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1、第四章培养基,授课教师：唐小春动物生物技术系吉林大学畜牧兽医学院,Company Logo,第一节概述,培养基是提供微生物生长繁殖和生物合成各种代谢产物所需要的、按一定比例配制的多种营养物质的混合物。,一、培养基的组成分批发酵工艺：每个阶段的培养基不同 菌种发芽生长 扩大菌体繁殖 发酵罐内的菌体生长 产物合成,Company Logo,（合成培养基）,（复合培养基）,（复合培养基）,（复合培养基）,Company Logo,第一节概述,二、培养基条件与微生物生理学和形态学的相关性培养基条件：是指培养基组成、pH值、二价阳离子、阴离子聚合物、表面活性剂和固形物含量。,Company Logo,二
2、、条件与微生物生理学和形态学的相关性碱性培养基中：产黄青霉菌的菌丝体短而粗，易成球状体。培养基中加海藻酸或甲基纤维素能诱发产黄青霉菌和黑曲霉菌的菌丝体呈丝状体生长。二价阳离子促进菌丝体呈球状，用阴离子聚合物可以阻止二价阳离子的影响。锰能改变黑曲霉菌细胞壁的成份。柠檬酸发酵中（黑曲霉菌）和衣康酸发酵中（土曲霉菌），球状体的菌丝体产酸最高，而产黄青霉菌发酵青霉素时，丝状体的产量最高。生物素改变细胞膜的通透性，减少反馈抑制。（谷氨酸发酵）青霉素抑制G菌细胞壁形成，而改变细胞的通透性。表面活性剂改变细胞的通透性。（酶制剂发酵）,Company Logo,三、配制工业发酵培养基的一般要求1.营养物质组成
3、丰富、浓度适当，满足不同时期的菌体生理需要。2.在一定条件下，各种材料间不能产生生化反应，理化性质相对稳定。3.粘度适中，具有适当的渗透压4.考虑所选材料与代谢产物合成过程的关系，使主产物合成达到最高速率，不需要的产物的合成降至最低。5.生产过程中既不影响通气与搅拌的效果，又不影响或少影响产物的分离精制和废物处理。6.大规模生产时要考虑材料的成本。,Company Logo,第二节培养基的成分,Company Logo,一、碳源 凡是用于构成微生物细胞和代谢产物中碳素的营养物质均称为碳源。一般占菌体干重的50%，它既是构成菌体细胞和代谢产物的主要元素，又是提供微生物生命活动中所需能源的原料。主
4、要有糖、脂、醇、有机酸其它碳氢化合物。,葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、糊精、淀粉等是细菌，放线菌，霉菌，酵母善于利用的碳源，几乎所用微生物都能利用葡萄糖。但是会引起葡萄糖效应。葡萄糖效应：在过多葡萄糖的情况下，葡萄糖不完全氧化的中间产物如丙酮酸、乳酸等会导致培养基的pH下降，从而影响微生物的生长和产物的合成。蔗糖、麦芽糖、乳糖等双糖常用于抗生素、氨基酸、有机酸、酶类等的发酵，可用其纯化产品，也可用其糖蜜和乳清。糊精、淀粉等多糖可克服葡萄糖效应。且来源丰富、价格低廉。脂类一般在培养基中糖类物质缺乏或微生物生长的某个阶段，微生物可利用其生长。碳酸气、石油、石蜡、天然气、甲醇、乙醇等石油化工产品,二、
5、氮源 是指构成微生物细胞和代谢产物中的氮素的营养物质。是微生物发酵中使用的主要原料之一，当培养基中碳源不足时，可作为补充碳源。主要分为有机氮源和无机氮源。常用的有机氮源：黄豆粉、花生饼粉、棉籽饼粉、玉米浆、蛋白胨、酵母粉、鱼粉、菌丝体、酒糟等（含丰富的蛋白质、多肽、游离氨基酸，糖类脂肪、无机盐、维生素及生长因子等，微生物生长迅速）。有机氮源除了含有丰富的蛋白质、肽类、游离的氨基酸外，还含有少量的糖类、脂肪、无机盐和生长因子等，是较理想的营养物质。,微生物对氨基酸的利用是有选择性的，如缬氨酸既可用于红霉素链霉菌的生长，又可以氮源的形式参加红霉素的生物合成。在螺旋霉素发酵中，发酵培养基里加入L-色
