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1、第三章 细胞生物学研究方法,西南大学生命科学学院冯全义,主要内容,第一节 细胞形态结构的观察方法第二节 细胞组分的分析方法第三节 细胞培养细胞工程与显微操作技术,第一节 细胞形态结构的观察方法,一 光学显微镜技术1、根据光源不同，可分为:1）、光学显微镜：以可见光（或紫外光）为光源2）、电子显微镜：以电子束为光源,光学显微镜和电子显微镜下的细胞结构,2、分辨率(resolution),R=0.61/n Sinn=介质的折射率；空气为1.油为1.5=样品对物镜角孔径的半角；sin的最大值为1=照明光源的波长0.61是一个恒定的参数；表示成像的点虽被重叠但仍能被区别的程度分辨率概念：是指能区分两个
2、物点间最小距离的能力分辨距离越小，分辨率越高，即分辨细微结构的能力越大提高分辨能力的方法：改变n：n越大；R越小；分辨能力好改变：越小；R越小；分辨能力好,2、放大率,最终成像的大小与原物体大小的比值总放大率=物镜放大率目镜放大率例如：目镜10X；物镜40X；则总放大率400X注意分辨率与放大率的区分,电子显微镜与光学显微镜的基本区别,3、普通光学显微镜构成,照明系统：光源、聚光器光学放大系统：物镜、目镜组成；为了消除球差和色差机械装置：用于固定材料和观察方便 双筒显微镜：亮度较单筒暗；双眼观察立体感较单筒强,双筒显微镜,单筒显微镜,（二）、荧光显微镜(fluorescence microsc
3、ope),1、工作原理：利用紫外线光源(如弧光灯、水银灯等发出)通过照明设备把切片或活染细胞透视出来 1）自发荧光细胞中有些物质（如叶绿素等）紫外线照射后可发荧光2）诱发荧光一些物质紫外线照射后不能发荧光，但如果用荧光染料或荧光抗体染色后，经紫外线照射亦可发荧光,荧光显微镜照片（微管呈绿色、微丝红色、核蓝色）,2、荧光显微镜和普通显微镜的区别,1）照明方式：通常为落射式，即光源通过物镜投射于样品上2）光源：为紫外光，波长较短，分辨力高3）特殊的滤光镜系统片激发滤色镜（exciter filter）：光源前的用以滤除不需要的光线 UV（紫外）；V（紫）；B（蓝）；G（绿）阻断滤色镜（barrie
4、r filter）：目镜和物镜之间的用于滤除紫外线，保护眼睛,落射式照明原理,荧光显微镜的光通路,尼康E800荧光显微镜,其它类型的显微镜,（三）、激光共聚焦扫描显微境(laser confocal scanning microscope)用激光作扫描光源，逐点、逐行、逐面扫描成像 分辨力较高，是普通光镜的3倍,激光共聚焦扫描显微镜,LCSM照片蓝色为细胞核，绿色为微管,（四）、暗视野显微镜,暗视野显微镜(dark field microscope)用特殊的聚光器使照明光线不能进入物镜被放大在黑暗的背景下呈现明亮的像反差增大，分辨率提高观察未经染色的活体或胶体粒子,（五）、相差显微镜,相差显微
5、镜（phasecontrast microscope）荷兰人Zernike1932年发明，获1953年诺贝尔物理奖作用：可观察未经染色的标本和活细胞基本原理：把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，而提高结构间的对比度,入射光环,（六）、偏光显微镜（polarizing microscope）检测有双折射性的物质，如纤维丝、纺锤体等 光源前有偏振片（起偏器），使进入显微镜的光线为偏振光（七）、微分干涉差显微镜（differential interference contrast microscope）1952年，Nomarski在相差显微镜原理的基础上发明 DIC显微镜又称Nomarski相差显
6、微镜（Nomarki contrast microscope）利用的偏振光;标本可略厚，折射率差别更大 基因注入、核移植、转基因等的显微操作,（八）、倒置显微镜,倒置显微镜特点:物镜与照明系统颠倒 观察培养的活细胞具有相差物镜,莱卡倒置显微镜,一般光学显微镜的样品制备与观察,1、样品的固定(fixation)目的:1)杀死细胞，稳定细胞的化学成份2)使样品在后面的处理和切片时不受到破坏 做法:最简单是直接浸泡在固定液中一般用有缓冲作用的醛类固定液，(甲醛或戊二醛)醛类固定液作用机理：能够与蛋白质的游离氨基形成共价键，而将邻近的蛋白质分子交联一起,2、包埋和切片(embedding and se
