会管理体系（1）就食品安全进行完整的立法。（2）对食品生产和供应系统所用的各类化学品，建立严格的药物管理体制。（3）对食源性疾病风险实行环境全过程控制。（4）采用绿色的或可持续的生产技术，生产对人与环境无害的安全食品。（5）建立健全市场食品安全的检验制度，加强执法，保障人民安全。,2）消费者的自我保护 在食品安全问题上，消费者自我保护的重要性基于以下几个原因：其一，食品的安全性只是解决人类食物问题的一个方面，尽管它是社会进步的重要标志，但并非在任何时间地点条件下都会
5、受到足够的重视和保障，从而使得某些食品风险问题将长期存在。其二，食品安全状况在很大程度上取决于市场对更安全食品的需求和对不安全食品的排斥即市场的导向，这与消费者的选择有重大关系。其三，不安全食品对消费者造成的损害，最终是通过消费过程发生的。,食品安全现状,国外食品安全问题和趋势 从1986年到2000年12月，英国发现了约18万宗疯牛病个案。在1992年达到高峰期，发现个案逾37000宗。1998年2月，比利时爆发“二噁英污染鸡事件”。,中国食品安全的现状,1）国内主要食品安全事件,今年来年国内重大食品安全事件1、2011年4月17日，沈阳警方端掉一黑豆芽加工点，该加工点在生产豆芽过程中添加了
6、4种以上违法添加剂。此外，警方还发现尿素、恩诺沙星、6-苄氨基腺嘌呤、无根剂等违法添加剂。验。毒豆芽是一种对人体有害的豆芽，它外表看似新鲜，但是至少含4种违法添加剂，尿素超标27倍。（沈阳“毒豆芽”）2、2011年4月15日,湖北省宜昌市查获两个使用硫磺熏制“毒生姜”的窝点。“毒生姜”使用有毒化工原料硫磺对生姜进行熏制,使正常情况下视觉不够美观的生姜变得娇黄嫩脆。（毒生姜）3、2011年4月初，消费主张节目指出，在上海市浦东区的一些华联超市和联华超市的主食专柜都在销售同一个公司生产的三种馒头，高庄馒头、玉米馒头和黑米馒头。这些染色馒头的生产日期随便更改，食用过多会对人体造成伤害。而后,温州等地
7、也发现类似染色馒头。染色馒头是通过回收馒头再加上着色剂而做出来的。（染色馒头）4、2011年3月15日，据央视报道每周质量报告的315节目“健美猪”真相报道，河南孟州等地养猪场采用违禁动物药品“瘦肉精”饲养，有毒猪肉部分流向河南双汇集团下属分公司济源双汇食品有限公司。“十八道检验、十八个放心”的字样随处可见，但却不包括“瘦肉精”检测。“瘦肉精”属于肾上腺类神经兴奋剂“瘦肉精”肉可致人患瘤。（“瘦肉精”事件）,5、2010年12月底，一位读者爆料称，现在的火锅多是“化学锅”。“不仅很多涮品用了添加剂，火锅底里更是包含了多种化学添加剂。”化学锅，又称化学火锅。主要由火锅飘香剂、辣椒精和火锅红等化学
8、添加剂勾兑而成火锅底料。（化学火锅）6、2009年1月22日，三鹿“三聚氰胺奶粉”案终审宣判。自08年7月始，全国各地陆续收治婴儿泌尿系统结石患者多达1000余人，9月11日，卫生部调查证实这是由于三鹿集团生产婴幼儿配方奶粉受三聚氰胺污染所致。（三鹿“三聚氰胺奶粉”案）7、2006年11月12日，由河北某禽蛋加工厂生产的一些“红心咸鸭蛋”在北京被检测出含有致癌物质苏丹红。部分河北农户用添加了工业染料苏丹红的饲料喂养鸭子，导致蛋黄内含有苏丹红，以致全北京市范围内停售河北产“红心”咸鸭蛋。华中农业大学教授也研究证实：天然红芯鸭蛋的红色成分也是天然虾青素（苏丹红鸡蛋）8、2004年4月30日，“大头
9、娃娃”事件曝光，安徽省阜阳市查处一家劣质奶粉厂。该厂生产的劣质奶粉几乎完全没有营养，致使13名婴儿死亡，近200名婴儿患上严重营养不良症。（“大头娃娃”事件）,2）影响我国食品安全的因素,A.生物性污染 食品的生物性污染包括微生物、寄生虫、昆虫及病毒的污染。微生物污染主要有细菌与细菌毒素。B.化学性污染 我国食品的化学性污染主要是农药和兽药残留重金属、食品添加剂、食品容器、包装材料污染等。,C.转基因食品 1998年8月，英国罗维特研究所普特斯泰教授发现老鼠食用转基因土豆后免疫系统受到破坏。2000年德国耶拿大学科学家格哈德雅莱斯等研究发现用转基因玉米制成饲料喂养鸡群，结果肌肉里存在玉米变异基
