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1、第五章多肽导向技术及其应用生物技术的快速发展大大促进了新药发现与设计的速度，但是体 内用药时，如何使药物特异性地到达病灶部位仍然是限制许多药物由 实验室走向临床的一大难题。药物在其它组织或器官的非特异性分 布，不仅增大了体内用药的剂量，使得药物成本提高；而且有可能损 伤正常的组织或器官，引发毒副作用，这种毒副作用有时甚至是致死 的。为了克服这一难题，人们提出了导向性的治疗策略，该策略的 理论基础是相对于正常的组织，病灶部位（特别是肿瘤）具有自己独 特的表面分子，这些分子不仅是相对特异的，而且常常是高表达的， 所以若给药物连接上这些分子的配体或抗体，则借助于这些配体或抗 体和它们相应的分子的结合
2、，药物便可特异性的被带到病灶部位。该 策略被认为是提高药物特异性的有效方法，目前导向性药物的开发在 药物开发领域发展处于邻先地位，仅以美国为例，其导向性药物的开 发以13.2%的年增长率位居全美药物市场的首位。一、多肽导向技术的概念和由来导向性的分子有很多类，如抗体、靶分子的天然配体、肽等，其 中以小分子肽作为导向分子的技术被称为多肽导向技术。最初作为导 向性分子的为抗体，如抗转铁蛋白受体的抗体，抗HER2抗体等与药物 连接后都大大提高了药物在病灶组织的富集侦。但是抗体由于分子 量大在作为导向性分子时有一些缺点，如易引发机体的免疫反应，渗 透性差等，由此人们更倾向于利用小分子肽作为导向性分子。
3、可以作 为导向性分子的肽包括两大类，一类是天然存在的肽，如生长激素释 放抑制因子(somatostatin)、血管活性肠肽(vasoactive intestinal peptide, VIP)等，它们分别在神经内分泌肿瘤、消化道癌等的特异 性诊断和治疗方面发挥了良好的导向性作用E。另一类则是非天然 存在的肽，与天然肽相比，该类肽的种类更多，鉴定更方便，而且有 可能比天然肽与其相应受体的亲和力更高，故该类肽成为近年来人们 关注的热点。噬菌体呈现技术则被认为是用于筛选该类肽的快速而有 效的方法。本文将着重对以噬菌体呈现肽库来源的肽为导向分子的 导向技术进行论述。二、肽库的构建噬菌体呈现技术起源于
4、Smith在1985年报道的将外源多肽在单 链噬菌体表面呈现的结果，其原理是将编码外源多肽或蛋白的基因 片断插入噬菌体衣壳蛋白的基因中，从而将外源多肽或蛋白呈现于 噬菌体表面10。由于构成外源基因片段的脱氧核苷酸可以随机的排 列组合，所以可以构建呈现不同外源多肽或蛋白的噬菌体表面呈现 多肽或蛋白库，进而应用于酶底物的筛选，抗体的筛选，配体的筛 选，蛋白间相互作用的研究，疾病的诊断等方面。近几年来，该技 术迅速发展，已成为生物学研究和应用领域中有效而重要的工具。(一) 用于噬菌体呈现技术的载体可用于噬菌体表面呈现的载体很多，如T4噬菌体、入噬菌体及丝 状噬菌体等。与丝状噬菌体相比，T4噬菌体和入
5、噬菌体作为呈现载体 有一些优点：第一两者均为烈性噬菌体，它们通过裂解宿主菌的方式 得以释放，这样一些难以穿过细菌细胞膜的蛋白，如球状蛋白、疏水 性的肽和蛋白等就可以呈现在噬菌体表面；而对于丝状噬菌体而言， 其衣壳蛋白的组装是在细菌的质周腔中完成的，从而限定了其所呈现 的肽和蛋白必须是能够穿越细菌细胞膜到达质周腔的。第二，T4噬菌 体和入噬菌体可以用于呈现高拷贝的外源分子，而且对外源分子的大 小限制较小。第三，T4噬菌体和入噬菌体可以比较方便的用于外源蛋 白的C-端呈现。目前T4噬菌体和入噬菌体呈现系统发展很快，但是丝 状噬菌体呈现系统依然是构建肽库的首选载体，这是因为首先由于丁4 噬菌体和入噬
