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1、本章重点和难点：了解细菌进行遗传物质交流的方式，掌握细菌染色体作图的方法。,第七章 细菌的遗传分析,细菌和病毒在遗传研究中的优越性,世代周期短 T7phage 2030min E.Coli 20min 群体大 一支试管 数以百万计 遗传物质简单 一条裸露的核酸 单倍体 不存在显隐关系,第一节 细菌的细胞和基因组,12m0.5m,DNA 长约1100m 分子量约2.6109,细胞结构 细胞膜 拟核 细胞质（核糖体）细胞壁（鞭毛 伞毛 荚膜 芽胞）与真核细胞的差异 缺乏线粒体、叶绿体，无核膜；染色体 裸露的共价闭合环状双链DNA分子附加体 小型环状DNA(质粒)游离或整合状态,细菌遗传的实验研究方
2、法,(一)细胞计数(培养物细胞浓度)(二)建立纯系的方法(三)选择培养法鉴定突变型与重组型(四)突变型与重组型的批量筛选方法,(一)细胞计数(培养物细胞浓度),培养物中微生物计数方法是微生物学的基本实验技术，其基本思路是：对原培养物进行连续稀释；进行平板涂抹培养；由于每个细胞形成一个菌落，计数菌落数；根据稀释倍数计算原培养物中的细胞浓度。,(二)建立纯系的方法纯培养,挑取由单个细胞繁殖而来的菌落进行培养就可以获得由一个细胞繁殖而来的纯系。通常采用平板表面涂布法或划线法可以获得单菌落。这种方法获得的纯系，称为“菌种纯”。有时采用显微操纵器进行菌丝尖端切割等方法从单个细胞直接培养建立纯系。采用这种
3、方法获得的纯系称为“菌株纯”。,(三)选择培养法鉴定突变型与重组型,许多细菌的突变都与培养基营养成分及培养条件有关。营养缺陷型的筛选、鉴定：选择培养法是根据菌株在基本培养基和营养培养基上的生长表现将菌株分为原养型(也称为原生营养型)和营养缺陷型(在基本培养基上不能正常生长，只能在相应的营养培养基上生长)。其它突变类型的筛选、鉴定：对于其它的突变类型(如温度敏感型)，也可以通过培养条件的选择培养来筛选与鉴定。,(四)突变型与重组型的批量筛选方法,为高效检测、分离混和群体中不同突变型，黎德伯格夫妇设计了影印培养法。该方法原理与选择培养法一致，但是采用影印法将在完全培养基上单菌落同时接种到不同选择培
4、养基上同时对所有菌落进行选择培养，鉴定效率大大提高。,影印培养法,把长有许多菌落的母种培养皿倒置于包有灭菌丝绒布的木质圆柱印章上，使其沾上来自平板上的菌落。然后可把这一“印章”上的菌落一一接种到不同的选择性培养基平板上。待这些平板培养后，对各平板相同位置上的菌落作对比后，就可选出适当的突变型菌株。,影印培养法,MM-原养型,MM+lay赖氨酸缺陷型,MM+leu亮氨酸缺陷型,MM+arg精氨酸缺陷型,注意：(1)最初的培养基必须是非选择性的，即各种突变型都能够在其上生长；(2)必须采用适当的方法如涂布或划线法，以使培养物菌落之间要分开。,接合转化,第 二节 细菌的染色体作图,性导转导,1.接合
5、现象的发现 1946年 J.Leaderberg和E.Tatum,E.Coli K-12 菌株A met-bio-thr+leu+thi+菌株B met+bio+thr-leu-thi-,一.接合,单基因突变率 10 6,回复突变 10-12 or 10-18,如何产生？,原养型的出现以A、B菌株直接接触为前提,隔离培养后不出现原养型,2.F因子及其转移,1952年，W.Hayes,A菌株,B菌株,AB混合培养，原养型重组体,BA混合培养，,细菌接合中遗传物质转移单向过程（即从A B株）,细菌分为两个类群（两种接合型)供体（或雄菌株）受体（或雌菌株）,2.F因子及其转移,致育因子（或F性因子，