10、因片段。对转基因食品安全性问题不容回避，亦应警示公众。基因工程食品与传统食品有其不同之处，可能含有目前尚未明了的不利健康因子。,D.其他 受我国经济发展水平不均衡的制约，一些食品生产经营企业规模化、集约化程度不高，自身管理水平仍然偏低，这也给食品卫生带来隐患。,食品安全研究进展,国外食品安全发展概况1）检验检测技术 检验检测能力是左右一个国家食品安全工作水平的关键。为此，各国的食品安全控制系统无不把发展检测技术和方法置于优先地位。2）检测体系建设 在食源疾病监测方面，目前，发达国家开始利用所设置的哨点对食源性疾病开展主动监测。）,3）危险性评估技术 危险性评估是WTO和国际食品法典委员会（CA
11、C）强调的用于制定食品安全技术措施（法律、法规和标准及进出口食品的监督管理措施）的必要技术手段，也是仲裁贸易纠纷的重要手段和依据。4）食品供应过程安全控制技术 对“从农田到餐桌”的全过程进行控制已经成为食品安全控制的基本理念。国外已经成功探索出了一些模式。目前，最为成功的模式是“危害分析及关键控制点”（HACCP）体系。另外，“良好农业规范”（GAP）、“良好兽医规范”（GVP）、“良好生产规范”（GMP）、“良好卫生规范”（GHP）、“标准卫生操作程序”（SSOP）也是比较成功的。1997年CAC大会通过了HACCP应用系统及其应用准则，并号召各国应积极推广应用。,我国食品安全科技取得的进
12、展,1）危险性评估技术已经迈出步伐2）食源性危害检测技术已经有了一定的基础 A.化学污染方面 农药残留方面，已经能在大米、茶叶、果汁等食品中同时检测100种农药；成功研制了有机磷农药快速检测试剂条；取得一批农药残留的抗体。在兽药残留方面，农业部门已经建立了两个兽药残留国家基准实验室，已经发展了近50 种单个兽药在饲料和动物源性食品中残留的检测方法。,生物毒素检测方面，我国已经成功研制出黄曲霉毒素B1的酶联免疫吸附测定方法和试剂盒、常见食品中毒物快速检测箱；获得了一批生物毒素检测抗体；也开发出了一批藻类污染毒素的检测方法。在有害有机物的检测技术方面，我国已建立了国际公认的二噁英检测方法，并获得了
13、我国二噁英膳食暴露水平数据；在疯牛病检测方面，卫生部门和国家质量监督检验检疫总局已初步建立了一些检测技术。,B.微生物污染方面 目前，我国人畜共患病检测技术已经取得了突破，研制出了采用聚合酶链式反应（PCR）快速检测禽及禽产品中新城疫、禽流感等病毒的方法，是过去用常规检测方法检测周期有21天缩短到4h左右。,3）食品安全控制技术模式已经开始得到应用,目前我国已建立了以HACCP、良好生产规范（GMP）、良好卫生规范（GHP）、全面目标的卫生操作程序（SSOP）等基本原理为基础的主要农产品加工全程质量控制体系，并结合生产企业建立了许多个示范样板。示范区以市场为导向，政府、科技界、产业界紧密合作，
14、对食品实行“从农田到餐桌”全程监管，并取得了明显的成效。,我国现有科技体系与安全监管需要不相适应,1）未全面采用与国际接轨的危险性评估技术 2）我国现行食源性危害关键检测技术仍然比 较落后 3）我国安全食品过程控制技术还比较落后 4）食品安全控制体系在我国尚未得到广泛应用,6.2食源性危害检测技术,农药残留检测技术 前处理新技术主要有：自动索氏提取（ASE）、固相萃取（SPE）、固相微萃取（SPME）、超临界流体萃取（SPE）等。检测新技术主要有：超临界流体色谱（SFC）、毛细管曲带电泳（CZE）、免疫分析（IA）、液谱质谱联机（LC-MS）、传感器技术、直接光谱分析技术、实验室机器人等也开始
15、得到广泛应用。,我国农药残留分析常用的检测技术,1）色谱技术（1）薄层色谱法（thin layer chromatography，TLC)是以固体吸附剂（如硅胶、氧化铝等）为载体，水为固定相溶剂，流动相一般为有机溶剂所组合的分配型层析分离分析方法。优点：不需要特殊设备和试剂，且方法简便、快速、重现性好，可满足食品中有机氯农药残留定量检测的要求。缺点：灵敏度不高。,（2）纸色谱 可以进行有机氯农残的半定量测定，与国家标准方法薄层色谱法相比无显著差异。具有方法简单、操作方便、快速，灵敏度高、干扰少等特点。（3）气相色谱法（GC）是应用最多的方法，占有关色谱法报道的70%以上。具有高选择性、高分离效