6、菌体呈现的蛋白是在细菌的细胞内完成的，而细胞内还 原性的环境无法形成二硫键，呈现的外源蛋白全部是缺少二硫键的， 这样就提高了蛋白错误折叠的可能。而如前所述，丝状噬菌体呈现外 源蛋白的组装是在质周腔中完成的，质周腔中氧化性的环境为二硫键 的形成提供了条件，从而保证了外源蛋白折叠的准确性。第二，T4 噬菌体和入噬菌体的基因组大，比较复杂，操作比较麻烦，而丝状噬 菌体的基因组较小，操作起来很方便。第三，T4噬菌体和入噬菌体呈 现系统必须进行DNA的亚克隆才能在蛋白水平上进行分析。正是由于 这些原因，丝状噬菌体呈现系统仍然是目前最常用，发展最快的呈现 系统。(二) 丝状噬菌体呈现系统的特点丝状噬菌体是
7、一类具有丝杆状形态的噬菌体，在分类中属于丝杆噬菌体科(Inoviride),丝状噬菌体属(Inovirus)。用于表面呈 现的噬菌体为一类特异性感染大肠杆菌的噬菌体，包括M13、fd、fl、 Ifl和Ike等。它们具有相似的结构。以M13噬菌体为例，它的核心 为6000bp的环状单链DNA,含10个基因，分别编码10种不同的蛋 白。其中基因VIII编码主要衣壳蛋白pVIII,基因III,VI,VII,IX 分别编码次要衣壳蛋白pIII、pVI、pVII、pIX。M13噬菌体以其次 要衣壳蛋白pIII仅感染具F纤毛的大肠杆菌11。丝状噬菌体自身有许多适于构建多肽库的特点。如它能够接受 在衣壳蛋白
8、中插入外源多肽，并将外源蛋白表达后呈现于病毒颗粒 表面，便于被相应的受体或抗体识别。即使外源序列干扰病毒的生 活周期，也能通过双基因或噬菌粒系统将多肽表达于表面，产生携 带野生型和重组衣壳蛋白的嵌合噬菌体。易于扩增，重组后的噬菌 体能够通过感染大肠杆菌得到扩增。对于筛选到的能够特异性结合 某一靶分子的多肽噬菌体也能够再感染大肠杆菌，扩增后测序分析 其核苷酸序列。噬菌体在各种洗脱条件（如低pH）下仍然很稳定， 可以感染形成很高的滴度（一般达到1012），这样高的滴度足以代表 库中所有的克隆12。（三）丝状噬菌体呈现系统的呈现方式常用于丝状噬菌体表面呈现的是衣壳蛋白pIII或pVIII。pIII
9、是衣壳蛋白中最大的蛋白，位于噬菌体的最尾端，其C末端锚定在 内膜上，N末端游离在外。它识别并结合大肠杆菌的F纤毛，其用于 呈现时最大的特点是对外源蛋白或多肽的大小无严格限制，大至 50kD的蛋白已被成功呈现a。由于pIII的拷倍数只有3-5个，可 筛选高亲和力的抗原决定簇，故常为呈现的首选蛋白，但在免疫学和生物疫苗的研究中受到限制。用pVIII呈现的外源分子在无任何 佐剂的情况下就能刺激生物体产生较强的免疫学反应，且其拷贝数 多达2700个左右，因此可用于筛选亲和力较低的抗体，但小分子量 的pVIII不能容纳多于6个氨基酸的外源多肽，这一点限制了外源 多肽与pVIII的融合15。高拷贝pVII
10、I在疫苗开发中具有潜在的应 用价值。最初人们只是简单的将外源蛋白的编码基因插入噬菌体的衣壳 蛋白中，这样所有的pIII或pVIII均为非野生型的蛋白，这种呈现 方式被称为3型和8型（图1）。但是由于衣壳蛋白对噬菌体正常生 理功能的发挥很重要，特别是pIII蛋白对噬菌体识别并结合宿主菌 密切相关，如果pIII或pVIII全部用于呈现外源蛋白，则必然影响 噬菌体的生理功能，为了克服这一缺点，人们又设计了 33型、88型、 3+3型和8+8型这几种呈现方式（图1）。33型和88型是指噬菌体的 基因组中含有两种衣壳蛋白的基因，一种编码野生型的衣壳蛋白， 一种则编码呈现了外源蛋白的衣壳蛋白。如果噬菌体的