6、也叫F质粒）染色体外的一个共价环状DNA分子（94.5kb 细菌DNA的2%1/3基因与接合有关),接合：原核生物中，遗传物质从供体（“雄性”）转移到受体（“雌性”）的过程。,2.F因子及其转移,据 F 因子有无以及存在状态E.Coli 有三种类型：F 不含有 F 因子,F+含有一个自主状态的 F 因子,Hfr(高频重组菌株）含有一个整合到染色体上的 F 因子,F+F,F+,F性伞毛诱导traYz基因表达，产生核酸内切酶,HfrF,多数为F,有4个大肠杆菌菌株1、2、3 和 4 的基因型均为ab,另外4个菌株5、6、7和8的基因型为ab,将两种不同基因型的菌株充分混合后进行平板培养，以确定ab
7、重组子的频率。在以下结果中，M表示许多重组子，L表示少量重组子，O表示无重组子，请根据下述结果，指出每一菌株的性别类型（Hfr、F还是F-）,17,28,38 L,1、2、3、7、8 不是 Hfr,25,26,35,36,47 M,5、6、4是Hfr,2、3、7 是F,15,16,18,27,37,48 O,1是F+,8是F+,F+F F Hfr,HfrHfrFF+,3.中断杂交试验及染色体作图,1957年E.Wollman和E.Jacob设计,Hfr菌株 strs azir tonAr gal+lac+F菌株 strr azis tonAs gal lac,步骤:,供体受体混合培养隔时取样稀
8、释搅拌，中断杂交在含链霉素的完全培养基上选重组子鉴定重组体基因型记录重组体频率及首次出现的时间分析作图,Hfr菌株 strs azir tonAr gal+lac+F菌株 strr azis tonAs gal lac,Lac gal ton azi,用中断杂交法确定的几个Hfr菌株的基因顺序,转移的基因邻里关系不变,有4个大肠杆菌的Hfr菌株按以下顺序转移其标记基因：菌株 基因转移顺序 M Z X W C L A N C W A L B R U Z M U R B上述所有Hfr 菌株都衍生于同一F+菌株，这些基因在原始菌株的环状染色体上排列顺序如何？,M,Z,X,W,C,N,A,L,B,R,
9、U,据 F 因子有无以及存在状态E.Coli 有三种类型：F 不含有 F 因子,F+含有一个自主状态的 F 因子,Hfr(高频重组菌株）含有一个整合到染色体上的 F 因子,接合时：Hfr菌株的基因是按一定的线性顺序依次进入 F菌株的。基因位点离原点越近，进入F越早，重组机会越多；反之越晚。F 因子插入的位置不同，使不同的Hfr菌株有自己稳定的转移起点和次序。,从A到E为源于同一大肠杆菌F菌株的5个Hfr株，括号内的数字示中断杂交试验的5个基因进入F受体菌所需的时间：,A B C D E mal(1)ade(13)pro(3)pro(10)his(7)str(11)his(28)met(29)g
10、al(16)gal(17)ser(16)gal(38)xyl(32)his(26)pro(23)ade(36)pro(44)mal(37)ade(41)met(49)his(51)met(70)str(47)ser(61)xyl(52),绘出F菌株的遗传图，表明所有基因的位置，并以分钟表示基因的相对距离。指出F因子在每一Hfr菌株中插入位点和方向。在这些Hfr菌株中，你认为选择那一个基因可以最高的频率获得Hfr接合后体？,A B C D Emal(1)ade(13)pro(3)pro(10)his(7)str(11)his(28)met(29)gal(16)gal(17)ser(16)gal(
