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1、实验一 普通光学显微镜结构与使用方法,杭州师范大学 陈建明,一、实验目的和要求,了解显微镜的构造和各部分的作用，掌握显微镜的使用技术和保养措施 学会简易临时玻片的制作方法和生物绘图方法,二、实验内容,在显微镜下练习观察动、植物玻片标本。制作洋葱鳞叶内表皮细胞临时装片，进行显微镜操作练习。在显微镜下观察池塘水样中的微小生物。,三、相关知识与实验原理,要知道的几个重要的分辨率,人眼：0.2mm/250mm光学显微镜：0.2um电子显微镜：0.2nm,显微镜是观察细胞的主要工具。根据光源不同，可分为光学显微镜和电子显微镜两大类。前者以可见光（紫外线显微镜以紫外光）为光源，后者则以电子束为光源。1.光
2、学显微镜 普通生物显微镜由3部分构成：照明系统：包括光源和聚光器。光学放大系统：由物镜和目镜组成，是显微镜的主体。机械装置：用于固定材料和观察方便，包括镜台(载物台)、调节器和、物镜转换器(旋转器)等。,尼康E-600显微镜,显微镜概述,普通光学显微镜的构造,2.荧光显微镜,尼康E800荧光DIC显微镜,荧光显微镜照片（微管呈绿色、微丝红色、核蓝色）,3.激光共聚焦扫描显微镜,LCSM照片蓝色为细胞核，绿色为微管,4.暗视野显微镜 dark field microscope,聚光镜中央有挡光片，视野背景是黑的，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，物体边缘是亮的。可观察 4200nm的微粒子，
3、分辨率比普通显微镜高50倍。,把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。在构造上，相差显微镜有不同于普通光学显微镜两个特殊之处。环形光阑（annular diaphragm）：位于光源与聚光器之间。相位板（annular phaseplate）：物镜中加了涂有氟化镁的相位板，可将直射光或衍射光的相位推迟1/4。,5.相差显微镜,Four types of light microscope Bright-field microscope:the image obtained by the simple transmission of light
4、through a cell in culture Dark-field microscope:the cell appears as a bright object against a dark background Phase-contrast microscope:visualizing living cells Differential-interference-contrast microscope:visualizing living cells,普通光学显微镜的基本结构,普通光学显微镜的构造可分为两部分：一为机械装置，二为光学系统。机械装置由镜座、镜筒、物镜转换器、载物台、推动器
5、、粗动螺旋和微动螺旋等组成。光学系统由目镜、物镜、聚光器、光源、滤光片、虹彩光圈等组成,显微镜的结构,普通光学显微镜基本构造,光学显微镜基本结构：1.照明灯(Lamp)2.聚光器(Condenser)3.载物台和切片夹(Mechanical stage and specimen retainer)4.推进器(Mechanical stage adjustment knob)5.物镜(Objectives)6.粗细螺旋(Course and fine focus knob)7.目镜(Oculars)8.照相机等接口(Connection to camera,etc.),1.物镜 物镜(objec