11、基因组中仅 含编码野生型的衣壳蛋白的基因，而用噬菌粒携带编码呈现了外源 蛋白的衣壳蛋白的基因，则这种呈现方式称为3+3型或8+8型。33 型、88型、3+3型和8+8型的噬菌体的衣壳蛋白中及含有野生型的 蛋白壳，又含有呈现了外源蛋白的衣壳蛋白，这样即呈现了外源蛋 白，同时又保持了噬菌体的天然功能Mo在呈现外源分子时，人们常用N末端呈现法，但这并不意味着C 末端呈现不重要。恰恰相反，在有些情况下必须用到C末端呈现， 例如研究那些需要游离C末端的蛋白与蛋白间的相互作用。除此之外，C末端呈现对于呈现细胞内蛋白也很重要，噬菌体组装前，pIII 和pVIII以它们的C末端滞留在大肠杆菌的内膜上，它们的N
12、末端 则在质周腔内17有些分泌性的蛋白需要在氧化性的环境中才能很 好的折叠，质周腔的环境正好提供这一条件。但对于那些需要在还 原性的环境中才能很好折叠的蛋白，则必须用C末端呈现使外源蛋 白位于还原性的胞内环境才能满足其要求18。选，从而使阳性噬菌体得到进一步富集。严谨性和产率（stingency 和yield）是两个评定筛选效率的主要参数。一般而言增加前者往往 会导致后者的降低us。目前常用的筛选方法可分为两类，一类是体 内筛选，一类是体内筛选。（一）体外筛选当纯化的靶蛋白易于获得或高表达靶蛋白的细胞易于获得时， 人们常常选用体外筛选法来对噬菌体文库进行筛选。该方法的基本 流程为首先将筛选配基
13、固定在固相载体上，然后加入噬菌体文库。 其中呈现了与配基结合肽的噬菌体被捕获于固相载体上，而不与配 基结合的噬菌体则被洗去。再用洗脱液洗脱结合的噬菌体并感染大 肠杆菌得以扩增，扩增后的噬菌体进入下一轮循环。亲和配基的固 定可采用许多种固相支持物，如表面吸附的聚丙乙烯皿或管，硝酸 纤维膜和磁性珠，可渗透的珠状琼脂糖凝胶等。洗脱的方法也有多 种，常用的有低pH的缓冲液洗脱法和用配基的已知配体与噬菌体竞 争的竞争洗脱法。以下列举了一些体外筛选法获得的多肽（表一）。表一体外筛选获得的异性结合肽靶分子/靶细胞结合的肽生物学评价参考文献人转铁蛋白受体（humanHAIYPRH,THRPPMWSPVWP高亲
14、和力（亲和力达1.5x10-8M）地与高表达hTfR的细胞结合，并且可以介导大分子的内化。20transferrinreceptor,hTfR)a vP 1整合素VSWFSHRYSPYSPFAVS可以与a vp 1整合素结合21黑皮质素受体1(melannocortinreceptor1,MCR1)FRW体外实验中，与MCR1高表达的 细胞特异性结合的能力是表达 其它MCR细胞的3000倍，并且 可以竞争抑制MCR的天然配体a 促黑激素(。-melanocyte-stimulating hormone, a -MSH)与 MCR1 的结 合22血管内皮HTMYYHHYQHHL高亲和力的和VEG
15、FR I结合，可 抑制鸡胚脲囊膜的血管生成，在 肿瘤动物模型中抑制乳腺癌的 生长23、细胞生长 因子受体 I (vascular endothel ia cell growth factor receptorI, VEGFR I)NGYEIEWYSWVTHGMY肽分别与半乳糖甘酶和过氧化 酶连接后，融合蛋白与VEGFR I 结合的亲和力分别比单纯的半 乳糖甘酶和过氧化酶与VEGFR I 结合的亲和力提高了 200倍和 400倍24白介素 11受体 (interle ukin 11 receptor,IL 11 R)CGRRAGGSC有效的识别IL 11 R, 有望用于前列腺癌的诊断和治疗25鼻
