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1、embryo baby,细胞增殖是细胞生命活动的基本特征之一,第十二章 细胞增殖及其调控,细胞增殖(cell proliferation):亲代细胞(mother cell)经物质准备，细胞分裂（cell division）产生子代细胞(daughter cell)的过程。,细胞增殖的方式,细胞增殖是通过细胞周期（cell cycle）来实现,细胞周期的有序运行是通过相关基因的严格监视和调控来保证,第十二章 细胞增殖及其调控,第一节 基本概念,第三节 细胞周期调控,第二节 细 胞 分 裂,细胞生物学教程(cell biology),第一节 基本概念,一、细胞周期,三、细胞同步化,二、细胞周期检
2、验点,连续分裂的细胞从上次细胞分裂(cell division)结束开始，经过物质积累过程，直到本次细胞分裂结束为止所经历的过程。,一、细胞周期,准确地复制DNA；合成细胞结构和功能性物质；建立有关细胞分裂的结构和信息传递机制；细胞核和细胞质分裂。,细胞周期时相,G1-S-G2-M,细胞周期长短测定,TC TG1 TS TG2 TM TC-TG1小鼠食道上皮 87 75 7.2 4.1 0.7 12小鼠腹壁上皮 151 139 6.2 5.3 0.5 12 人大肠粘膜 24 10 11.5 2 0.5 14 人宫颈癌 20 8 6.8 4.5 1.5 12人羊膜 19.4 9.8 6.8 2.
3、2 0.6 9.6大鼠肝 47.5 28 16 1.8 1.7 15.5人肺成纤维细胞 16.8 6 6 4 0.8 10.8,不同细胞的TC差别很大；TC与 TG1的变化一致,TC长短差异决定于TG1;TS+TG2+TM 值比较稳定,约12-24小时；TM 较短,约1小时左右。,2001年诺贝尔生理学/医学奖,Leland H.Hartwell发现了控制细胞周期的基因，其中被称为“START”的基因对控制各个细胞周期的最初阶段具有决定性的作用。Paul M.Nurse发现了CDK.R.Tim Hunt发现了调节CDK的功能物质周期蛋白.,用3H-TDR对测定细胞脉冲标记、定时取材，利用放射自
4、显影技术显示标记细胞，通过统计标记的有丝分裂期（M期）细胞百分数（PLM），来测定细胞周期。,脉冲标记有丝分裂百分率 PLM(percentage mitoses)法,待测细胞经3H-TDR标记后，所有S期细胞的DNA均被标记。置换无标记培养液。S期细胞经G2期才进入M期，所以一段时间内PLM=0。开始出现标记M期细胞时，表示处于S期最晚阶段的细胞，已渡过G2期，所以从PLM=0到出现PLM的时间间隔为TG2。S期细胞逐渐进入M期，PLM上升，到达到最高点的时候说明来自处于S最晚阶段的细胞，已完成M，将进入G1期。所以从开始出现PLM到PLM达到最高点（100%）及所持续的时间时间就是TM。当
5、PLM开始下降时，表明处于S期最早阶段的细胞也已进入M期，所以出现（TG2）PLM到PLM又开始下降（TG2+TS）的一段时间等于TS。从PLM出现到下一次PLM出现的时间间隔就等于TC。根据TC=TG1+TS+TG2+TM即可求出的TG1长度。,早,中,晚,T,PLM,注意：在实际工作中，由于各种因素的影响，PLM的最大值达不到1。为减少误差，常采用半高度法读数。,流式细胞仪分析细胞周期,利用流式细胞仪（FCM）对处于快速流动的单列细胞或生物颗粒进行多参数、快速（每秒可达1000-10000个）的定量分析和分选（纯度可达99%以上）。,标本流动系统激光系统信号处理系统放大系统计算机系统,流式
6、细胞仪PI（碘化丙锭）染色法分析细胞周期,PI与细胞内DNA结合（RNA已被消化）后，细胞的荧光强度直接反映了细胞内DNA含量的多少，通过流式细胞仪对细胞内DNA的含量及在不同时间内的变化进行检测时，可以分析不同细胞周期时相各细胞亚群比例和细胞周期时间长短。,PI标记的细胞周期时相分析,G1,S,G2,二、细胞周期检验点,G1期检测点(限制点 restriction,R点）：DNA损伤检验点。S期检测点：DNA复制检验点。G2/M检测点：DNA损伤检验点。中-后期检测点：纺锤体组装检验点。,真核生物细胞周期中决定细胞能否进入下一个时相的监控点,是细胞周期中存在的一种反馈调节机制。,通过1期限制