6、氨酸可使螺旋霉素的产量显著提高，但L-赖氨酸则完全抑制螺旋霉素的生物合成。黄豆粉是发酵工业最常用的有机氮源，棉籽粉的应用也较广泛。生产中常用的玉米浆、麸质粉是玉米淀粉生产过程中的副产物。由于它们的质量波动较大，因而应用受到限制。,有机氮源成分复杂可以从多个方面对发酵过程进行影响，而另一方面有机氮源的来源具有不稳定性。所以在有机氮源选取时和使用过程中，必须考虑原料的波动对发酵的影响。,无机氮源：成分单一，质量较稳定。铵盐中的氮与细胞中有机氮化合物中的氮处于相同的氧化水平，可被菌体直接吸收利用。硝酸盐中的氮原子必先还原成氨后，才能被菌体吸收利用。微生物对它们的吸收快，所以也称之谓迅速利用的氮源。但
7、无机氮源的迅速利用常会引起pH的变化。,无机氮源被菌体作为氮源利用后，培养液中就留下了酸性或碱性物质，这种经微生物生理作用（代谢）后能形成酸性物质的无机氮源叫生理酸性物质，如硫酸胺，若菌体代谢后能产生碱性物质的则此种无机氮源称为生理碱性物质，如硝酸钠。正确使用生理酸碱性物质，对稳定和调节发酵过程的pH有积极作用。选择氮源时：有机氮源和无机氮源应当混合使用。早期：容易利用易同化的氮源无机氮源中期：菌体的代谢酶系已形成、则利用蛋白质,三、无机盐和微量元素磷、硫、铁、镁、钙、锌、钴、钾、钠、锰、氯等，低浓度时常呈刺激作用，而高浓度时常表现抑制作用。,通常他们在各种培养基中已经足够：但不同菌种需求不同
8、同一微生物在不同生长阶段对这些物质的最适需求量也不同必需根据实验结果区别控制,主要功能：构成菌体成分；作为酶活性基团的组成部分或维持酶的活性；调节渗透压、pH值、氧化还原电位等；作为自养菌的能源。,Company Logo,磷：是构成菌体核酸、核蛋白等细胞质的组成成分，是许多辅酶和高能磷酸键的成分，又是氧化磷酸化反应的必需元素。磷酸盐既能促进菌体的基础代谢，又能影响许多代谢产物的生物合成。因此磷酸盐是发酵生产中的一种限制性营养成分。铁：是菌体的细胞色素、细胞色素氧化酶和过氧化物酶的组成元素。过量可降低抗生素的产量，如青霉素发酵中，Fe2+含量为6ug/ml时，不影响其生物合成，当Fe2+含量达
9、60ug/ml时，产量下降30%，当Fe2+浓度达300ug/ml时，产量下降90%。因此，在铁制发酵罐正式投产之前，需要用未接种的培养基运转几批，来去除罐壁上的铁离子。,锌、镁、钴等是某些酶的辅酶或激活剂，过量则呈抑制作用。锌：是链霉素发酵的必需元素，微量的锌能促进青霉素的发酵，过量则呈现抑制作用。微量的锌能促进菌体生长和链霉素的生物合成。钠、钾、钙虽不是微生物细胞的构成成分，但仍是微生物代谢中不可缺少的无机元素。钠：可维持细胞渗透压，高含量则对细胞生命活动有一定影响。钾：能影响细胞膜的透性。钙：可调节细胞透性，还能调节培养液中的磷酸盐含量。注意事项：对于其它渠道有可能带入的过多的某种无机离
10、子和微量元素在发酵过程中必须加以考虑 使用时注意盐的形式（pH的变化）,四、前体 某些化合物被加入到培养基后，能够直接在生物合成过程中结合到产物分子中，而自身的结构并未发生太大的变化，却能提高产物的产量，这类小分子称为前体 例如，青霉素生产中加入玉米浆，其单位从20U/ml增加到100U/ml，其中的苯乙胺及其衍生物和一些脂肪酸可以被优先结合到青霉素分子中，构成青霉素分子的组成成分。除了可以提高产量外，还可以形成不同的青霉素,前体能明显提高产品的产量，在一定条件下还能控制菌体合成代谢产物的流向。但浓度过高，则对菌体的生长有毒副作用。次级代谢产物的前体，有些是菌体不能合成或合成量很少，如合成青霉
11、素G的苯乙胺用法：前体使用时普遍采用流加的方法 前体一般都有毒性，浓度过大对菌体的生长不利 苯乙胺，一般基础料中仅仅添加0.07%前体相对价格较高，添加过多，容易引起挥发和氧化，流加也有利于提高前提的转化率。,四、促进剂和抑制剂促进剂：是一类刺激因子，它们并不是前体或营养物质，这类物质加入或者可以影响微生物的正常代谢，或者促进中间代谢产物的积累，或者提高次级代谢产物的量。例如：“九二零”，促进某些放线菌的生长，缩短发酵周期，提高抗生素的产量。巴比妥，增加链霉素产生菌的抗自溶能力，达到推迟菌体自溶的目的，增加抗生素的积累。硫氰化苄，降低产生菌的呼吸，降低代谢速度，抗生素合成增加。,抑制剂：在发酵
