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1、细菌培养及鉴定,标本采集原则,1.及时采集微生物标本作病原学检查2.在抗菌药物使用前采集标本3.采样时严格执行无菌操作4.标本容器须无菌，但不得有消毒剂5.采样后立即送检6.送检标本应注明来源和检验目的,咳痰方法,病人先漱口，清洁口腔，去除表面的菌群 病人深咳，收集从下呼吸道咳出的痰液无痰可用35NaCl 5ml雾吸约5min导痰以清晨第二口痰为佳标本采集后放置时间不超过2小时,清洁中段尿液,尽量取早晨第一次尿液嘱患者留取标本的前一天晚上少饮水 女性病人收集标本前用肥皂水冲洗外阴，再以灭菌清水冲洗尿道口排出几毫升后，不停止尿流，采集中段尿男性病人翻转包皮，清洗尿道口排出几毫升后，不停止尿流,采
2、集中段尿 采集标本后立即送检！,哥伦比亚血平板营养要求高的细菌巧克力平板含V、X因子，主要培养嗜血杆菌、脑膜炎球菌和淋球菌用中国蓝/麦康凯平板G-杆菌用SS平板沙门氏菌和志贺氏菌用M-H平板细菌药敏用TCBS平板弧菌科细菌用沙包氏平板真菌培养用真菌显色平板真菌培养用罗氏培养基分枝杆菌用,常用的培养基种类和用途,临床标本培养基选择,血：血培养瓶中断尿：血平板、mac平板脑脊液：血培养瓶、血平板、巧克力平板穿刺液：血培养瓶、血平板、巧克力平板、mac平板胆汁：血平板、巧克力平板、mac平板大便:.麦康凯、SS、血平板,细菌接种的基本程序,灭菌接种环,沾取标本,接种,灭菌接种环,细菌接种法,平板划线
3、接种法：目的：使混合的细菌呈单个分散生长，形成单个菌落，以便获得纯菌。方法：分区划线法：适用于含菌量较多的标本连续划线法：适用于含菌量较少的标本,分区划线法(3区),第一区划线,灭菌接种环,第二区划线,灭菌接种环,第三区划线,灭菌接种环,连续划线法,细菌培养法,一般培养（需氧培养）：培养温度：35（采用恒温培养箱）培养时间：1824h二氧化碳培养法：烛缸法、二氧化碳培养箱厌氧培养法：厌氧培养箱、厌氧袋、厌氧罐、疱肉培养法、硫乙醇酸盐法等,细菌在固体培养基中的生长现象,菌落定义：指单个细菌在平板培养基上生长繁殖，形成单一肉眼可见的细菌集团。菌落特征：大小、形状、边缘、颜色、表面、透明度、湿润度、
4、黏度、溶血性菌落类型：光滑型（S）、粗糙型（R）、黏液型（M）菌苔：指多个菌落融合在一起形成的细菌堆积物。,菌 落,菌落与菌苔,菌落的三个类型：,1.光滑型菌落（Smooth type Colony）：又称S型2.粗糙型菌落（Rough type Colony）：又称R型3.粘液型菌落（Mucoid type Colony）又称M型,2023/6/3,16,S型菌落,R型菌落,M型菌落,革兰染色,原理：通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密，故遇乙醇或丙酮脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类
5、脂，故乙醇处理不会出现缝隙，因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色；而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过乙醇脱色后仍呈无色，再经复红等红色染料复染，就使革兰氏阴性菌呈红色。,革兰染色步骤,涂片包括涂片、干燥、固定三步。涂片 干燥 固定,固定的目的：,使细菌的细胞凝固，使菌体与玻片粘得更牢固；可改变菌体对染料的通透性；加热固定可杀死细菌，比较安全。,结晶紫 1 碘液 1 95%乙醇 30”复红1 冲洗 滤纸干燥 油镜观察,冲洗,冲洗,冲洗,革兰染色程序,初
6、染,媒染,脱色,复染,紫色（G）,革兰氏染色步骤示意图,革兰染色,甲菌,乙菌,初染,结晶紫,媒染,碘液,脱色,乙醇,复染,稀释复红,紫色（G）,红色（G-）,革兰染色步骤示意图,【结果】,细菌被染成紫色者，称为革兰阳性菌；而细菌染成红色者，称为革兰阴性菌；,阳性菌紫色（G+b)阴性菌红色（G-b),G+球菌,显微镜下的杆菌,G-杆菌,Figure 2-Gram stain of Gram-E.coli cells,痰标本涂片染色低倍镜下分类,分级 白细胞（个）上皮细胞（个）A 25 25 25A、B两种情况的痰适合做培养，C不合格，应重新留标本,革兰染色注意事项,标本涂片不宜太厚固定不宜过热脱
