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1、细菌耐药机制研究进展,浙江大学医学院附属第一医院俞云松,一、外膜孔蛋白减少或丢失,细胞内抗生素浓度降低膜孔蛋白(OprD):,细胞外膜上的某些特殊蛋白是一种非特异性的、跨越细胞膜的水溶性物质扩散通道。,膜 孔 蛋 白,革 兰 阴 性 细 菌 细 胞 膜,某些细菌本身存在的膜孔蛋白较少或蛋白通道较小，使一些抗菌药物不能进入菌体内部，称为“内在性耐药”或“固有性耐药”（intrinsically resistant），即这种耐药并非是由于任何染色体的突变或是耐药质粒的获得所致。如铜绿假单胞菌的细胞外膜上没有大多数革兰阴性细菌所具有的典型的高渗透性孔蛋白，它的孔蛋白通道对小分子物质的渗透速度仅为典型
2、孔蛋白通道的1%。,“先天不足”,一些具有高渗透性外膜且对抗菌药物敏感的细菌可以通过降低外膜的渗透性而发展成为耐药菌，即原有的孔蛋白通道由于细菌发生突变而使该孔蛋白通道关闭或消失，则细菌就会对该抗菌药物产生很高的耐药性。亚胺培南是一种非典型的-内酰胺类抗菌药物，主要是通过一个特殊的孔蛋白通道OprD2的扩散进入细菌的，一旦这一孔蛋白通道消失，则产生耐药性。,“后天获得”,产气肠杆菌从亚胺培能敏感株变为耐药株,亚胺培南敏感及耐药的产气肠杆菌PFGE图,C1 C2:亚胺培南敏感C3 C4:亚胺培南耐药,亚胺培南敏感及耐药的产气肠杆菌SDS图,C1 C2:亚胺培南敏感C3 C4:亚胺培南耐药,PCR
3、扩增Omp36全长及序列分析,IS903 98%,（约1000bp),插入序列引起OprD2缺失（铜绿）,细菌产生一种或多种水解酶或钝化酶来水解或修饰进入细胞内的抗菌药物，使之到达靶位之前失去活性细菌产生的灭活酶主要有：-内酰胺酶 氨基糖苷类钝化酶 氯霉素乙酰转移酶 MLS钝化酶,二、产生灭活酶,-内酰胺酶,临床上最重要的-内酰胺酶,是质粒介导的能够水解头孢他啶、头孢噻肟等亚氨基-内酰胺类及氨曲南等单环酰胺类抗生素，并可被克拉维酸等-内酰胺酶抑制剂所抑制的一类-内酰胺酶。ESBLs在分子生物学分类中属于A类酶，在Bush分类中属于2be类酶。,超广谱-内酰胺酶（extended-spectru
4、m-lactamases，ESBLs）,ESBLs的分类,根据基因同源性不同分为：TEM型 80SHV型 46CTX-M型 37OXA型 18其它型 20,http:/www.lahey.org/studies/webt.htm.,CTX-M-1组CTX-M-2组CTX-M-8组CTX-M-9组,中国400株大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌的基因型分布,32家医院 1994-2003年大肠杆菌及肺炎克雷伯菌产ESBLs百分率,头孢菌素酶,大部分肠杆菌科细菌如肠杆菌属菌种、弗劳地枸橼酸杆菌、摩根摩根菌、普鲁菲登菌属菌种粘质沙雷菌等都能产生染色体介导的AmpC酶。,阴沟肠杆菌,ACT-1,DHA-1,CM
5、Y(Peking),DHA-1,CIT,ACT-1(Shanghai),DHA-1(Zhejiang),DHA-1,ACT-1(GuangZhou),DHA-1 is The Predominant Type in China,Map of China,克隆片段,PCR产物1100bp,共6432bp,ORF1,ORF2,ORF3,ORF4,ORF5,ORF6,IS26,orf-1,DHA-1 ampR qacE1 sul1,5232 bp,指所有能明显水解亚胺培南或美罗培南等碳青霉烯类抗生素的一类内酰胺酶分别属于Ambler分子分类中的A类、B类、D类酶。,碳青霉烯酶,天然来源碳青霉烯酶嗜麦