16、能、高灵敏度、快速等优点。适用于易气化，气化后又不发生分解等现象的农药均可采用气相色谱法。,（4）液相色谱法（HPLC）近年来，采用高效色谱柱、高压泵、和高灵敏度的检测器、柱前或柱后衍生化技术以及计算机连用等，大大提高了液相色谱的检测效率、灵敏度、速度和操作自动化程度。现已成为农药残留检测不可缺少的重要方法。其缺点是溶剂消耗量大，检测器种类较气谱少，灵敏度不如气谱高，液谱柱制备较气谱柱困难，价格也贵。,（5）色-质联用技术 色-质联用技术包括气象色谱-质谱联用（GC-MS）和液相色谱-质谱联用技术。一般将其划为残留速测技术当中的一种手段。尤其适合于多残留分析。特点是应用于农药代谢物、降解物的检
17、测和多残留检测等具有突出的特点，但由于仪器昂贵，目前在国内尚未广泛应用于农药残留量检测工作。,2）电化学方法,电化学分析方法是一种快速、灵敏、准确的微量和痕量分析方法。极谱法具有设备简单、操作简便快速等特点，尤其是样品前处理上可简化许多步骤，适用于现场检测，但需特殊的选择电极，应用受到一定限制。,农药残留检测新技术,1）超临界流体色谱（SFE）SCF就是以超临界流体作为色谱流动相的色谱。可以使用各种类型的较长色谱柱；可在较低温度下分析相对分子质量较大、对热不稳定的化合物和极性较强的化合物；可与各种气象高效液相色谱检测其匹配；可与红外质谱联用；可以通过调节压力、温度、流动相组成多重梯度，选择最佳
18、色谱条件。SFC综合利用了气象色谱和高效液相色谱的优点，克服了各自的缺点。,SFC主要流程包括:高压流动相输送系统、色谱分离系统和检测系统三个部分。,2）毛细管区带电泳（CZE）,毛细管区带电泳是对一般常规液相色谱方法难以分离的离子型化合物的理想分析方法。特别适合于分离常规液谱难以分离的离子型化合物。优点：具有简单、快速、成本低、高效、所需样品量极少，一般只需几纳升（nL）。不足：毛细管区带电泳尚缺乏灵敏度很高的检测器。,3）免疫分析技术,免疫分析法（IA）是将免疫反应与现代测试手段相结合而建立的超微量测定技术。是生物酶技术、荧光光谱技术、辐射技术和免疫分析技术应用于农药残留分析领域的一门新技
19、术。是基于抗原和抗体之间的特异性识别和结合反应为基础的一种微量分析方法。原理:农药是半抗原，一般不具备抗原性不能刺激动物产生免疫反应，需先将该小分子通过与一定碳链长度、大分子的载体蛋白质（通常使用牛血清白蛋白、兔血清白蛋白、卵清蛋白）以共价键相偶联制备成人工抗原，是动物产生免疫反应，产生式别该农药并与之特异性结合的抗体。再通过对半抗原或抗体进行标记（酶、荧光物质、放射性核等），利用标记物的生物、物理、化学放大作用，对样品中的特定农药残留进行定性或定量检测。,A.荧光免疫测定法（FIA）此法是将抗血清、待测农药、荧光标记的待测农药混合在聚苯乙烯管中，经培育后加入-球蛋白和相对分子质量为6000的
20、聚乙二醇，使与之结合的待测农药和荧光标记的农药沉淀下来；未被测的荧光标记的农药留在上清夜中。当抗血清与荧光标记农药的量一定时，含待测农药多的试管中，抗体结合的荧光标记农药少，上清液中游离的荧光标记的农药就多。即待测物含量与游离的荧光标记物含量成正比，测定上清液的荧光强度，即可算出待测物含量。,B.酶免疫测试法（EIA）优点：酶免疫法具有特异性强、灵敏度高、方便快速、分析容量大、分析成本低、安全可靠等。局限性：如开发过程需要投入较多的资金和时间，得到一个好的抗原并不容易，对试剂的选择性高，很难同时分析多种成分，对结构类似的化合物有一定的交叉反应。,根据其特点和步骤分为酶联免疫吸附测定（ELISA
21、）和酶放大免疫测试法（EMIT）(1)酶联免疫吸附测定 该法利用酶标记抗体或抗原，通过对抗原与抗体之间的ELISA反应依靠比色法来确定农药的残留量。优点:特异性强、灵敏度高、快速、廉价、不需繁琐的预处理已成为现场分析的首选方法。缺点:制备抗体较困难，可能会出现假阳性或假阴性现象。,(2)酶放大免疫测试法 基本原理：是用特定的酶标记待测农药，然后将抗体、酶标记农药、待测农药同时加入反应试管中进行竞争反映。酶标记的待测农药与抗体结合后，酶被抑制而失去活性。样本中待测农药越多，则游离的未被抑制的酶也越多，根据吸附反应后酶活性的改变可以测定出农药含量。该法缺点就是每一种待测农药都必须进行酶标记，限制了
