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1、第六节 目的基因的获得（基因克隆）,一、目的基因,定义：基因工程的主要目的是通过优良性状相关基因的重组，获得具有高度应用价值的新物质（品系），为此必须从现有生物群体中，根据需要分离出可用于克隆的相关基因，这样的基因通常称之为目的基因，目的基因主要是结构基因。目的基因可以是完整的基因（包括转录启动子、基因编码区和转录终止子），也可以是基因的部分片断。,二、结构基因的组成,作为一个能转录和翻译的结构基因必须包括转 录启动子、基因编码区和转录终止子。启动子：是DNA上RNA聚合酶识别、结合和 促进转录的一段核苷酸序列。基因编码区：包括起译码ATG、开放阅读框和 休止码TAA(TAG、TGA).终止子
2、：是一个能提供转录停止信息的核苷酸 序列。,原核生物结构基因的组成,编码区：原核生物的基因多数以操作子形式存在，完成同类功能的多个基因聚集在一起，处于同一个启动子的调控之下，下游同具一个终止子。原核生物基因在起译码ATG上游约10bp处，有一个富含嘌呤核苷酸的SD保守序列区，一般为AGGA,由此区转录的序列是翻译时核糖体识别、结合mRNA的位置，核糖体由此位置向前移动，寻找起译码AUG.启动子：原核生物的启动子含35序列保守区5TTGACA3提供RNA聚合酶识别的信号；10序列保守区5TATAAT3，DNA双链从此解开双链转录。操纵子除了启动子以外，还有一些调控转录的其他因子，如调节因子和操纵
3、因子等.终止子：原核生物基因转录终止之前有一段回文序列结构，使RNA聚合酶减缓移动或停止RNA的合成。,真核生物结构基因的组成,基因编码区：真核生物染色体基因组的基因是单独存在的，并且两个基因之间有很长的间隔序列区（内含子）；启动子：真核生物结构基因的启动子通常包含3个保守序列区：在20至30序列区有一个TATA框，DNA双链在此处开始解开；在75序列区有一个CAAT框，其作用是与RNA聚合酶结合有关；在更上游处有一个GC框，是某些转录调控因子结合的序列；终止子：高等真核生物结构基因休止码序列下游有一保守的AATAAA序列提供转录产物的释放信号；真核生物染色图基因组的结构基因不具有SD序列区，
4、核糖体与转录的mRNA的结合靠mRNA 5端添加的“帽”结构；,其他类型基因组的基因组成,质粒基因组病毒（噬菌体）基因组线粒体基因叶绿体基因组,三、目的基因的分离方法,1.PCR技术获取目的基因,反转录PCR,反转录PCR，即RTPCR（Reverse Transcription PCR），是将逆转录与PCR相结合的技术。可分为两步：逆转录：引物可以是Oligo(dT)12-18或基因特异引物，模板是总RNA或mRNA；PCR：以mRNA逆转录合成cDNA第一条链为模板，引物用基因特异引物或从蛋白质序列设计的简并引物群以及Oligo(dT)12-18等。,已知目的基因序列的RT-PCR,根据目
5、的基因的编码区序列两侧设计正反引物，一个是逆转录引物作为反义引物，另一个是基因特异正向引物，两个引物必须保证能扩增出基因的编码区序列。,已知目的基因蛋白产物的N端部分氨基酸序列信息时，就可以以此设计特异引物，RNA从中通过RT-PCR获得目的基因。首先Oligo(dT)12-18反转录第一链，接着以N端部分氨基酸序列反推的简并引物为正向引物，Oligo(dT)12-18为反向引物进行扩增。,从基因编码部分氨基酸序列出发的RT-PCR,依据部分序列信息获得基因全长序列,如果获得的目的基因的DNA片断是不完整的，那么基因有必要根据已知的序列获得目的基因全长的序列。目的基因完整序列的获得对基因结构分
6、析、蛋白表达及基因功能的研究至关重要。,反向PCR,反向PCR是一种根据已知DNA区的序列设计引物，以包含已知区和未知区的环化DNA分子为模板来扩增未知DNA区序列的PCR技术；首先提取基因组DNA，用一种在已知DNA区没有识别位点的限制酶切割，产生含上、下游未知区域DNA片断，然后通过T4DNA连接酶处理形成首尾相连的双链环状DNA。根据已知区域设计两套巢式引物即外测引物S1、A1和内侧引物S2、A2进行巢式PCR，获得特异PCR产物。测序后获得已知序列。较小的环化DNA分子，扩增效率高。,盒式PCR,盒式PCR是利用cassette（人工合成的带有适当限制性酶的黏性末端较长的双链DNA分子