6、芽寡养单胞菌的L1酶获得性碳青霉烯酶（Ambler分子分类）B类酶（金属酶）：IMP、VIM类及SPM-1A类酶：NMC-A、KPC-1、GES-2等D类酶：OXA-23至OXA-27、40、48、54,碳青霉烯酶按其来源可分为,金属酶,染色体编码的金属酶：BC，L1,TUS-1,MUS-1,Sfh-1,Mbl1b，大多来源于环境寄生菌。获得性金属酶：IMP VIM SPM GIM-1 SIM-1，位于可转移的基因元件上，造成区域性传播。,IMP型金属酶,IMP型金属酶GenBank上已公布21种，比较它们相互之间的序列表明：IMP型金属酶大致可以分为两组：1）IMP-1、IMP3-7、IMP
7、911、IMP-16 2）IMP-2和IMP-8、12、13、19、20,中国,IMP-4 2001年香港 鲍曼 2001年广州 杨格枸橼酸杆菌、铜绿IMP-1 2004年12月 江苏无锡 铜绿IMP-8 2001 台湾 铜绿,VIM型金属酶,VIM型金属酶 与IMP类金属酶同源性40，但两类金属酶的动力学性质相似，编码基因都位于整合子上。目前VIM型金属酶GenBank上已公布12种，比较它们相互之间的序列可将VIM金属酶大致分为三组：1）VIM-1、4、5、11a 2）VIM-2、3、6、8、9、10、11b 3）VIM-7,VIM型金属酶分布,VIM-1 1999年 意大利 铜绿 氧化木
8、糖产碱杆菌 恶臭假单胞 20032004希腊 大肠 肺克 法国 肺克VIM-2 2000 法国 铜绿 意大利 希腊 日本 韩国 葡萄牙 西班牙 波兰 克罗地亚 智利 阿根廷 美国 中国VIM-3 2001年 台湾地区 铜绿VIM-4 2002年 希腊 铜绿 2003 瑞典 铜绿 2004 意大利 肺克 阴沟 2004 波兰 铜绿,VIM-5 2004 土耳其 肺克 铜绿VIM-6 2004 新加坡 恶臭假单胞VIM-7 2004 美国 铜绿VIM-8 哥伦比亚 铜绿VIM-9，10 英国VIM-11 阿根廷 意大利,VIM型金属酶分布,亚胺培南耐药铜绿假单胞菌金属酶检测结果,VIM-2基因整合
9、子结构图,A：B2，B3，B28，H19，H26，H54，G4 结构同In72B：S5，S9，S10，S11，S12（S15、H22除外）,AB,H22H26 g4 s5 s9 s10 s11 s12 s15 b2 b3 b28 w19w54Marker,50kb,A,B,H22H26 g4 s5 s9 s10 s11 s12 s15 b2 b3 b28 w19w54Marker,PFGE谱分析结果：共有七种类型，来自上海的六株为同一类型，来自北京的三株分两个类型，来自杭州的四株同样也分两个类型。各地区之间的类型各不相同。反复尝试通过接合试验及质粒抽提物电转化传递金属酶基因均未获成功。经Xba
10、I内切酶消化的染色体PFGE与VIM-2探针杂交显示其中10株铜绿假单胞菌50-kb大小的酶切片段杂交阳性，而其余3株（H22、H26、B2）没有阳性片段。,类酶包括阴沟肠杆菌、粘质沙雷菌中由染色体介导的NMC-A、Sme-1Sme-3、IMI-1酶，以及肺炎克雷伯菌中质粒介导的KPC-1-4酶、铜绿假单胞菌中质粒介导的GES-2酶。,碳青霉烯类抗生素水解酶,二株产IMI-1阴沟肠杆菌PFGE结果,E cloacae 8,E C600,E.coli C600E8，E.coli pT103和E.coli DH5对抗菌药物的体外抗菌活性,阴沟肠杆菌、接合菌质粒电泳图谱,M1A B M2,54kb,