22、该法的推广运用。,C.放射免疫测定法,原理：它是将抗血清与待测农药在试管中培育一定时间后，加入同位素标记的待测农药，该同位素标记农药即和待测农药竞争与抗体发生结合反应，采用适当的方法将被抗体结合的和未被抗体结合的标记农药分离，未被抗体结合的放射性标记农药留在溶液中。待测农药含量越大，则标记农药被抗体结合的量就越少，游离的标记农药就越多，溶液中的放射强度就越大。待测农药的含量与反应后溶液中的放射强度成正比，根据放射强度就可得出待测物含量。该法不适于大批样品的常规检测，但样品制备简单，植株样品可直接用乙酸乙酯提取、旋转蒸发器浓缩，比液相色谱（LC）简单，分析速度约为后者的五倍。,D.流动注射免疫分
23、析（FIIA）,流动注射免疫分析是由免疫分析与流动注射系统相结合而形成的。在农药残留分析中是较为先进的技术，抗农药的抗体固定在可更换柱芯的膜上。基本原理：用泵将农药样品液流过膜，清洗后再将酶标的半抗原过膜，膜经过数次清洗，将生成的底物泵过柱，检测有色的产物，检测信号与农药的浓度成反比。,4）直接光谱分析技术,近红外衰减全反射光谱和表面增强拉曼光谱是光谱分析的灵敏度提高102 107倍。这些快速、直接的光谱技术只需极少量的样品，具有很大的反应潜力。还有激光光谱技术，如激光拉曼光谱可使光谱分析的灵敏度几乎达到极限一个分子或原子水平。该技术只需要极少量的样品，几乎不需要样品预处理，这将为开发高灵敏度
24、的检测器提供可能的技术基础，具有很大的应用潜力。,5）传感器技术,生物传感器是由一种生物敏感膜和电化学转化器两部分紧密配合，对特定种类的化学物质或生物活性具有选择性和可逆响应的分析装置。按生物功能可分为酶传感器（包括电位型和电流型）、免疫传感器、微生物传感器。优点：具有微型化、响应速度快、样品用量少并可以插入生物组织或细胞内的特点。缺点:主要存在结果的不稳定、难重现性和使用寿命短的问题。采用电导型生物传感器可以测定食品中有机磷农药甲基马拉松、乙基马拉松、敌百虫、二乙丙基磷酸等,6）酶抑制技术,酶抑制技术是利用有机磷、氨基甲酸酯类农药对胆碱酯酶的活性抑制作用而建立起来的用于分析此类农药在食品中的
25、残留量的技术。近年来，国内外在此技术上进行了大量的研究。利用纸片或电极作为载体将酶吸附，并制成速测箱，是一种快速、灵敏和经济的现场检测手段。,7）实验室机器人,实验室机器人现已商品化，但在农药残留量分析和环境监测方面的应用还处于起步阶段，主要是因为机器人工作程序的变更缺乏灵活性和实验室检测方法缺乏标准化所造成。另外机器人系统动作缓慢，一般要求宽阔的空间。当实验室机器人变得更方便、灵活、实验方法也更加标准化时，它的使用将会增加。,兽药残留检测技术,近年来食品中兽药残留分析的发展方向：（1）是由单一品种分析向多品种分析发展；（2）向待测样品制备和前处理的微量化、自动化、无毒化、快速化和低成本方向发
26、展。用于检测、定量分析和确证动物性产品是否存在残留的检测手段包括：薄层色谱法（TLC）、气相色谱法（GC）、气相色谱与质谱联用法（GC-MS）、高效液相色谱法（HPLC）、液相色谱与质谱联用法（LC-MS）、放射免疫测定法（RIA）以及生物自显影法。,兽药残留快速检测方法,兽药残留分析技术是复杂混合物中的痕量分析技术，现代兽药分析方法通常包括样品的前处理（提取、净化、浓缩和衍生化）和测定两部分。目前国内外兽药监控检测所使用的现场快速检测方法主要有：酶联免疫试剂盒或试纸条、抗生素快速筛选法（FAST）、快速涂抹实验（STOP）和磺胺现场实验法（SOS）等。,1）抗生素快速筛选法,该方法是由兽医或
27、选派的检验员在屠宰场对牲畜中的抗生素或磺胺类进行快速筛选检验。如果结果显阴性，产品可被放行。如果结果显阳性，组织样品（肌肉、肝、肾）要送到实验室进行分析实验。畜体要扣留到实验结果发出。,2）快速涂抹实验,该方法是工厂检验员对可疑动物进行厂内试验的一种快速方法。通常是对母牛的抗生素残留进行实验，阳性样品的畜体要扣留到实验室的确认结果发出。,3）磺胺现场实验法,磺胺现场实验法是FSIS开发的针对猪中磺胺类残留问题的测定方法，主要用于尿中磺胺的测定。对于所有的SOS测定阳性产品，实验室将利用组织进行确证。以上快速方法在美国残留监控的实施中起着非常重要的作用，被称为FSIS特殊计划。其主要特点是监控样