7、ctioning)包埋:常用包埋剂:液态的石蜡或树脂使之渗入整块组织，后将之硬化成固体的包埋块切片：切片机切割包埋块，制备成薄切片适用于光学显微镜观察的切片厚度为 l10 m,切片机进行样品切片,3、染色(staining)：目的:给细胞的不同组分带上可区别的颜色特征 一些典型的有机染料 苏木精(hematoxylin):能显示出细胞内核酸的分布伊红(eosin):可使细胞质染色苏丹染料(Sudan dyes)的乙醇饱和溶液:能使脂肪着色4、有些过程需进行脱水处理,二、电子显微镜(electron microscope),1、发明1932年德国人Max Knolls和Ernst Ruska发明
8、第一台电子显微镜,光学显微镜和电子显微镜下的细胞结构,2、电镜分类透射电子显微镜(transmission electron microscope，TEM)扫描电子显微镜(scanning electron microscopy，SEM),光镜与透射电镜的结构,光学显微镜、TEM、SEM成像原理比较,3、透射电子显微镜基本结构,三大部分组成1、电子光学系统(镜筒)：照明系统、样品室、成像系统、观察窗和记录用的照相机等2、真空系统：作用：防止：阴极与阳极之间会放电，灯丝也会因受到氧化或被阳离子轰击而缩短寿命3、电子学系统(供电系统)供电系统，需要高压稳压TEM的分辨力可达0.2nm超薄切片：电子
9、束的穿透力很弱 标本厚度约50nm的超薄切片,4、透射电镜制样技术,1）固定样品：锇酸（OsO4）和戊二醛2）包埋及超薄切片：以环氧树脂包埋，以热膨胀或螺旋推进的方式推进样品切片，切片厚度2050nm3）负染色技术用重金属盐（如磷钨酸、醋酸双氧铀）对铺展在载网上的样品进行染色；吸去染料，样品干燥后 样品凹陷处：薄层重金属盐 样品凸出处：没有染料沉积，而出现负染效果,4）冰冻断裂与冰冻蚀刻技术,1、标本置于-100C的干冰或-196C的液氮中，进行冰冻2、后用冷刀骤然将标本断开，升温后，冰在真空条件下迅即升华，暴露出断面结构，称为蚀刻（etching）3、蚀刻后，向断面以45度角喷涂一层蒸汽铂，
10、再以90度角喷涂一层碳，加强反差和强度4、后用次氯酸钠溶液消化样品，把碳和铂的膜剥下来，此膜即为复膜（replica）5、复膜显示出了标本蚀刻面的形态，在电镜下得到的影像即代表标本中细胞断裂面处的结构,冰冻蚀刻电镜照片,5、扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM，）,1）组成扫描电子显微镜主要由电子光学系统和显示单元组成,2）工作原理：,A：用细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子 次级电子的多少与样品的表面结构有关B：次级电子由探测体收集，并被闪烁器转变为光信号C：再经光电倍增管和放大器转变为电信号来控制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步
11、的扫描图像 图像为立体形象，反映了标本的表面结构,3）标本制作：为了使标本表面发射出次级电子，标本在固定、脱水后，要喷涂上一层重金属微粒，重金属在电子束的轰击下发出次级电子信号目前扫描电镜的分辨力为610nm,（三）、扫描隧道显微镜(scanning tunneling microscope，STM),1、发明IBM公司瑞士苏黎世研究所Binning G.和Rohrer H.等在1981年发明具有原子显像力的显微镜，是根据量子力学中的隧道效应原理而制成的1986年获得了诺贝尔物理学奖,第二节 细胞组分的分析方法,第一部分 细胞分离技术一、离心技术1、应用领域研究如细胞核、线粒体、高尔基体、溶酶
12、体和微体，以及各种大分子基本手段高速离心机：转速为1025Kr/min的离心机转速超速离心机：转速超过25Kr/min，离心力大于89K的离心机,2、离心方法分类,（一）、差速离心（differential centrifugation）（二）、密度梯度离心（density gradient centrifugation）,（一）、差速离心（differential centrifugation）,在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心用于分离不同大小的细胞和细胞器在差速离心中细胞器沉降的顺序依次为：核、线粒体、溶酶体与过氧化物酶体、内质网与高基体、最后为核蛋白体,差速离心的原理,（二）、密度