11、15kb,Schematic representation of the cloned E.coRfragment,IS903,IMI-2,Imi-2R,IS903,IS2,903bp 921bp 882bp 876bp 921bp,10629bp,(GenBank accession number:AY780889),Imi-R与ImiR同源性为97%。IMI-2与IMI-1同源性99%，仅在37位由天冬氨酸天冬酰胺，106位由组氨酸酪氨酸,多重耐药肺炎克雷伯菌,转化试验,抽提亚胺培南耐药的肺炎克雷伯菌质粒转化DH5，在含1g/ml的亚胺培南的MH平板上筛选成功筛选到亚胺培南耐药的转化菌（转
12、化质粒约60kb）,染色体带,61kb,PCR,PCR筛选内酰胺酶耐药基因包括TEM-1、SHV、CTX-M-1、CTX-M-9、OXA-48、VIM、OXA-10和KPC-1以肺炎克雷伯菌质粒DNA为模板PCR阳性为TEM、SHV和KPC转化菌和克隆菌只有KPC阳性PCR产物测序分别为TEM-1、SHV-12和KPC-2,转化菌质粒（亚胺培南耐药基因克隆）,EcoR,Hind，Nhe等,酶切,Nhe,pTeasy Vector,pTeasy Vector,1.5kb,在含亚胺培南1g/ml MH平板筛选,克隆片段测序,对重组质粒的插入片段进行步移测序，获得1554bp核苷酸 DNAssist
13、软件分析，1个开放读码框(ORF)经GenBank Blast程序分析，该ORF与KPC-2(GenBank注册号:AY210886)的核苷酸序列同源性为100%,D类酶（OXA酶）在Bush分群中属于2d类，对苯唑西林的水解活性很强。OXA型碳青霉烯酶对亚胺培南的水解活性较低，对头孢他啶、头孢噻肟、氨曲南水解活性也很弱。除OXA-23外，其它酶能被三唑巴坦、克拉维酸抑制。OXA型碳青霉烯酶编码基因可位于质粒或染色体上，或定位在I型整合子基因盒中，具备向其他菌种转移的能力,碳青霉烯类抗生素水解酶,blaOXA-23-like,blaOXA-51-like是我国鲍曼不动杆菌最主要的碳青霉烯酶，I
14、SAba1与OXA基因的表达和转移密切相关,342株亚胺培南耐药鲍曼不动杆菌中339株检测到至少一种OXA基因，303株检测到OXA-23-like和OXA-51-like基因，22株只检测到OXA-23-like基因，17株只检测到OXA-51-like基因；其中在313株菌株的OXA-23-like基因上游34bp处检测到ISAba1，在13株菌株的OXA-51-like基因上游7bp处检测到ISAba1。,氨基糖苷类钝化酶分为：磷酸转移酶（APH）乙酰转移酶（AAC）核苷转移酶（ANT）氨基糖苷类钝化酶作用机制：三者分别使抗生素的羟基磷酸化、氨基乙酰化和羟基核苷化，使之不能再与细菌核糖体
15、结合。,氨基糖苷类耐药,庆大霉素高水平耐药（HLGR）主要的耐药机制 氨基糖苷类修饰酶 耐药基因 百分率 AAC(6)-Ie-APH(2)-Ia aac(6)-Ie-aph(2)-Ia 90%APH(2)-Ic aph(2)-Ic APH(2)-Id aph(2)-Id APH(2)-Ib aph(2)-Ib,10%,氨基糖苷类耐药,8,724bp,ORF1,ORF2,ORF4,ORF3,5,3,ISEcp1(tnpA),aph-Ie,repD,str部分序列,一种新的质粒介导的肠球菌氨基糖苷类耐药基因aph(2”)-Ie,三、靶位改变,主要抗菌药物作用靶位,-内酰胺类 青霉素结合蛋白（PBP