7、点的调节，1期细胞可有三种去向：,周期性细胞(cycling cell),G0期细胞：有些细胞会暂时离开细胞周期，停止细胞分裂，进入G0期，去执行某种生物功能或进行细胞分化。一旦得到信号指示，会快速返回细胞周期，分裂增殖。多发生在G1期。,三、细胞同步化,选择同步法(selection synchrony)有丝分裂抖落法 密度梯度离心法,诱导同步法(induction synchrony)DNA合成阻断法 分裂中期阻断法,自然同步化,某些受精卵早期卵裂,在自然过程中发生或经人为处理造成的使整个细胞群体共同进入细胞周期同一时相的现象。,物理方法,化学方法,Fruit fly embryo,优点：
8、操作简单，同步化程度高，细胞不受药物伤害。,M期细胞与培养皿的附着性低，振荡脱离器壁收集。,缺点：获得的细胞数量较少。,有丝分裂抖落法：,DNA合成阻断法,选用DNA合成的抑制剂，可逆地抑制DNA合成。常用TDR双阻断法。,优点：同步化程度高缺点：产生非均衡生长，个别细胞体积增大。,思考：对TS TG1TG2 TM细胞能否适用此法？,T阻 TG1TG2 TM,TST释 TG1TG2 TM,运行,抑制,释放,抑制,一、有丝分裂(mitosis),二、减数分裂(Meiosis),第二节 细 胞 分 裂,一、有丝分裂(mitosis),1.前期(prophase)2.前中期(premetaphase
9、)3.中期(metaphase)4.后期(anaphase)5.末期(telophase),6.胞质分裂(Cytokinesis),染色质凝缩（起始）,1.前期(prophase),细胞骨架解聚,PCC(提早集缩染色体),G2期PCC为双线染色体,G1期PCC为单线状,DNA未复制,S期PCC为粉末状,正在复制的DNA容易受损伤，是DNA断裂的结果,说明DNA复制已完成。,将处于分裂期(M期)的细胞与处于细胞周期其他阶段的细胞融合,使其他期细胞的染色质提早包装成染色体。,2.前中期(premetaphase),核膜消失（起始）纺锤体形成染色体往赤道面排列（结束）,中心粒,星体微管,极微管（连续
10、丝）,横桥（分子马达蛋白）,动粒微管,动粒,纺锤体形成（动粒微管+极微管）,有丝分裂器(临时性细胞器),3.中期(metaphase),所有染色体排列到赤道板(equatorial plate)；,纺锤体检查点(Mad2、Bub1等染色体动粒蛋白构成),染色体排列机制,牵拉平衡假说,外推平衡假说,动粒微管的延伸所产生的牵拉作用.,星体产生的排斥作用,4.后期(anaphase),姊妹染色单体分开,(2)后期B:极微管在正端聚合而延长，两极间距离逐渐增长；,(1)后期A:动粒微管在动粒端（正端）解聚而缩短，拉动染色单体移向两极；,后期A动粒微管的缩短,中期动粒微管的动态稳定,1.驱动蛋白在重叠区
11、从负极走向正极使极微管向 相反方向滑动,2.动力蛋白与星体和两端的细胞膜结合，从正极走向微管负极，朝细胞两极牵拉星体微管。,后期B纺锤体变长的动力来源,5.末期(telophase),子染色体到达两极,核膜的解体与重建,早末期,磷酸化,动物细胞胞质分裂,形成分裂沟,植物细胞胞质分裂,形成细胞板,二、减数分裂(Meiosis),1.减数分裂主要是发生在生殖细胞产生的某个阶段；2.遗传物质只复制一次，细胞连续分裂两次，导致染色体数目减半；3.减数分裂前间期的S期持续时间较长，少量DNA没有复制；4.前期变化复杂，同源染色体配对、联会、重组，产生遗传多样性；5.减数分裂时间较长。,减数分裂(meio
12、sis),减数分裂的 第一次分裂,与有丝分裂相似,间期,G1 S G2,合成大部分DNA，而不是全部,减数分裂的 第二次分裂,（间期）,偶线期同源染色体配对，称为联会(synapsis)；,联会复合体（SC）,SC由两条同源染色体沿纵轴形成，外观呈梯子状。SC主要由碱性蛋白质和RNA组成，并含有少量DNA。SC 上有重组节是交换发生的部位。SC在细线期开始装配，形成于偶线期，成熟于粗线期，消失于双线期。,同源染色体联会时的交换和交叉,双线期二价体,第三节 细胞周期调控,一、周期蛋白（cyclin）,二、Cdk与Cyclin-Cdk复合物,三、Cdk抑制物(CDKI),一、周期蛋白,特点：,周期