13、梯度离心,1、（density gradient centrifugation）原理：用一定的介质在管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离2、常用的介质：为氯化铯，蔗糖和多聚蔗糖3、分离活细胞的介质要求：1）能产生密度梯度，且密度高时，粘度不高2）PH中性或易调为中性3）浓度大时渗透压不大4）对细胞无毒4、分为：1）速度沉降（梯度沉降）2）等密度沉降,1、速度沉降（梯度沉降）（velocity sedimentation）1）主要用于：分离 密度相近而大小不等的细胞或细胞器2）要求采用的介质密度较低，介质的最大密度应小于被分
14、离生物颗粒的最小密度生物颗粒（细胞或细器）在十分平缓的密度梯度介质中各自以不同的速度沉降,2、等密度沉降（isopycnic sedimentation）1）适用于：分离密度不等的颗粒2）原理细胞或细胞器在连续梯度的介质中经足够大离心力和足够长时间则沉降或漂浮到与自身密度相等的介质处，从而将不同密度的细胞或细胞器分离3）要求通常在较高密度的介质中进行介质的最高密度应大于被分离组分的最大密度介质的梯度要求较高的陡度，不能太平缓常需要高速或超速离心，离心时间也较长,二、流式细胞术（flow cytometer）,1、用途：单个细胞进行快速定量分析与分选2、基本原理：包在鞘液中的细胞通过高频振荡控制
15、的喷嘴-形成含单个细胞的液滴-在激光束照射下，细胞发出散射光和荧光-经探测器检测，转换为电信号，送入计算机处理，输出统计结果,第二部分：生物化学与分子生物学技术,一、细胞化学技术利用染色剂可同细胞的某种成分发生反应而着色的原理，对某种成分进行定性或定位研究的技术。显示细胞的成分：无机物、醛、蛋白质、糖类、脂类、核酸、酶等（一）、固定：1物理固定：如空气快速干燥、冷冻干燥或直接冷冻切片。2化学固定：如甲醇、乙醇、丙酮、甲醛、戊二醛和锇酸等,（二）、显示方法,1.金属沉淀法：如磷酸酶分解磷酸酯底物后，产物最终生成CoS或PbS有色沉淀，而显示出酶活性2.偶氮偶联法：酚类化合物与偶氮染料结合后可以形
16、成耐晒染料3.Schiff反应：细胞中的醛基可使Schiff试剂中的无色品红变为红色。常用于显示脱氧核糖核酸（Feulgen反应）,4.联苯胺反应：过氧化物酶分解H202，产生新生氧，氧再将无色的联苯胺氧化成联苯胺蓝，进而变成棕色化合物5.普鲁士蓝反应：Fe3与酸性亚铁氰化钾作用，形成普鲁士蓝6.脂溶染色法：苏丹染料溶于脂类而使脂类显色7.茚三酮反应：显示蛋白质,二、免疫细胞化学,1、原理：利用抗体同特定抗原专一结合，对抗原进行定位测定的技术。2、常用的标记物：荧光素和酶 A常用的萤光素：异硫氰酸荧光素、罗丹明等B常用的酶：辣根过氧化物酶，酶与底物发生反应后形成不透明的沉积物，而显示出抗原存在
17、的部位,3、常用方法据抗体与抗原的结合方法分为：1：直接法：是将带有标记的抗体与抗原反应，显示出抗原存在的部位2、间接法：是在抗体抗原初级反应的基础上，再用带标记的次级抗体同初级抗体反应，从而使初级反应得到放大，显示增强,三、显微光谱分析技术,1、原理细胞中有一些成分具有特定的吸收光谱，其都有自己特征性的吸收曲线，利用显微分光光度计对某些成分进行定位、定性，甚至定量测定例如：核酸的吸收波长为260nm蛋白质的吸收波长为280nm。,四、放射自显影术,1、用途研究标记化合物在机体、组织和细胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用机理、作用部位等等 2、原理:将放射性同位素（如14C和3H）标记
18、的化合物导入生物体内-经一段时间后，将标本制成切片或涂片，涂上卤化银乳胶-经放射性曝光，组织中的放射性即可使乳胶感光-然后经过显影、定影处理显示还原的黑色银颗粒-即可得知标本中标记物的准确位置和数量实验室一般常选用14C和3H标记,五、分子杂交技术,1、原理:具有互补核苷酸序列的两条单链核苷酸分子片段，在适当条件下，通过氢键结合，形成DNA-DNA，DNA-RNA或RNA-RNA杂交的双链分子来测定单链分子核苷酸序列间是否有互补关系,（一）、原位杂交（in situ hybridization）用来检测染色体上的特殊DNA序列使用带放射性的DNA探针(或荧光物质)，通过放射自显影来显示位置,人
19、类染色体端粒DNA的荧光原位杂交,(二）、基因克隆(gene cloning)可概括为分、切、连、转、选两个最基本的特点:分子水平上的操作和细胞水平上的表达,DNA的分子操作,六、PCR技术,聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）1、作用:在体外将微量的目标DNA大量扩增2、反应体系：样品DNA引物（primer），是人工合成的一对寡核苷酸链（约15-20个核苷酸）4种dNTP；Tag DNA聚合酶，此酶最适作用温度为7580，但短时间在95下不失活适宜的缓冲体系和适量的Mg2+,3、反应过程：变性：将反应液置于PCR仪中，提高温度（约90-95）使DNA