16、咽癌细胞RLLDTNRPLLPY与包裹了阿霉素的脂质体相连后，体外实验中该脂质体特异性杀伤鼻咽癌细胞，体内实验，可26是用药量减低至原来的1/5人脐静脉细胞SIGYPLP当与腺病毒相连时，其基因转染 效率比单一的腺病毒提高了15.5 倍27神经胶质瘤细胞V L P H与RG2神经胶质瘤细胞结合的活性是星形胶质细胞的63倍28（二）体内筛选在有些情况下，当某些抗原及标志物不易确定或难以获得纯化 产物时，体内筛选是比较合适的选择。体内筛选的优点是其是在体 内进行的，所以筛选出的肽是与完全保持了活性状态的靶分子结合 的，但是筛选出的肽究竟是与何种分子结合还有待于进一步确定。 它的基本过程是：将噬菌体
17、肽库经尾静脉注射入小鼠，待噬菌体在 体内循环适宜时间后，通过心脏对小鼠进行全身灌注以洗去非特异 性结合的噬菌体，然后收集靶器官中的噬菌体，经感染大肠杆菌扩 增、纯化后再注射小鼠，进行下一轮淘筛，一般为3-4轮，直到噬 菌体得到富集，挑取单克隆，对噬菌体表面呈现片段进行测序，推 导其序列的同源性。利用体内筛选法，人们发现了许多器官和组织 特异性结合的肽（表二）。表二，体内筛选发现的特异性结合肽靶向组织或器官筛选出的肽生物学评价参考文献乳房组织CPGPEGAGC在乳房组织的富集是其它组织的100倍，并且可在乳腺癌小鼠中特异性的富集于小鼠的乳腺癌血管上29肾ELRGD(R/M)AX(W/L)在肾的富
18、集是对照噬菌体的39倍30肺CGFECVRQCPERC在肺的富集是对照噬菌体的35倍31皮肤CVALCREACGEGC在皮肤的富集是对照噬菌体的7倍胰腺SWCEPGWCR在胰腺的富集是对照噬菌体的6倍肠YSGKWGW在肠的富集是对照噬菌体的10倍动脉粥样硬化区域的内皮细胞CAPGPSKSC在动脉粥样硬化小鼠体内可以 特异性的结合于动脉粥样硬化 区域的内皮细胞上32四、导向肽的鉴定和评估筛选出的肽是否可作为导向分子用于导向性药物的开发，一般可从以下3个方面进行测定和评估。（一）特异性筛选出的肽应该是可以特异性地识别并结合靶分子或靶组织，这 样才能保证其作为导向分子时将药物特异性的带到病灶部位，从
19、而提 高药物在病灶的富集度，降低用药量，减轻对正常组织的损害。一般 常用的鉴定肽特异性的方法有ELISA、细胞结合实验（包括免疫组化、 流式细胞术等）、体内分布实验等。（二）亲和性筛选出的肽仅具有特异性是不够的，它与靶分子或靶组织必须具 有相当的亲和力才能用于药物的开发，如果亲和力不够则是没有实用 价值的。可通过竞争实验、生物传感器测定其亲和力、进行Scatchard 分析等方法来评价肽的亲和力。（三）生物学反应有些筛选得到的肽不仅可以和靶分子或靶组织结合，而且可能还 能引发其它的生物学效应，比如阻断其它分子与靶分子或靶组织的结 合、改变靶分子所介导的信号转导通路等。同时该肽对机体是否有害，
20、是否具有免疫原性，这些都需要通过实验进行研究。可以分别在蛋白 水平、细胞水平及实验动物水平三个层次上对肽的生物学特性进行研 究。五、导向肽的应用由于导向肽可以特异性的识别靶向分子或靶向组织，所以其无论是在疾病的诊断还是在疾病的治疗中都有着很广阔的应用前景(一) 在疾病诊断中的作用肿瘤表面分布的标记性分子可以有效的将肿瘤和其它器官和组 织区分开来，故常常用于肿瘤的诊断。而导向多肽具有和这些标记性 分子特异性结合的性质，所以是很好的诊断用分子。如M. J. Campa 等以内皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR) 三的变种III为靶分子从噬菌体