11、38)xyl(32)his(26)pro(23)ade(36)pro(44)mal(37)ade(41)met(49)his(51)met(70)str(47)ser(61)xyl(52),mal,str,ser,ade,his,gal,pro,met,xyl,5,4.细菌重组与E.Coli染色体作图,转 移 后 标 记 基 因 间 的 重 组,原核生物的遗传交换发生在一个部分二倍体中(完全的基因组和一个不完全的基因组),特点：单交换产生一个不完全二倍体线型染色体，不能存活。偶数交换产生一个环状染色体（存活的重组子），外加一个线型断片。产生一个重组体，并且是单倍体。,交换与重组举例,重组作图,
12、二.性导,F因子:整合到E.Coli染色体上的F 因子环出时偶尔不够准确，携带了E.Coli的一些基因，这种F 因子称为F因子。性导：接合时由F因子所携带的外源DNA整合到细菌染色体上的过程。,FlacFlac tsx,可携带一个至多个基因，甚至半条染色体。,比较F、F+和Hfr可知F因子的特点：是细胞质因子，可携带1至多个紧密连锁的基因。高频率转移它的基因(如同F因子)。有极高的自然整合率，且整合到细菌染色体一定 的 座位上。,Hfr2 pro+leu+gal+lac+F F lac-strrFlac+strs F lac-strr,lac+频率低,lac+频率高,F因子的主要用途,构建部分
13、二倍体菌株，用于研究基因的相互作用。显隐性、等位性（互补测验）利用并发性导建立遗传图。并发性导频率越高，连锁越紧密 连锁基因片段通过重组作图,F+F,HfrF,多数为F,F+,F F,F,三.转化,转化的发现 1928年，F.Griffith 肺炎双球菌,转化的发现 1928年，F.Griffith 肺炎双球菌,1944年，证实转化因子是DNA,细菌转化：一个细菌品系由于吸收了从另一细菌品系分离得来的 DNA而发生遗传性状的改变的现象。,转化的条件：感受态的受体细胞 转化因子DNA的大小、形态和浓度 受体和供体染色体的同源性,转化过程,转化因子的吸附单链DNA的吸收联会与整合,转化在遗传分析中
14、的应用,独立片段,连锁片段,合转化频率越高连锁越紧密,供体菌株 trp+his+tyr+受体菌株 trp-his-tyr-,利用对4种药物A、B、C、D具有抗性的一个供体菌株的DNA转化对这4种药物敏感的受体细胞，经初步培养后再将该细胞群涂布到含有各种药物组合的培养基上，结果如下：,加入的药物 菌落数 加入的药物 菌落数 加入的药物 菌落数 无 10000 AB 46 ABC 30 A 1156 AC 640 ABD 42 B 1148 AD 942 ACD 630 C 1161 BC 51 BCD 36 D 1139 BD 49 ABCD 30 CD 786,4个基因中有3个基因似乎是紧密连
15、锁的，另一基因距三者相当远，这是哪一个基因？三个紧密连锁基因的排列顺序如何？,B,ADC或CDA,四.转导,以噬菌体为媒介所进行的细菌遗传物质重组的过程。,转导现象的发现 1952年Zinder N.和Lederberg J.鼠伤寒沙门氏菌LA2 phe+trp-met+LA22 phe trp+met 混合培养 原养型菌落 105（不可能是回复突变）？转化还是接合,FA(过滤性因子)不因DNA酶而失活，说明是非裸露DNA FA与从溶源性细菌分离得到的噬菌体P22质量大小相同 对P22的血清敏感，加热失活 抗噬菌体P22的沙门菌菌株对FA也表现抗性 FA是噬菌体P22,出现原养型菌落表明不是接
16、合,2.普遍性转导（一般性转导）,2.普遍性转导（一般性转导）,细菌染色体组中被转导的基因是随机的，转导的DNA片段大小约为一个噬菌体基因组的大小。,2.普遍性转导（一般性转导）,普遍性转导频率很低，一般只有0.3%左右的噬菌体是转导噬菌体。如沙门氏菌染色体有2000-3000个基因，噬菌体基因组大小20-30个基因，相当于沙门氏菌染色体的1%。因此任一对基因的转导频率为1%0.3%=310-5。携带不同基因两病毒颗粒同时感染同一细菌细胞的频率为10-510-5。所以如果两个基因同时转导频率较高，说明两个基因连锁。,两个基因距离越近，并发转导的可能性越大,并发转导频率 X=(1d/L)3 d两