13、蛋白的降解,参与细胞周期调控的蛋白，其浓度在细胞周期中呈周期性变化。含有一段约100个氨基酸的保守序列，称为周期蛋白框。,激活不同时期周期蛋白依赖性蛋白激酶（Cdk），引导Cdk作用于不同底物。,作用：,类型：,泛素介导的cylinA、B的降解，调控细胞分裂的进程。,周期蛋白调节Cdk的激酶活性,细胞周期蛋白的种类及其特点,E1,泛素活化酶,泛素转移酶,泛素连接酶,E2,E3,促后期复合物(APC),二、Cdk与周期蛋白-Cdk复合物(CdkC),周期蛋白-Cdk复合物的多样性,Cdk活性随周期蛋白（Cyclic）浓度变化而变化,哺乳动物细胞内至少存从Cdk1（Cdc2）至Cdk12共12种C
14、dk,Cyclin-Cdk复合物的多样性,G1 S G2/M Cyclin-Cdk Cyclin-Cdk Cyclin-Cdk芽殖酵母 Cln1,2,3-Cdc28 Clb5,(3,4)-Cdc28 Clb1,2(3,4)-Cdc28裂殖酵母 Cig1-Cdc2 Cig2-Cdc2 Cig13-Cdc2高等真核生物 CyclinD1,2,3-CDK4/6 CyclinA-CDK2 CyclinB-CDK1 CyclinE1,2-CDK2,(MPF),生长因子的刺激下，G1期cyclinD和cyclinE表达，形成G1-CdkC。,pRb被G1-CdkC磷酸化，pRb释放出转录因子E2F。,E2
15、F促使相关基因的转录。（DNA前复制复合体装配）,促进细胞通过R点进入S期。（G1S）,G1-CdkC复合物调控G1/S的转化,G1期完成前复制复合体（pre-RC）的装配（“DNA复制执照因子”）。,S期S-CdkC（cyclinACdk2）将Cdc6磷酸化，触发pre-RC的启动，同时阻止了DNA再次进行复制（S期检测点）,DNA在一个细胞周期仅复制一次！,复制起始点,DNA的复制,思考：用同步化的S期细胞分别与G1期细胞和G2期细胞融合,将产生什么结果,为什么？,催化亚基:Cdc2或Cdk1,调节亚基：CyclinB,M期Cyclin-Cdk复合物（M-CdkC）,MPF=Cyclin
16、B+Cdc2,MPF,Cdk1的调节与活化,活化的MPF可使更多的MPF活化,激酶与磷酸酶的调节,MPF启动细胞从G2期过渡到M期的相关事件，促使G2期M期；激活APC，促使M期由中期向后期过渡。,CAK（CDK活化激酶）将Cdk1磷酸化，能最大激活其活性。,Wee1（CDK抑制激酶）将Cdk1磷酸化，抑制其活性,磷酸酶Cdc25使Cdk1去磷酸化，MPF复合物激活。,保证了MPF能够不断积累，在需要的时候突然释放。,Cdc25和wee1突变分别会使增殖细胞的形态发生什么变化?,思考:,酵母(Schizosaccharomyces pombe)生长到一定阶段后便能进行分裂增殖。一位教授在实验室
17、分离得到两株突变酵母，cdc25-和wee1-,但忘了标记这两株酵母分别是什么突变。根据细胞周期调控的相关知识，你只需用一台普通光学显微镜观察野生型、突变型酵母的增殖形态，便可轻易给这位教授解决这个难题。下图就是显微镜下观察到的三种形态：(1)突变株1和突变株2分别是什么突变？为什么?(2)两株突变酵母的哪一周期时相发生了改变这一时相是变长还是变短？为什么？,MPF使底物蛋白磷酸化,核纤层蛋白磷酸化使核膜解体,将组蛋白H1磷酸化导致染色体凝缩；p60磷酸化，使细胞骨架解聚（纺锤体装配）；GM130磷酸化，内质网和高尔基体片段化；核仁蛋白磷酸化，核仁解体肌球蛋白磷酸化促进胞质分裂,APC（后期促
18、进因子）活性受到多种因素的综合调节,M-Cdk,APC介导靶蛋白（cyclinB和后期抑制因子）与泛素结合降解。,首先,后期抑制因子降解,姐妹染色单体分离,有丝分裂中期向后期转变。,接着,M-CdkC降解,细胞退出M 期进入下一个细胞周期。,三、CDK抑制物(CDKI),对细胞周期起负调控作用。,已知有7个蛋白激酶抑制物p21,p27,p57,p15,p16,p18,p19,抑制Cyclin-Cdk复合物的装配或活性，而将细胞阻止在不同的检验点。,DNA受损后P53蛋白的活化诱导P21的表达抑制G1-CdkC和 S-CdkC 细胞将停留于 Checkpoint DNA修复或者细胞衰老凋亡。,P21参与DNA损伤检验点（G1期检测点、G2/M期检测点）的作用.,p27抑制G1-CdkC活性，促进细胞离开原来的周期，加入分化。,细胞增殖与分化或凋亡的平衡依靠P27蛋白的适度表达。,三类周期蛋白-Cdk复合物和三个关键的过渡对细胞周期的控制,