12、过程中通过加入抑制剂会抑制某些代谢途径的进行，同时刺激另一代谢途径（改变代谢途径）,促进剂提高产量的机制：1）有些促进剂本身是酶的诱导物；2）有些促进剂是表面活性剂，可改善细胞的透性，改善 细胞与氧的接触从而促进酶的分泌与生产，3）也有人认为表面活性剂对酶的表面失活有保护作用；4）有些促进剂的作用是沉淀或螯合有害的重金属离子。,五、水,水占了细胞重量的绝大部分，也是一切化学反应和营养物质传递的介质，所以水的质量对微生物的生长繁殖和产物合成极为重要，因此注意水质对发酵的影响。水的硬度太大，往往会引起某些营养成分的沉淀。主要考虑参数包括pH值、溶解氧、可溶性固体、污染程度以及物质组成和含量。,六、
13、消沫剂 工业发酵中常用一些消沫剂消除发酵中产生的泡沫，防止逃液和染菌，保证生产的正常进行。消沫剂一般采用表面活性物质，当泡沫的表面存在有极性表面活性物质形成的双电层时，加入另一种极性相反的表面活性物质，可以中和电性，破坏泡沫的稳定性，使泡沫破碎；或者加入更强极性的物质与发泡剂争夺泡沫表面上的空间，引起力的不平衡，促使泡沫破碎。常用的消沫剂：天然油脂、聚醚类、高级醇、脂肪酸等,第三节培养基的种类与选择,一、培养基的种类,按生产目的和过程分为：孢子培养基、种子培养基和发酵培养基,按组成成分：复合培养基、合成培养基,按状态：固体培养基、半固体培养基、液体培养基,按用途：选择性培养基、鉴别培养基、富集
14、培养基、原生质体再生培养基、抗生素生物效价检测用的生物检测培养基等。,Company Logo,复合培养基：是采用化学成分还不清楚或不恒定的各种植物和动物组织或微生物的浸出物、水解液等物质(例如牛肉膏、酵母膏、麦芽汁、蛋白胨等)与一些无机盐组成的培养基。,原料来源丰富(大多为农副产品)、价格低廉、适于工业化生产,原料质量等方面不加控制会影响生产稳定性,按组成成分：复合培养基、合成培养基,大多数微生物都能在此培养基上生长繁殖,合成培养基：是用化学成分和数量完全了解的各种营养物质组成,适合于研究菌种基本代谢过程的物质变化规律以及在实验室范围作有关营养、代谢、分类鉴定、生物测定及选育菌种、遗传分析等
15、定量研究工作。,培养基营养单一，价格较高，不适合用于大规模工业生产,成分明确、稳定、重复性强，可以减少不能控制的因素,一般微生物在合成培养基上生长较慢，有些微生物营养要求复杂，在合成培养基上不能生长,液体培养基：常用于大规模的工业生产。发酵工业多用作培养种子和发酵的培养基。根据微生物对氧的要求情况，分别作静止或通风搅拌培养。在菌种筛选工作和菌种培养工作中，也常用液体培养基进行摇瓶培养 微生物在液体培养基中生长的情况有时也可用作鉴定菌种的参考。,按状态：固体、半固体培养基，液体培养基,生理代谢/菌种筛选,种子培养,发酵培养,按用途：,增殖培养基：可以配制成适合某种微生物生长而不适合其他微生物生长
16、，从而达到从自然界分离这种微生物的目的。鉴别培养基：是根据微生物能否利用培养基中某种营养成分，借助指示剂的显色反应，以鉴别不同种类的微生物。选择培养基：是在培养基内加入某种化学物质以抑制不需要菌的生长，而促进某种需要菌的生长。,(一)孢子培养基用途：供制备孢子用。要求：能使孢子迅速发芽和生长，能形成大量的优质孢子，但不能引起菌种变异。注意事项：基质浓度（特别是有机氮源）要低些，无机盐浓度要适量。孢子培养基成分因菌不同而异，常用的有麸皮培养基、大（小）米培养基、琼脂斜面培养基等。,按生产目的和过程：,用途：供孢子发芽和菌体生长、繁殖用。常用原料：因菌不同而不同，常用的有葡萄糖、糊精、蛋白胨、玉米