6、tive)是光学显微镜成像系统中决定其分辨率或叫分辨本领的最关键部件。,物镜标识,2.目镜 目镜的作用是把物镜放大的实象再放大一级，并把物象映入观察者的眼中，实质上目镜就是一个放大镜。显微镜的分辨率能力是由物镜的数值孔径所决定的，而目镜只是起放大作用。对于物镜不能分辨出的结构，目镜放的再大，也仍然不能分辨出。3.聚光镜 聚光镜装在载物台的下方。小型的显微镜往往无聚光镜，在使用数值孔径0.40以上的物镜时，则必须具有聚光镜。聚光镜不仅可以弥补光量的不足和适当改变从光源射来的光的性质，而且将光线聚焦于被检物体上，以得到最好的照明效果。,显微镜的光学原理,成像原理 光路：光源虹彩光圈聚光镜通光孔标本
7、（一定要透明）物镜镜筒目镜眼。,显微镜的放大倍数,四、实验器材,显微镜、擦镜纸、镊子、小剪、载玻片、盖玻片、解剖针、表面皿、吸水纸、碘液、清水、香柏油、二甲苯。洋葱鳞茎，棉花老根横切玻片标本，池塘水样,五、实验方法和步骤,（一）显微镜的使用1.取镜和安放 置显微镜于平稳的实验台上，镜座距实验台边沿约为34cm。镜检者姿势要端正。（取、放显微镜时应一手握住镜臂，一手托住底座，使显微镜保持直立、平稳。切忌用单手拎提；且不论使用单筒显微镜或双筒显微镜均应双眼同时睁开观察，以减少眼睛疲劳，也便于边观察边绘图或纪录。）,2.观察前的准备工作(1)观察者要养成显微镜镜检的工作习惯，观察时要双 眼同时睁开，
8、一边观察一边进行记录或描绘。(2)观察时所用的材料、药品和各种器具要预先准备好。(3)显微镜在使用之前应检查一下它的各个部件是否完整 和正常，并对载物台、目镜、物镜以及聚光器上端透 镜进行必要的清洁工作。然后进行合轴调节。,3.低倍镜的操作置显微镜于固定的桌上，接通电源，打开光源。将标本片放在载物台上，用标本夹夹住，调节标本移动螺旋，使观察的目的物处于物镜的正下方。调节粗调螺旋，使物镜（10）与标本靠近，眼睛在测向注视物镜，防止物镜和载玻片相碰。张开双眼向物镜里观察，如果见到目的物，但不十分清楚，可用细准焦螺旋，至目的物清晰为止。通过玻片夹推进器慢慢移动玻片，认真观察标本各部分，找到合适的目的
9、物，仔细观察并记录所观察到的结果。,4.高倍镜的操作使用高倍镜前，必须先用低倍镜观察，发现目的物后将它移至视野正中处。旋动转换器换高倍镜。如果高倍镜触及载玻片立即停止旋动，这说明原来低倍镜并没有调准，目的物并没有真正找到，必须用低倍镜重新调节。如果高倍镜下观察目的物有点模糊，调节细准焦螺旋，直到视野清晰。调节细准焦螺旋时要注意旋转方向与载物台上升或下降的关系，防止镜头与载玻片强力接触，损坏镜头或载玻片。,5.油镜的操作如果用高倍镜目的物未能看清，可用油镜。先用低倍镜和高倍镜检查标本片，将目的物移到视野正中。在载玻片上滴一滴香柏油，将油镜移至正中，缓慢调节粗调螺旋使油镜头浸没在油中，刚好贴近载玻
10、片。然后再用细准焦螺旋微微向上调（切忌不用粗准焦螺旋）即可。油镜观察完毕，用油镜纸将镜头上的油揩净，另用擦镜纸蘸少许二甲苯揩拭镜头，再用擦镜纸揩干。（应特别注意不要因在下降镜头时用力过猛，或者调焦时误将粗调节螺旋向反方向转动而损坏镜头及载玻片）,6.换片 观察完一个标本后，如果想要再观察另一标本时，需先将高倍物镜（或油竟镜）转回到低倍物镜，取出标本，按放片的方法换上新片，即可观察。千万不可在高倍物镜（或油镜）下换片，以防损坏镜头。7 显微镜使用后的整理 观察结束后，调节光源到最小再关掉电源开关。调节粗调螺旋，使载物台下降到最低，取下玻片，擦干净镜体，罩上防尘罩，然后放回原处。,六、洋葱鳞叶内表