16、）氨基糖苷类 核糖体30S亚基大环内酯类 核糖体50S亚基氟喹诺酮类 DNA旋转酶（拓扑异构酶）、拓扑异构酶糖肽类 D-丙氨酰D-丙氨酸四环素类 核糖体50S亚基,PBP2a的作用,PBP2a与-内酰胺抗生素亲和力低，替代正常PBP功能 87KdaPBP1 80 PBP2 78 PBP2a 75 PBP3 70 PBP3 41 PBP4,DR,IR,IR,DR,SCCmec,SCCmec,IV型,VS,HA-MRSA,CA-MRSA,高 耐药性 较低 阴性 PVL 阳性I、II、III SCCmec IV、V,金葡菌耐药性的发展历程,S.aureus,Penicillin-resistantS
17、.aureus,Methicillin-resistantS.aureus(MRSA),Penicillin,Methicillin,Vancomycin-resistantenterococcus(VRE),Vancomycin(glycopeptide)-Intermediate-ResistantS.Aureus（VISA、GISA）,Vancomycin-ResistantS.Aureus（VRSA）,Vancomycin,1940,1960s,1990s,1996,Superbugs,2002,氟喹喏酮的耐药机理,拓扑异构酶 IV(parC,parE),拓扑异构酶 II(gyrA,g
18、yrB),氟喹喏酮,糖肽类抗生素包括万古霉素、替考拉宁等，是高分子量的疏水性化合物。主要耐药机制：VRE的细胞壁肽糖前体末端的D-丙氨酰-D-丙氨酸发生了改变，万古霉素不能与之相结合，因此不能抑制VRE的细胞壁合成。,耐万古霉素的肠球菌（VRE）,transposase,resolvase,vanR,vanS,vanH,vanA,vanX,6590bp(ZY02,HS3),表示PCR扩增,vanY,vanZ,10Kb（ZY01）,转座功能（转座酶transposase基因和解离酶revolsase基因，分别编码产生转座酶和解离酶在转座过程中发挥作用）调控耐药基因（VanR和VanS）产生耐糖肽
19、类的缩肽（VanH脱氢酶、VanA连接酶和VanX二肽酶）辅助蛋白（VanY和VanZ）,含VanA基因簇的转座子转座入各种质粒，或通过接合转座导致VRE耐药性的传播,大环内酯类的耐药机制,核糖体靶位点的改变:erm 编码，高耐;法国、西班牙、中国主动外排泵:mef 编码，低耐，加拿大、美国、修饰酶,16S rRNA甲基化酶,氨基糖苷类抗生素作用位点：细菌16S rRNA以往认为最重要的氨基糖苷类抗生素耐药机制：修饰酶，作用位点在药物，引起一种或几种药物耐药2002最新发现一类新的氨基糖苷类抗生素耐药机制：16S rRNA甲基化酶，引起药物作用位点的甲基化，导致细菌对所有氨基糖苷类抗生素高水平
20、耐药，目前发现4种：armA、rmtA、rmtB、rmtC多重耐药鲍曼不动杆菌在我国各省市广泛流行，该菌对氨基糖苷类抗生素耐药率和耐药水平高16S rRNA甲基化酶是否在介导该菌对氨基糖苷类抗生素耐药中发挥作用需要系统研究,700株鲍曼不动杆菌对5种氨基糖苷类抗生素体外抗菌活性,5种氨基糖苷类抗生素耐药率均大于60；377株（53.9）菌株对5种氨基糖苷类抗生素均耐药；334株（47.7）菌株armA阳性；armA阳性菌株对上述所有氨基糖苷类抗生素均高水平耐药,MIC256mg/L,反复进行接合实验、质粒抽提、电转化均未成功 Southern-blot杂交证实armA基因位于克隆A、B、C约2