28、品量大、快速，是整个残留监控数据信息的基础。,4）免疫检测技术（IA）,免疫检测技术是利用抗体和抗原在体外的特异性反应建立起来的检测技术。酶免疫测定技术使用酶标记，避免了放射免疫分析方法的放射性污染和标记物稳定性问题。其中ELISA操作简便、灵敏，可使得痕量的药残分析成为普通实验室的常规技术，而且可同时检测数十个上百个样品，是十分理想的大批量样品中药残的快速筛选手段。国外的兽药残留免疫检测多用单克隆抗体，而国内多数还只停留在多克隆抗体水平。单克隆抗体在灵敏度和交叉反应方面都优于多克隆抗体，且均一性、专一性和无限量供应性等特点，有利于标准化。,多残留组分检测技术,药物多组分残留检测方法又分为多残
29、留分析方法（可同时分析多种不同类化合物，如包括有机氯、有机磷、拟除虫菊酯等的方法）和选择性多残留检测方法（指分析一类化合物如有机磷等的方法）。,高效液相色谱法（HPLC）HPLC在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，实现了操作自动化；但需要昂贵的仪器，操作繁琐，需处理样品，成本高，检测一个样大约需一天时间，成本120元。磺胺类药物（SA）被广泛用作饲料添加剂，已成为残留问题最严重的兽药之一，目前HPLC是SA残留测定的最主要方法。,HPLC所用的检测其主要有以下4种：（1）紫外分光光度（UV）检测器（左图）,（2）荧光检测器（右图）,（3）电化学检测器（左图）,（4）质谱仪检测器（
30、右图）,气相色谱-质谱联用技术,气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）是将气相色谱仪和质谱仪串联成为一个整机使用的的检测技术。特点：它既具有气相色谱高分离性能，又具有质谱准确鉴定化合物结构的特点，可达到及时定性和定量的检测、减少干扰物的影响和提高仪器的灵敏度的目的。适用于农药代谢物、降解物的检测和多残留检测。,有机磷、有机氯类等农药用有机溶剂提取，再经液液分配等步骤除去干扰物质，用气相色谱带火焰光度检测器（FPD）或电子捕获检测器检测，根据色谱的保留时间定性，外标法定量，可实现对其中的残留物进行一次多残留组分的检测。,液相色谱-质谱联用技术,液相色谱的分析能力与质谱检测器的丰富信息与高灵敏度使采
31、用质谱检测器作为HPLC检测手段的液质连用技术成为目前发展最迅速的分析手段之一。液质联用系统是残留分析理想的检测手段。,大部分农药可用GC-MS检测，但对极性或热不稳定性太强的农药及其代谢物不适用（如灭菌丹、利谷隆、黄草消等），可采用高效液相色谱-质谱法来检测。LC-MS既发挥了色谱法的高分析能力，又发挥了质谱法的高鉴别能力。这种技术适用于多组分混合物中未知组分的定性鉴定。LC-MS对简单的样品可进行分析前净化并具有几乎通用的多残留分析能力，用于对初级检测呈阳性反应的样品进行在线确证，其优势明显，但其仪器价格昂贵，液相色谱和质谱技术尚不十分成熟。,免疫分析法,与经典的色谱和质谱法相比，免疫分析
32、法（IA）避免了上述缺点，IA中目前应用较多的是ELISA法，该法多采用多克隆抗体，交叉反应率高，常用于多残留的检测，另外可以针对一类药物的共同结构设计抗原，然后得到针对该结构的特异性抗体，以此抗体为基础制作的试剂盒可以针对含有特征结构的该药物进行特异性检测。再多组分分析中，更简单的方法是采用混合型固定相SPE,可以使用混合键合相硅胶（通常具有疏水和离子交换两种集团），或将两种填料混合装柱，分离机只取决于pH和淋洗溶剂。该法操作简便，可以净化很小体积的样品，溶剂用量少、选择性高、速度快、可实现自动化。不会发生乳化，净化中引入的杂质少，是很有前景的处理方法。,建立药物残留分析技术是有效控制动物性