21、呈现肽库中筛选出与之结合的肽用 于肿瘤的诊断，实验表明阳性肽与在低剂量(30-nmol/L)时仍然可 以特异而高亲和力的与EGFR变种II结合，是十分理想的诊断分子33。(二)在疾病治疗中的应用1.导向性化疗药物化疗药物如阿霉素、道诺霉素等在肿瘤的治疗中一直具有很好的 作用，但是由于它们对正常的细胞往往也有很强的杀伤力，故在临床 应用中常常受到限制。如果将这些化学药物与肿瘤表面特异性分子的 结合肽相连构建成导向性的药物，则可以大大降低已有化疗药物的用 药剂量，减少其毒副作用，并且可以使得一些具有潜在肿瘤治疗价值 但受其毒副作用限制而未能走向临床的化疗药物走向应用。如A. Wadih等将肿瘤血管
22、内皮细胞特异性结合肽RGD-4C与阿霉素相连构 建导向性的药物RGD-4C-阿霉素，在乳腺癌小鼠动物模型中实验，结 果显示与单纯的阿霉素相比，RGD-4C-阿霉素的用药量显著降低，用 药量在单纯阿霉素用量的1/40时便可以使肿瘤细胞发生坏死，而在 这一药物剂量下，单纯阿霉素对肿瘤是没有作用的两。2 .导向性蛋白药物基因工程的发展使得许多蛋白分子如细胞因子等在肿瘤的治疗中发挥着越来越重要的作用。干扰素、肿瘤坏死因子(tumor necrosisfactor, TNF)等在相关肿瘤的治疗中都显示出了良好的应 用前景，但是有些生物分子在体内可能诱发严重的毒副反应，如何降 低它们的毒复作用已成为医药工
23、作者共同关心的问题。多肽导向技术 是解决这一问题的有效策略之一。C. Flavio等将肿瘤血管内皮细胞 特异性结合肽NGR与TNF相连构建融合蛋白NGR- TNF，在临床实验 中NGR- TNF相对于天然TNF，对肿瘤的杀伤力显著提高，而用药量 仅为天然TNF的1/30眺，目前NGR- TNF已获准上市。3 .导向性基因治疗药物近年来，基因治疗成为继蛋白类药物之后又一个治疗肿瘤的有效 方法。基因治疗的成功依赖于基因传递载体的有效性，该载体必须可 以特异地将目的基因转入足量的肿瘤细胞内以发挥治疗作用。但是目 前基因治疗所常用的大部分病毒载体的特异性都不是十分让人满意， 而导向性的基因传递系统则是
24、解决之一问题的可能方法。如A.N. Stuart等以人脐静脉细胞为靶细胞，从噬菌体呈现肽库种筛选到与 之特异性结合的肽SIGYPLP，当该肽与基因传递载体腺病毒相连后， 实验表明与单一的腺病毒相比，SIGYPLP-腺病毒的基因转染效率提高 了 15.5 倍36。六、展望多肽导向技术是近年来发展很快的一项技术，它为解决长久以 来药物发展中的难题之一：药物在体内分布的特异性不够以至增加药 物的用量、提高药物的成本和引发毒副反应提供了理想的方案。利用 该技术不仅可以提高原有药物的疗效，而且还可以开发设计出许多新 的药物。人类基因组计划的完成及蛋白质组研究的开展，使得人们利 用先进的科技手段如生物芯片
25、、差示PCR、2D电泳等技术发现病灶组 织的标记分子越来越便捷，其中很多标记分子都是导向性药物治疗很 好的靶点；同时通过对噬菌体呈现肽库的淘洗来发现与药物靶点特异 性结合的肽这项技术也日臻成熟，相信在不久的将来一定会有越来越 多的多肽导向性类药物走向临床，造福于患者。参考文献1 Qian ZM, Li HY, Sun HZ, Ho KK. Targeted drug delivery via the transferring receptor mediated endocytosis pathway.Pharmacological Review, 2002, 54(4): 561-5872 R
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