21、20kb、300kb、220kb大小的染色体ApaI酶切条带上,armA基因定位于鲍曼不动杆菌染色体,四、主动外运,有些抗菌药物（常见的如四环素类及喹诺酮类）能诱导细菌的主动外运，抗菌药物难以在细菌内积累到有效浓度，造成对抗菌药物耐药程度的普遍提高。,外排泵的结构,外排系统由3个部分组成：位于内膜的肿瘤耐药分化家族(resistantnodulationdivision family，RND)的质膜转运体内外膜之间的膜周连接蛋白或膜融合蛋白(MFP)位于外膜的孔道形成蛋白(0EP),组间外排泵表达量均值比较,是指细菌粘附于固体或有机腔道表面，形成微菌落，并分泌细胞外多糖蛋白复合物将自身包裹其中
22、而形成的膜状物。其生化组成为藻酸盐多糖和蛋白复合物。菌膜可阻止巨噬细胞、抗体、药物作用于菌体,五、细菌生物被膜（Biofilm）,生 物 被 膜,细菌形成生物被膜后，往往对抗菌药物产生高度耐药性，原因有细菌生物被膜可减少抗菌药物渗透吸附抗菌药物钝化酶，促进抗菌药物水解细菌生物被膜下细菌代谢低下，对抗菌药物不敏感生物被膜的存在阻止了机体对细菌的免疫力，产生免疫逃逸现象，减弱机体免疫力与抗菌药物的协同杀菌作用,其他耐药机制,缺乏自溶酶替代途径酶的过量产生等靶位保护机制,质粒介导的喹喏酮耐药,1998年等从一株肺炎克雷伯菌（UAB1）中发现能介导多种抗生素耐药的质粒pMG252，经接合传递后其接合子
23、对环丙沙星的耐药性增加近30倍(MIC 0.0080.25g/mL)。在该质粒内发现了喹诺酮耐药（quinolone resistance）基因，命名为qnr(Lancet1998;351:79799),作用机制,保护DNA旋转酶Qnr通过与旋转酶特异地结合从而影响酶的内在活性,降低了酶与DNA的结合,导致喹诺酮类药物的作用靶位数量减少Qnr与旋转酶的结合,改变了药物结合区域的构象,从而降低了药物识别靶位的效率保护拓扑异构酶细菌对拓扑异构酶的保护作用与DNA旋转酶类似,Hegde,S.S.et al.Science 308:1480,2005,Qnr,DNA旋转酶,表 5株qnrA阳性大肠埃希
24、菌及其接合菌的MIC值,J53为受体菌,表3 8株qnrA阳性肺炎克雷伯菌及其接合菌的MIC值,质粒DNA与PCR 产物探针的Southern杂交,A:肺炎克雷伯菌96号原始菌 C:肺炎克雷伯菌25号原始菌B:肺炎克雷伯菌96号接合菌 D:肺炎克雷伯菌25号接合菌,50kb,质粒全序列测定,用鸟枪法对同时含有qnrA和CTX-M 两个基因的接合菌质粒进行全序列测序构建文库：超声打碎接合菌质粒全长DNA，参数200w，8s，回收1.5kbp3.0kbp片段片段，连接入载体PUC18测序采用Sanger双脱氧末端终止法，用ABI3730型自动测序仪进行双向测序 用Phred软件读取测序数据，去除低质量碱基，用Cross-match软件去除载体序列，Phrap软件进行序列拼接，Consed软件观察和修正拼接结果,int1 blaOXA-30 catB3 aar3 sull orf513 qnrA ampR sull orf5 orf6 IS6100 EcoRII,图10：96号菌株（上图）与In37（下图）中qnrA的周围基因环境比较,int1 sull orf513 qnrA ampR sull orf5 orf6 IS6100 EcoRII,96号菌株接合菌质粒部分测序结果1,96号菌株接合菌质粒部分测序结果2,菌株ZJ96的质粒图谱,谢谢！,