33、产品中药物残留的关键措施。因此，未来首先发展简单、快速、准确、灵敏和便携化的筛选性多残留分析技术；发展高效、高灵敏的联用技术，如LC-MS，CZE-MS；分析过程自动化或智能化，以提高分析效率，降低成本。,现代分子生物学检测技术,随着分子生物学和分子化学的飞速发展，对病原微生物的鉴定已不再局限于对它的外部形态结构及生理特性等一般检验上，而是从分子生物学上研究生物大分子，特别是核酸结构及其组成部分。由于技术具有特异性强、灵敏度高和快速准确的优点，因而发展迅速，应用范围越来越广。不仅用于基因表达调控、基因克隆与测序、制备特异探针、特异基因筛选、等基础研究，而且在医学、农业科学、食品科学、环境科学及
34、考古学等领域得到了实际应用。,原理及技术,原理：PCR即聚合酶链式反应的简称。是依据DNA模板的特点，模仿体内的复制过程，在体外适合条件下，以单链DNA为模板，以人工设计与合成的寡核苷酸为引物，利用热稳定的DNA聚合酶3方向掺入单核苷酸来特异性地扩增DNA片段的技术。,步骤：整个反应过程通常有2040个PCR循环组成，每个PCR循环有高温变性低温负性适温延伸三个步骤组成。高温时，DNA变性，氢键打开，双键变成单键，作为DNA扩增的模板；低温时，寡核苷酸引物与单链DNA模板特异性地互补结合即复性；然后在适宜的温度下，DNA聚合酶以单链DNA为模板，延5向3方向掺入核苷酸，使引物延伸合成模板的合成
35、链，经过多个变性复性延伸的PCR循环，就使得DNA片段得到有效的扩增。,1）用于食品样品中致病菌的检测,PCR技术与传统检测食品中致病菌的方法相比，可用PCR扩增其相应的DNA片段，来快速、灵敏地检测样品中是否存在某些细菌或致病菌，尤其是那些人工无法培养的微生物。PCR反应体系包括4各要素：核苷酸单体、能结合上DNA的酶、靶DNA和引物。利用PCR检测食品中的致病菌，首先要抽提靶DNA，通过离心或过滤的方法可以从样品中获得细菌细胞，然后将细胞裂解，进行核酸纯化，使其适合做PCR。用PCR仪可以使DNA链在短短几个小时增加到几百万个。PCR技术在食品检测过程中已受到广泛的关注，虽然还仅仅是起步，
36、但其前景看好。,2）用于生活饮用水中指示细菌的检测,水质的检测是以检测大肠杆菌和人类粪便中污染的大肠杆菌为依据。传统的检测方法是将细菌和要检测的能利用乳糖的革兰氏阴性菌一起培养，检测方法繁琐，需花费几天时间。,若根据大肠杆菌类能利用-半乳糖苷酶，采用明确的底物进行检测，则可以更加迅速地检测到大肠杆菌类。然而有一些大肠杆菌品系并不表达-葡萄糖醛酸苷酶（u id），因此偶尔也会出现检测的失败。而PCR技术为检测-半乳糖苷酶（L ac）和葡萄糖醛酸苷酶基因提供了一个更加灵敏和特异性更强的方法。通过PCR扩增l ac Z和 u id A基因，即可分别检验出水样中大肠杆菌类和大肠杆菌。一般用扩增的l a
37、c Z作为活体选择培养方法能检测同种大肠杆菌类，用扩增的u id A 则能够检测出一种大肠杆菌和志贺氏菌属，而且对那些u id A表型为阳性的大肠杆菌和志贺氏菌，用PCR方法也能检测出来，因而PCR方法更加灵敏。此外，由于PCR反应能够在几个小时内完成，故水源在使用前利用PCR来检测指示细菌安全性更高。,3）聚合酶链式反应技术应用于转基因食品的检测,转基因食品是利用基因重组技术，将某些生物的基因转移到其他物种中，改变生物的遗传物质，使其在性状、营养物质和品质等方面朝着人类需要的目标转变，获得全新特性的生物。包括转基因动物、植物、微生物。以转基因生物为直接食品或原料加工生产的食品即为转基因食品。
38、,基于特异性DNA片段的PCR检测技术，特异性DNA片段包括外源启动子、终止子、报告基因和目的基因。一般来说，PCR法可将食品中残存的DNA增幅到100万倍以上，检出灵敏度高，但操作不当易产生假阳性现象。A.PCR定性筛选检测方法 PCR定性筛选检测方法的一般程序：提取食品中的DNA设计与待测特异DNA片段相适的引物对待测DNA片段进行PCR扩增用琼脂糖凝胶电泳分离扩增的DNA片段，EB染色后，分析鉴定转移基因成分。,PCR定性检测假阳性结果的消除。由于PCR技术比较严格，高灵敏性以及实验室的遗留污染，在日常的转基因食品中常出现假阳性结果。目前在转基因食品检测中主要以CaMV35S启动子和NO