7、）盒cassette上的引物，特异性扩增目的基因组DNA未知区域的一种有效的方法。首先用适当的在已知DNA区没有识别位点的限制酶切，产生含上、下游未知区域DNA分子然后与含有对应限制酶切位点的cassette进行连接。接着用cassette引物1（C1）盒根据已知区域设计的特异反向引物1(ASP1)配对，cassette引物2（C2）和根据已知区域设计的特异反向引物2(antisense primer2,ASP2)配对,进行巢式PCR来扩增基因的上游未知区。同样用根据已知区域设计的特异正向引物1(sense primer 1,SP1)和引物C1配对,特异正义引物2(sense primer2,
8、SP2)和C2配对,通过巢式PCR来扩增基因的下游未知区。（图）,RACE技术,RACE是一种通过PCR进行cDNA末端快速克隆的技术,是以mRNA为模板逆转录成DNA第一条链后用PCR技术扩增出某个特异位点到3或5之间的未知序列的方法,分别称3-RACE或5-RACE；锚定PCR(anchored PCR,即序列未知的单链模板3一末端添加同聚物尾巴从而获得与尾巴互补的引物结合位置的PCR方法)和反向PCR都可以用于RACE技。经典RACE就是基于锚定PCR技术原理设计的，而高特异性的RACE则借助于反向PCR,2.筛选基因文库获取目的基因,基因文库的概念所谓基因文库,通俗地讲就是通过克隆的方
9、法将某一基因组所有DNA或mRNA，利用适当的载体保存于适当宿主菌或噬菌体中形成的转化子群,所有重组DNA序列总和代表基因组的DNA全序列；基因文库包括基因组文库(genomic library)和cDNA文库(cDNA bank)；构建基因文库的目的不仅仅是将生物的遗传信息以稳定的克隆形式存储起来，更为重要的是还能成为分离目地基因的主要途径和基础；基因文库的容量：物种的基因组越大，目的基因在基因组中的拷贝数越少；克隆载体容量越小，所需克隆的数目就越多；目的基因在基因组中的拷贝数越多，越容易筛选到该基因。,基因组文库的构建过程,基因组文库的构建实际就是基因组片段的克隆过程。基因文库的构建过程如
10、下：生物基因组DNA的提取和片段化（制备成适合克隆长度和相应末端的片断DNA）；载体选择和制备；DNA片段和载体的连接；重组体转化宿主细胞（大肠埃细菌或酵母等）DNA；初库的扩增。,cDNA文库的构建,高等真核生物的基因组一般都很大（104107kb）从真核生物基因组文库中筛选目的基的工作量十分繁重；真核物基因中往往含内含子，即使分离出来，也不能在原核表达系统中表达目的基因，因为原核缺乏真核生物mRNA转录后剪接系统不能完成的加工和拼接；cDNA文库是从特定时空条件下表达的典型的真核生物细胞mRNA（典型的真核生物细胞有1000-30 000个不同种类的mRNA序列），经逆转录形成的cDNA克
11、隆构建的。通过筛选以直接获得编码区序列。这些序列因为不含5端调控序列和内含子，显得“纯净”这是它的个优点。,总的提取RNA分离纯化mRNA逆转录合成双链的克隆cDNAcDNA克隆,Two Libraries：cDNA Library vs Genomic Library,mRNA,cDNA,Reverse transcription,Chromosomal DNA,Restriction digestion,Genes in expression,Total Gene,Complete gene,Gene fragments,SmallerLibrary,Larger Library,Vect
12、or:Plasmid or phage,Vector:Plasmid,Juang RH(2004)BCbasics,筛选基因文库获取目的基因,常用的筛选方法有核酸分子杂交法和免疫学筛选法。将构建好保存起来的基因组文库或文库铺平板形成含不同外源cDNA重组子转化于菌落或噬菌斑；用菌落或噬菌斑原位杂交法可以筛选出含目的基因阳性克隆；如果构建了表达型cDNA文库，可以用免疫学方法来筛选目的基因。,三.图位克隆获得目的基因,图位克隆（mapbased cloning）又称定位克隆：通过分子标记技术对目的基因进行精细定位的基础上,结合大容量载体构建的基因组文库(如YAC文库、BAC文库)，用分子标记的特