7、色不宜过度选用培养18-24小时菌龄的细菌为宜,抗酸染色,原理：分枝杆菌细胞壁含脂质较多,其中主要成分为分枝菌酸,此物具有抗酸性,染色时与石炭酸复红结合牢固,能抵抗酸性乙醇的脱色作用,因此抗酸菌能保持复红的颜色,达到染色目的。,抗酸染色步骤,1、涂片包括涂片、干燥、固定三步。涂片 干燥 固定,抗酸染色步骤,2、染色包括初染、脱色、复染三步。,石炭酸复红维持 3-5 3%盐酸酒精30 1 美蓝复染1 冲洗 干燥 油镜观察,冲洗,冲洗,初染,脱色,复染,抗酸染色结果,抗酸菌呈红色，常堆积成团，排列无序，偶呈分枝状生长。背景及非抗酸性细菌呈兰色。,抗酸杆菌报告,300个视野仅见到18条抗酸杆菌填写条
8、数1+：镜检查见3-9条抗酸杆菌/100高倍镜视野2+：镜检查见19条抗酸杆菌/10高倍镜视野3+：镜检查见1-9条抗酸杆菌/高倍镜视野4+:镜检查见9条抗酸杆菌/高倍镜视野,抗酸染色注意事项,染色充分脱色时间宁长勿短在涂抹痰标本时严禁对载玻片进行加热,临床标本培养基选择,生殖道标本根据临床医生所写的检验项目接种相应的平板及操作：淋球菌培养接种淋球菌平板;念珠菌培养接种沙保罗培养基；支原体培养则按支原体培养的操作规程操作；作普通培养则接种血平板和巧克力平板,观察细菌在平板上的生长现象,血平板：大小、形状、边缘、颜色、表面、透明度、湿润度、黏度、溶血性mac平板：大小、形状、颜色、透明度、湿润度
9、、黏度巧克力平板：大小、形状、颜色、透明度、湿润度、黏度,2023/6/3,37,革兰阴性菌 葡萄球菌,细菌的初步分类,细菌的分离与纯化：自血平板挑出待检菌株的单菌落进行初步的鉴定。如果混有杂菌，应该重新转种分纯。染色与镜检：首先通过革兰氏染色确定基本的分类：（1）G+球菌（2）G-球菌（3）G-杆菌（4）G+杆菌。此外，如果镜下发现革兰氏染色阳性、椭圆形、有芽孢状的较大菌体，可能是真菌。,金黄色葡萄球菌,最重要的致病葡萄球菌血平板上菌落有明显溶血环，颜色呈金黄色、灰白色或柠檬色分解葡萄糖、麦芽糖、蔗糖和甘露醇血浆凝固酶和DNA酶阳性,2023/6/3,41,葡萄球菌,念珠菌显色培养基,绿色白
10、色念珠菌蓝色热带念珠菌白色其他，细菌被抑制紫色光滑粉色克柔假丝酵母菌,嗜血杆菌的鉴定途径,只能在营养条件高的巧克力平板上生长，菌落为中等大小、圆形、灰白色、透明革兰染色：G-小杆菌卫星实验就可以帮助初步鉴定,2023/6/3,48,嗜血杆菌,奈瑟氏菌属鉴定,在血平板和巧克力平板上生长，mac上不生长血平板形成灰色、湿润、透明或半透明、不溶血的菌落巧克力平板上形成圆形、灰蓝色的似露滴状菌落革兰染色：G-双球菌，呈肾形或咖啡豆形，凹面相对氧化酶和触酶都均为阳性,奈瑟氏菌属有11个种，临床就淋病奈 菌和脑膜炎奈瑟菌 最为重要,奈瑟氏菌属鉴定流程,菌落观察：灰色、湿润、透明或半透明、不溶血 涂片染色：
11、G-双球菌，呈肾形或咖啡豆状 氧化酶试验+触酶+麦芽糖-脑膜炎奈瑟菌 淋病奈瑟菌,细菌的鉴定与药敏,卫生部重点监控的6种MDRO,MASA:耐甲氧西林金黄色葡萄球菌判断标准：对苯唑西林耐药或头孢西丁诱导实验阳性CRAB：耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌判断标准：对亚胺培南或美罗培南耐药 VER：耐万古霉素肠球菌判断标准：对万古霉素耐药,ESBLs：产超广谱内酰胺酶细菌。包括：大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌等判断标准：对第3代和第4代头孢菌素和氨曲南耐药CRE:耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌判断标准：对亚胺培南等碳青霉烯类耐药MDR/XDROA:多重耐药/泛耐药铜绿假单胞菌判断标准：对亚胺培南等碳青霉烯
12、类耐药,临床常见问题,痰涂片与痰培养结果不一致？培养和涂片选择的痰液不同；标本采集时间过长，部分苛养菌死亡；选择药敏结果敏感的药物，临床治疗无效？体外药敏试验只能预测体内治疗效果，并不等同；一般来说，耐药=治疗无效，敏感治疗有效,今天培养结果与前天结果不一样？1）取材是否规范？2）痰标本有时候选择优势菌做，可能结果 不一样3）抗生素的使用鉴定结果为四联球菌、革兰阳性杆菌，为何没有药敏结果？1）四联球菌为微球菌，一般不引起人体致病，考虑为污染2）革兰阳性杆菌目前没有参照标准，故暂不做药敏试验，若需要治疗参考阳性球菌用药,B群链球菌寄生在产妇生殖道。孕产妇脓毒血症和新生儿脑膜炎的重要原因支原体、衣原体,谢谢大家！,检测结果为找到抗酸杆菌，临床已经排除了结核抗酸杆菌包括结核与非结核分枝杆菌，抗酸杆菌阳性不一定就是结核。,