39、S终止子作为检测目标，来判断食品中是否含有转基因成分。多重PCR法 多重PCR法可同时针对几个靶位点进行PCR检测技术。应用多重PCR技术同时对35S和NOS进行检测，该技术不仅提高了效率，而且由于是对双组份同时检测，其结果也更为可信。,B.定量PCR检测方法 目前国外较为成熟的方法主要有：定量竞争PCR和实时PCR法 定量检测方法的实用性:各国转基因食品管理法相继出台，对标签制度要求的转基因成分的最低限量有所规定，因而定量检测较定性检测更显的必要。但是目前的定量检测方法很少对技术和仪器设备要求很高，难以推广。,基因芯片,基因芯片又称DNA/c DNA芯片或c DNA微阵列。基因芯片技术原理：
40、是根据分子生物学中成熟的核酸分子原位杂交技术，即DNA的碱基配对和序列互补原则，将大量探针分子固定于大约12大小的芯片上，然后与标记的样品杂交，通过检测杂交信号的强弱判定样品中靶分子的数量。,基因芯片技术可分解为各主要部分：阵列的构建和印制、探针靶的制备、杂交和检测、数据收集与分析。特点：此技术可以对大量的DNA或分子进行检测分析，大大提高检测效率和精确性。该方法整个过程仅需小时，操作简便，结果准确，适用于大豆、马铃薯、玉米等作物及食品的检测与验证。存在的问题：首先是基因高效扩增易造成产物的交叉污染；其次是不能进行基因定量检测。,探针技术,DNA探针实质上一种具有单一螺旋结构的DNA，其核酸通
41、过碱基对可以同具有互补顺序的另一条多核苷酸（靶DNA）杂交。其方法就是在探针和靶DNA之间碱基配对基础上个建立起来的基因方法。它能为食品生产过程的控制、卫生管理、防止交叉污染、原始材料及中间产品的及时处理等提供有力的信息保证。,DNA探针使用方法分为3类：第一类：短针法。如果DNA靶序列已知，就可以用自动化学分析法将要判定的DNA多核苷酸互补、标识。第二类是应用于总的胞内DNA探针法。这种方法要先提取然后用生物化学方法标识，它一般不能用于区别相似的、关系密切的生物，因为它们具有许多相似的DNA序列。上述两种方法都比较简单，费用也相对比较便宜。,第三类方法是采用DNA重组克隆技术。其基本过程是首
42、先将DNA从由酶重组后的目标物中提取出来，然后进行克隆，当他们大量繁殖后即被收集起来标识，在筛选出目标DNA，已决定杂交关系。采用克隆杂交法进行微生物分析的步骤为:让细菌在有琼脂的培养皿上形成克隆体；无菌膜复制在皿上，从克隆体中获取细胞形成替代皿；设法将膜上的细胞DNA双螺旋链打开，释放出单一DNA链，然后DNA链被固定；与DNA探针互补配对，具有靶序列的微生物马上可被鉴别、计数。,DNA探针、DNA芯片技术在食品工业中的应用已成为新的研究领域。这种高新技术的产业化还需要大量的时间和大量的资金投入。随着我国对高新技术的重视和投入的加大，DNA探针和DNA芯片技术将会普遍应用于食品生产、商品流通
43、、质量监督、海关商检等领域部门中的食品安全监测，针对生产中的育种、防虫、提高产品质量的高效和专一的DNA探针也会很快面世。,6.3 食品污染与控,微生物污染与控制微生物污染概念 生物性污染是指微生物、寄生虫、昆虫等生物对食品的污染。在食品的加工，储存，运输、销售直到食用整个过程中，每一个环节都有可能受到生物污染，危害人体健康。,6.3.1.2 微生物污染的来源、分类及危害,1).食品污染的分类：,2）污染食品的危害：1.急性中毒 2.慢性中毒 3.致突变作用 4.致畸作用 5.致癌作用3）食品污染途径（1）原辅料污染。（2）生产加工过程污染（3）包装、储存、销售中污染。（4）人为污染（5）意外
44、污染,6.3.1.3 细菌性污染,细菌是单细胞原核生物，根据其形态分为球菌，杆菌和螺旋菌。再根据其大小、排列方式、内部构造和生理、生态等特征加以区分。用细菌制造食品带来有益方面，但是也有无益方面。,1）引起食物中毒的细菌：沙门氏菌，金黄色葡萄球菌，志贺氏菌，大肠杆菌等2）细菌引起的人畜共患病 在脊椎动物与人之间自然传播的疾病和感染称为人畜共患病。如:炭疽病、结核病、布氏杆菌病等。,沙门氏菌,志贺氏菌,6.3.1.4 真菌及其毒素的污染 真菌是微生物中的高级生物，它们既有无性繁殖器官（无性孢子），还具有有性繁殖器官（有性孢子），在自然界中广泛存在。一些真菌广泛应用于食品工业，如酿酒、制浆、面包制