13、异DNA片段为探针，可以通过染色体步移(chromosome walking)或染色体登陆(chromosome landing)获得目的基因。,染色体步移,染色体登陆,染色体步移往往因为得不到重叠克隆而被打断造成前功尽弃,或因为基因组的复杂性高而遇到重复序列改变步移方向误入歧途。构建插入片段平均长度大于目的基因与其紧密连锁的分子标记之间距离的基因组文库，就可以通过筛库直接获得含目的基因的大克隆，接着从中分离出目的基因。这样就完全避开了步移的弊端，这种方法称为染色体登陆。,四.mRNA差别显示技术获得差异表达的基因,绝大多数真核生物mRNA具有poly(A)尾，用Oligo(dT)12MN（共
14、12种(4种M3种N)）逆转录锚定引物，可以将所有的mRNA逆转录成为大致相等但结构不同的12份cDNA亚库,这个过程叫做差异显示逆转录即DDRT。PCR所用的5端引物为10 mer的随机引物,选择不同种的5端随机引物可只扩增总cDNA中的部分cDNA链。通常采用12种反转录锚定引物和20种5端随机引物进行240组PCR扩增,可以得到20 000条左右的DNA条带,每一条都代表一种特定的mRNA,基本重盖了总mRNA的96%。扩增产物经过变性的聚丙烯酷肢凝胶电泳可以显示50100条长度在l00500bp之间的条带。如果将对照和诱导同时进行DDRT-PCR,电泳结果在同一位置的条带的有无可能显示
15、基因表达的”开”与”关”即基因的特异表达。,mRNA差别显示技术原理,五.酵母双杂交系统分离目的基因,酵母双杂交技术的基本原理,酵母双杂交体系基于许多真核生物转录激活蛋白因子(transcriptional activator)都是由两个结构上可以分开且功能上独立的结构域(domain)组成：一个是与DNA调控序列结合的 DNA结构域(DNA-binding domain,DNA-BD)另外一个是与基本转录复合物相互作用启动转录的转录激活结构域(transcriptional activation domain,AD)。二者单独都不能激活及引发转录。如果通过DNA重组技术将两个结构域编码区分别
16、克隆在不同的质粒载体上：DNA-结合结构域与已知的诱饵蛋白X组成融合蛋白,激活结构域与另外未知的蛋白Y形成融合蛋白.这两种载体共转化进酿酒酵母细胞中表达。显然,如果未知靶蛋白Y能与已知的诱饵蛋白X相互作用就会使GAU的DNA一结合结构域和激活结构域空间上比较接近,2现完整的GAL4转录因子活性,从而启动下游的报告基因的表达。常用的报告基因为LacZ 基因和His3基因。,六.T-DNA标签法获得目的基因,七.生物信息技术分离和鉴定目的基因,利用EST数据库发现新基因,基因表达序列标签（Expressed Sequence Tag,EST）是从cDNA文库中随机挑取单克隆进行测序，所获得的序列片
17、段长度一般约为60-500bp。这一方法也称电子克隆(electronic cloning)EST(expressed sequence tags)是基因表达短的cDNA序列,包含基因编码区的部分信息,因此称为表达序列标签。随着EST数据库的快速增长,增加了发现新基因的可能性,特别是从实验获得的与某一功能相联系的新的EST出发,发现新基因的几率更大。利用EST数据库发现新基因的具体过程。,通过蛋白家族的保守性分离目的基因,功能相近的蛋白质往往构成一个蛋白家族或超级家族，在进化上形成高度保守的氨基酸序列区域。因此可以以同源保守区设计引物，通过PCR的方法获得相关物种中这个蛋白家族的其他成员，也可以通过检索和比对发现克隆的特定蛋白质与某一蛋白质家族达到统计学相关的标准，则认为是该家族的成员，除非有别的证据否定这个推论。需要说明的是，一个序列可能被指定为一个以上的蛋白家族,而蛋白的相似性只局限在某个区域或结构域。,八.获取目的基因方法的选择策略,