17、基因的距离（Kb)L最大可包裹DNA长度(Kb),2.普遍性转导（一般性转导）,在大肠杆菌中，thr和leu两个基因在细菌基因组中相距约为2%，试问这两个基因能否用P1噬菌体进行并发转导？为什么？如果能，其频率如何？,P1噬菌体可包裹2.4%E.Coli基因组，能包裹此两个基因,普遍性转导与作图,利用合转导频率测定基因的连锁关系:供体 leu+thr+azis 受体 leu thr azir实验 选择基因 未选择基因 结论 1 leu+50 azir，2 thr+leu azi 较近 2 thr+3 leu+，0 azir thr leu 相邻 3 leu+thr+0 azi r azi 在边
18、上,在以P1噬菌体进行的普遍性转导系统中，供体菌株的基因型为purnadpdx,受体菌为purnadpdx。转导后，首先选择供体等位基因pur，然后针对其他等位基因对其中50个pur转导子进行筛选，结果如下,基因型 菌落数nad pdx 3nad pdx 10nad pdx 24nad pdx 13,pur和nad基因的并发转导 频率是多少？,pur和pdx的并发频率是多少？,在其他两个座位中哪一个距离pur最近？,（3+10）/50=26%,（10+13）/50=46%,pdx,大肠杆菌供体 trpA+supC+pyrF+受体 trpA-supC-pyrF-,P1噬菌体作为载体进行转导，su
19、pC+为选择标记，得到转导子类型和数目如下：,（1）supC+trpA+pyrF+36（2）supC+trpA+pyrF-114（3）supC+trpA-pyrF+0（4）supC+trpA-pyrF-453,（1）supC+trpA+pyrF+36（2）supC+trpA+pyrF-114（3）supC+trpA-pyrF+0（4）supC+trpA-pyrF-453,supC+trpA+pyrF+,supC+trpA-pyrF-,双交换,supC+trpA+pyrF+,频率最低的转导子3个基因中，两边的应为供体基因，中间的为受体基因。,supC+trpA+pyrF+,supC+trpA-p
20、yrF-,双交换,supC+trpA+pyrF-,supC+trpA+pyrF+,supC+trpA-pyrF-,四交换,supC+trpA-pyrF+,supC+trpA+pyrF+,supC+trpA-pyrF-,双交换,supC+trpA-pyrF-,supC+和trpA+共转导频率 36+114/603=0.25supC+和pyrF+共转导频率 36/603=0.06,根据重组体频率推导基因顺序,很多情况下，两基因座位靠得很近，用重组率很难确定它们与第三个基因之间的次序,流产转导（abortive transduction)转导DNA分子进入受体细胞后，不与受体基因组发生交换，不随细胞DNA复制而复制，而是很稳定地存在于细胞质中，形成流产转导。,3.局限性转导（特殊性转导）,转导的细菌基因仅限于某些特定的基因,1956年，Morse 和 Lederberg 以噬菌体为媒介做转导试验，转导仅限于gal和bio 区以内的基因。,本章要点：细菌利用几种机制，在DNA分子间和细胞间转移DNA序列。大肠杆菌中的F因子在接合中将染色体转移至另一细胞转化中，细菌细胞摄取周围介质中的DNA，并通过同源重组将其整合进自己的基因组，同时取代自己的一些基因。一些种类的噬菌体在转导中整合并转移细菌基因至新寄主细胞。,