20、双链解离复性：降温（约60左右）退火，使引物与模板结合；延伸：升温度至70-75，在引物的引导下合成模板单链的互补链，从而形成DNA双链片段；重复上述“变性复性延伸”的过程。经大约2030次循环后，扩增产物中主要是目标DNA,第三节 细胞培养与细胞工程与显微操作技术,1、细胞培养技术（cell culture）是选用最佳体外生存条件对活细胞进行培养和研究的技术2、体外细胞培养的条件：物质营养 生存环境 废物的排除3、细胞培养方式：1）群体培养（mass culture），将含有一定数量细胞的悬液置于培养瓶中，让细胞贴壁生长，汇合后形成均匀的单细胞层2）克隆培养（clonal culture），
21、将高度稀释的游离细胞悬液加入培养瓶中，各个细胞贴壁后，彼此距离较远，经过生长增殖每一个细胞形成一个细胞集落,3、贴壁培养（单层细胞培养）分散的细胞悬浮在培养瓶中很快(就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁，贴壁后的细胞形态形成多态性，呈单层生长单层培养的正常细胞保持接触抑制(contact inhibition)的特性 4、悬浮培养细胞在培养过程中不贴壁，一直悬浮在培养液中生长，如T细胞5、细胞寿命正常细胞培养的世代数有限癌细胞和转化的细胞能无限生长,6、原代培养（primary culture）：从动物机体取出的进行培养的细胞群。原代培养的细胞生长比较缓慢，而且繁殖一定的代数后（一般10代以内）停止生
22、长，需要从更换培养基。7细胞株（cell strain）：从原代培养细胞群中筛选出的具有特定性质或标志的细胞群，能够繁殖50代左右，在培养过程中其特征始终保持。,8、细胞系：原代培养的细胞经首次传代成功后即成细胞系（有的称10代之内的细胞为原代细胞）A:细胞系的生存期有限，称为有限细胞系B:已获无限繁殖能力能持续生存的细胞系，称连续细胞系或无限细胞系 恶性的无限细胞系(癌化细胞)一般称为恶性转化细胞系 永生性而无恶性的细胞系，称无限细胞系或转化细胞系,三种培养,（二）植物细胞培养,1、组织培养：诱发产生愈伤组织，如果条件适宜，可培养出再生植株根据植物细胞的全能性发展起来的利用植物植株的不同组织
23、培养成完整植株方法叶片、茎段、根等都可以通过诱导形成愈伤组织 2、悬浮细胞培养：在愈伤组织培养技术基础上发展起来的一种培养技术。适合于进行产业化大规模细胞培养，制取植物代谢产物,细胞工程,1、细胞融合：通过培养和诱导，两个或多个细胞合并成一个双核或多核细胞的过程称为细胞融合（cell fusion）或细胞杂交（cell hybridization）基因型相同的细胞融合成的杂交细胞称为同核体（homokaryon）；来自不同基因型的杂交细胞则称为异核体（heterokaryon）。2、诱导细胞融合的方法有三种：生物方法（病毒）化学方法（聚乙二醇PEG）物理方法（电融合）,细胞融合,3、单克隆抗体
24、,英国人Kohler和Milstein 1975将两种细胞杂交而创立了单克隆抗体技术，获1984年诺贝尔奖 原理：正常淋巴细胞（如小鼠脾细胞）具有分泌抗体的能力，但不能在体外长期培养瘤细胞（如骨髓瘤）可以在体外长期培养，但不分泌抗体。将两种细胞杂交得到的融合体既有分泌抗体的能力，又有体外长期培养的特性,4、显微操作,显微操作术(micromanipulation)在显微镜下，用显微操作装置对细胞进行解剖手术和微量注射的技术显微操作仪是在显微镜下对细胞进行显微操作的装置，可用于细胞核移植、基因注入、染色体微切和胚胎切割等手术,尼康NT-88NE显微操作/注射仪,显微操作仪 模式图,5、动物细胞核移植克隆技术,1997年，英国苏格兰罗斯林研究所等首次成功利用成年动物彻底分化的体细胞克隆出子代个体I.Wilmut等从成年个体母羊的乳腺组织分离单个乳腺细胞，后与去核的羊的卵细胞融合，克隆得到一头绵羊Dolly“,多利和邦妮,例子 克隆羊,供体细胞:芬兰绵羊乳腺细胞受体细胞:苏格兰绵羊卵细胞移核方法:乳腺细胞与去核卵细 胞电融合发育:羊输卵管内发育之囊移植:植入假孕母羊子宫内 发年育成体,克隆技术的医学价值,1、治疗性克隆：体细胞核移植-培育到囊胚期-从这个囊胚分离ES细胞-体外定向诱导分化成有特定功能的细胞,组织和器官2、生殖性克隆：多个国家禁止,