11、皮细胞临时装片制作,取一片干净的载玻片，用滴管在其中央滴一滴蒸馏水。取洋葱鳞茎，把它切成八瓣，剥下一片新鲜的肉质鳞叶，用刀片在其内表面划一个边长为5mm的正方形，然后用镊子撕下正方形块内表皮，将其置于载玻片上的水滴中（注意表皮的外面应朝上），如果内表皮发生卷曲，应细心用解剖针将其展平盖上盖玻片，注意加盖玻片时，应该用镊子夹住盖玻片一侧，使盖玻片另一侧边缘与水滴边缘相接触，然后慢慢放下，直到放平为止，这样可使盖玻片下的空气逐渐被水挤出，以免产生气泡，影响观察。如果水太多浸出盖玻片外，可用吸水纸将多余的水吸去把装好的片子放在显微镜载物台上，先用低倍接物镜观察，再换用高倍接物镜观察细胞的详细结构。,
12、七、池塘水样中微小生物的观察,到绿色池塘中取出水样，取一洁净的载玻片，在其中央滴一小滴池塘水样，盖上盖玻片，把装好的片子放在显微镜载物台上，先用低倍接物镜观察，再换用高倍接物镜观察微小生物的形态和细胞结构。,八、显微结构图的绘制,生物绘图中绘出的图要清楚，并正确的表示出形态构造的特点，绘图注意事项如下：(1)绘图要用黑色硬铅笔，不要用软铅笔或有色铅笔，一般用 2H 铅笔为宜。(2)图的大小及在纸上分布的位置要适当。一般画在靠近中央稍偏左方，并向右方引出注明各部名称的线条。各引出线条要整齐平列，各部名称写在线条右边,(3)画图时先用轻淡小点或轻线条画出轮廓，再依照轮廓一笔画出与物象相符的线条。线
13、条要清晰，比例要准确。较长的线条要向顺手的方向运笔，或把纸转动再画。同一线条粗细相同，中间不要有断线或开叉痕迹，线条也不要涂抹。(4)绘出的图要正确，观察时要把混杂物、破损、重叠等现象区别清楚，不要把这些现象绘上。(5)图的明暗及浓淡，应用细点表示，不要采用涂抹方法。点细点时，要点成圆点，不要点成小撇。(6)整个图要美观、整洁，还要特别注意准确性。,九、显微镜的保养及注意事项,（1）油镜使用完毕，先用擦镜纸擦去镜头上的油，再取一张擦镜纸，滴上少量的二甲苯擦拭，然后再取另一张新擦镜纸将镜头上残留的二甲苯擦净。否则粘固透镜的胶质会被二甲苯溶解，日久镜片易移位脱落。（2）下降聚光器，打开虹彩光圈，使
14、反光镜垂直于镜座，以免积聚灰尘。（3）用绸布将镜身擦拭干净（切不可用手擦拭），除去灰尘、油污、水汽，以免生锈长霉。,（4）使显微镜的各部件恢复回原位，下降镜筒，使物镜呈“八”字形置于载物台上，然后将显微镜送回镜箱中。（5）显微镜应存放在干燥阴凉的地方，不要放在强烈的日光下暴晒，霉雨季节应在显微镜箱内放置干燥剂（硅胶），如长时间不用，则光学部分应卸下放在干燥器中，以免受潮生霉。（6）显微镜应严禁与挥发性药品或腐蚀性药品放在一起，如碘片、盐酸、硫酸等药品。,八、实验报告及思考题,实验报告 结果部分要求分别绘出你在显微镜下观察到的洋葱表皮细胞的结构，并注明细胞壁、细胞质、细胞核、液泡。思考题与练习1、显微镜的构造分哪几部分？各部分有什么作用？2、反复练习使用低倍镜及高倍接物镜观察切片，使用时应特别注意什么问题？3、如何计算显微镜的放大倍数？你现在所用的显微镜可以放大多少倍？4、使用显微镜过程中，应做好哪些保养工作？,显微镜下看到的洋葱内表皮细胞及示意图,实验报告格式,一、实验项目名称二、实验目的三、实验基本原理四、主要仪器设备及耗材五、实验步骤六、实验数据及处理结果七、思考讨论题或体会或对改进实验的建议,