45、造等。但有些真菌也通过食品给人体的健康带来危害。1）霉菌与食物中毒 霉菌是一些丝状真菌的通称。凡是生长在营养基质上形成绒毛状、蜘蛛网状菌丝的真菌。,2)防止霉菌毒素中毒的措施 1，选用抗病品种 2，作物收获时要及时晒干、脱粒 3，粮食的储存管理 4，食品加工前应测定毒素含量 5，不吃霉变食品 3）真菌引起的人畜共患病 1，新型隐球酵母菌 2，荚膜组织胞浆菌病 3，曲霉菌病 4，假丝酵母病,6.3.2 化学物质污染及其控制兽药残留1）基本概念（1）兽药：用于预防、治疗、诊断畜禽等动物疾病，有目的地调节生理机能并规定作用、用途、用法和用量的物质（2）兽药残留：食品动物用药后，任何可食动物源性产品中
46、含有的原型药物或其代谢产物以及与兽药有关的杂质的残留。（3）残留总量：指对食品动物用药后，任何可食动物源性产品中某种药物残留的原型药物或全部代谢产物的总和。（4）最大残留限量：对食品动物用药后产生的允许存在于食物表面或内部的该兽药残留的最高量/浓度,（5）休药期：又称停药期。食品动物用药后产生的允许存在于食物表面或内部的该兽药残留的最高量/浓度。（6）动物饲料添加剂：指预防、治疗动物疾病而掺入载体或者稀释剂的兽药的预混料，包括抗球虫药类、驱虫剂类、抑菌促生长类等 2）食品中兽药残留的来源与原因（1）畜禽防病治病用药（2）饲料添加剂中兽药的使用。为了预防某些动物疫病，在饲料中常常人为地加入一些药
47、物（3）食物保鲜中引入药物。（4）无意带入的污染。,3）主要兽药残留对人体的危害 A.抗微生物药。包括抗生素和合成抗菌药物，主要用于防止动物传染性疾病和改进动物生产性能。在畜牧、家禽、水产养殖中，抗生素的使用十分普遍。(1)毒性、致敏性与超过敏反应。抗生素和磺胺类残留造成牛奶和食品的污染可以对人体引起有害的过敏反应（2）增加革兰氏阴性杆菌的致病性。若长期使用抗生素作为畜禽饲料药物添加剂，可以使某些细菌菌株突变为耐药菌株，对抗生素有抗性。（3）改变肠道菌群的微生态环境。抗生素的使用，不仅是人畜肠道中具有抗生素抗性的细菌增加，同时可以杀灭或,B.抗寄生虫剂 是指能够杀灭或驱除体内、体外寄生虫的药物
48、，包括驱虫剂和抗球虫剂等。我国还使用某些有机磷农药（如敌百虫、敌敌畏、哈罗松、驱虫磷等）可以用于动物饲养中舍中杀虫。但这也可能同时造成动物性食品的有机磷残留和其他农药残留问题。C.激素与其他生长促进剂 促生长激素，人工合成的、具有同化作用的增强剂。D.控制动物性食品中兽药残留的措施（1）禁止使用的兽药、在饲料中添加的治疗药物。,（2）允许使用的兽药和饲料添加剂必须遵守安全休药期（3）制定动物性食品中兽药的最高残留限量，加强残留检测工作。6.3.2.2 农药残留 在食品、农产品或饲料的生产、储存、运输分配及加工过程中，用于防止、破坏、引诱、排拒和控制任何昆虫和病菌，还包括有毒的动植物或控制动物的
49、外寄生虫的所有物质通称为农药，但不包括肥料、动植物营养素、食品添加剂及动物用药品。根据化学组成不同分为有机氯类、有机磷类、氨基甲酸酯类、沙蚕毒素类、拟除虫菊酯类、有机汞类等.,施用的农药，对粮、油、菜、果及禽畜产品上或多或少存在的农药及衍生物以及具有毒理学意义的杂质等，谓之为农药残留。1）食品中农药残留的来源和危害 A.施药后直接污染 B.从环境中吸收 C.通过食物链污染 D.其他途径。如：1.加工和储运中污染 2.意外污染 3.非农用杀虫剂污染 E.危害 急性中毒，慢性中毒，特殊毒性。,2）控制食品中农药残留的措施 A.加强农药管理 1997年颁布了农药管理条例，规定农药的登级和监督管理工作
50、主要归属农业行政主管部门，并实行农药登记制度，农药生产许可证制度、产品检验合格证制度和农药经营许可证制度。未经登记的农药不准用于生产、进口、销售和使用。B.合理安全使用农药。早在1982年，我国就颁布了农药安全使用规定，将农药分为高、中、低毒三类，规定额各种农药的使用范围。农药安全使用标准（GB4285）和农药合理使用准则规定了常用农药所适用的作物、防治对象、施药时间、最,高使用剂量、稀释倍数、施药方法和安全间隔期用药，以保证农产品中农药残留量不超过食品卫生标准中规定的最大残留限量标准。C.制定和完善农药残留限量标准 D.食品中农药残留的消除 6.3.2.3 重金属与其他微量元素 1）重金属的