17、浆、酵母粉、硫酸铵、尿素、硫酸镁、磷酸盐等。,(二)种子培养基,种子培养基特点：必须有较完全和丰富的营养物质，特别需要充足的氮源和生长因子。2.种子培养基中各种营养物质的浓度不必太高。供孢子发芽生长用的种子培养基，可添加一些易被吸收利用的碳源和氮源。3.种子培养基成分还应考虑与发酵培养基的主要成分相近。,(三)发酵培养基 用途：供菌体生长繁殖和合成大量代谢产物用的。要求：营养成分和粘度适中，同时考虑各种生化代谢过程，产物合成期pH值等条件不易发生大的变动，也不能影响产物的分离提纯。,（1）根据产物合成的特点来设计培养基：对菌体生长与产物相偶联的发酵类型，充分满足细胞生长繁殖的培养基就能获得最大
18、的产物。对于生产氨基酸等含氮的化合物时，它的发酵培养基除供给充足的碳源物质外，还应该添加足够的铵盐或尿素等氮素化合物。（2）发酵培养基的各种营养物质的浓度应尽可能高些，这样在同等或相近的转化率条件下有利于提高单位容积发酵罐的利用率，增加经济效益。（3）发酵培养基需耗用大量原料，因此，原料来源、原材料的质量以及价格等必须予以重视。,四、培养基确定方法,（1）做好调查研究工作，了解菌种的来源、生活习惯、生理生化特性和一般的营养要求；（2）根据前人的经验和培养基成分，初步确定可能的培养基成分；（3）通过单因子实验最终确定出最为适宜的培养基成分,（4）确定各成分最适的浓度，为减少实验次数常采用一些合理
19、的实验设计方法。（5）再确定各种重要的金属和非金属离子对发酵的影响，即对各种无机元素的营养要求，试验其最高、最低和最适用量。（6）有些发酵产物，如抗生素等，除了配制培养基以外，还要通过中间补料法，一面对碳及氮的代谢予以适当的控制，一面间歇添加各种养料和前体类物质，引导发酵走向合成产物的途径。,（7）根据生产和科学研究的需要选择培养基类型 工业上，液体深层培养具有占地面积小、发酵效率高、操作方便、易于机械化相自动化生产、降低劳动强度等优点。所以，发酵工业中大多采用液体培养基培养种子和进行液体发酵，并根据微生物对氧气的要求，分别作表面静止培养或深层通气培养。,(8)根据经济效益选择培养基原料 考虑
20、经济节约，尽量少用或不用主粮，努力节约用粮，或以其他原料代粮。糖类是主要的碳源。碳源的代用方向主要是寻找植物淀粉、纤维水解物，以废糖蜜代替淀粉、糊精和葡萄糖，以工业葡萄糖代替食用葡萄糖。同时，使用稀薄的培养基，适当减少碳氮配比 有机氮源的节约和代替主要为减少或代替黄豆饼粉、花生饼粉、食用蛋白胨和酵母粉等含有丰富蛋白质的原料。代用的原料可以是棉籽饼粉、玉米浆、蚕蛹粉、以及各种食品工业下脚料等。这些代用品大多蛋白质含量丰富，氮源充足，价格低廉，便于就地取材，方便运输。,第四节影响培养基质量的因素,一、原材料质量的影响有机氮源：加工用的原材料品种、产地、加工方法和储存条件。（黄豆饼粉、玉米浆、蛋白胨
21、等）质量控制：监测各种有机氮源中的蛋白质、磷、脂肪和水分的含量，注意酸价变化；重视储藏温度和时间碳源：淀粉、葡萄糖和乳糖-不同的原料、产地、加工方法油脂：原料（豆油、玉米油、米糠油、杂鱼油）以及储藏条件和时间的影响无机盐和前体物,二、水质的影响 大生产中使用的水有深井水、自来水、地表水和蒸馏水。含有的无机离子和有机物的含量不同。措施：定期检测水质，地表水应经过适当的处理,三、灭菌的影响 工业发酵中常采用饱和蒸汽灭菌方法杀灭培养基中的有机体。糖类（还原糖）与氨基酸（赖氨酸）、肽类或蛋白质等有机氮源一起加热，会产生化学反应，形成5-甲基糠醛和棕色的类黑精；糖类还能与磷酸盐产生络合反应，形成棕色色素；措施：将糖与其他物质分别灭菌,四、其他影响因素pH值：改变营养物质的浓度比例，尤其是生理酸碱性物质的用量来调节培养基pH值为主，用酸碱调节为辅。培养基粘度：为保证灭菌质量，尽量使培养基液体化,
