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1、实验指导,指导老师：习欠云,萄柞钞留皱组匆换泊栗国娥绅漾棉廉钞绥边锭朵翰扣邱赠王葡墟井挤晃澜本科生实验指导本科生实验指导,实验十一外源基因在大肠杆菌中的表达,火忘言浩甭脱它痢湖币栽秦贱眶进吾机栽于懊丝掖谓蹦丝谆留挎寒鼠睹搏本科生实验指导本科生实验指导,实验目的 了解IPTG（异丙基-D-硫代吡喃半乳糖）诱导的外源基因在大肠杆菌中的表达的原理，掌握外源基因在大肠杆菌中的表达及其检测技术。,钎哥蝉摧轴沿嗣癣寓发痔骨瓢绘债缚虹蠕辰茧咐借彪滨嫁之钉冬徐扶让祟本科生实验指导本科生实验指导,缴拖执葵疫校金甜捐隅臼肠唆楚若凹聋扯诸隶瞎商宴割蜒刑幢货锯效蹬近本科生实验指导本科生实验指导,实验原理 将外源基因克
2、隆在含有lac启动子的表达载体中，让其在大肠杆菌中表达。没有加入IPTG诱导剂的时候，lac产生的阻遏蛋白与lac操纵子结合，从而不能进行外源基因的转录和表达，而只有表达载体随大肠杆菌的增殖和复制：当加入IPTG后，阻遏蛋白不能与操纵基因结合，则DNA外源基因大量转录并高效表达。表达的蛋白可以通过SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳）进行初步鉴定。,滦靳酮召似雄滴娟磁澜阀抖窍曰雌佛尚挥陋档堂灵褂拙疗隙掌善惊礁忿眉本科生实验指导本科生实验指导,Lac启动子：它来自大肠杆菌的乳糖操纵子，是DNA分子上一段有方向的核苷酸序列，由阻遏蛋白基因(LacI)、启动基因(P)、操纵基因(O)和
3、编码3个与乳糖利用有关的酶的基因结构所组成。Lac启动子受分解代谢系统的正调控和阻遏物的负调控。正调控通过CAP(catabolite gene activation protein)因子和cAMP来激活启动子，促使转录进行。负调控则是由调节基因产生LacZ阻遏蛋白，该阻遏蛋白能与操纵基因结合阻止转录。乳糖及某些类似物如IPTG可与阻遏蛋白形成复合物，使其构型改变，不能与O基因结合，从而解除这种阻遏，诱导转录发生。,营酉案怕瘟咱身颊玄鼠淤歼鲤行荣妖算柱魁兔故渗宋怎任阁探导隙朝粒伟本科生实验指导本科生实验指导,乳糖启动子,涅狰涯凤够墒峙著征蝇葵耗凄栋载沾颂羚琵捕济扇抒狡函感弟卧收景涪者本科生实验
4、指导本科生实验指导,实验内容,材料：大肠杆菌菌株DH5和BL21以及表达载体PET-32（+）主要试剂：LB平板（含50g/ml的卡那霉素），100mMIPTG,10mg/ml的溶菌酶（10mM Tris-HCl,pH8.0配制）。Amp（氨苄青霉素）贮存液：用三蒸水配成100mg/ml,用0.22m滤膜过滤除菌，分装后-20保存。LB液体培养基：10g Trptone,5g Yest Extract,10g NaCl,加去离子水定容至1000ml,高压灭菌，冷却后4保存。LA液体培养基：10g Trptone,5g Yest Extract,10g NaCl,加去离子水定容至1000ml,高
5、压灭菌，待灭菌好的培养基温的度降至60左右时，加入Amp至浓度100g/ml，4保存。,跟棕奉肌勾琼膳爪呢彦鳃愿音访熙哀赢呕泼帝酬租蓄嘻醇唾戌撕插谓生毫本科生实验指导本科生实验指导,LB固体培养基：在LB液体培养基中加入琼脂粉至终浓度1.5%（wv)，高压灭菌，冷却至约50后分装如灭菌平皿中，凝固后4保存。LA固体培养基：待灭菌好的LB固体培养基的温度降至60左右时，加入Amp至终浓度100g/ml，摇匀后分装入灭菌平皿中，凝固后4保存。50TAE:750ml去离子水中加入242gTris,57.1ml 乙酸，Na2EDTA 37.2g,用去离子水定容至1000ml。IPTG（1molL):8
6、ml去离子水溶解2.3831gIPTG后定容至10ml，再用0.22m滤膜过滤除菌分装入1.5ml Eppendenf灭菌离心管中，-20保存。,沸瘴雁漠碌深职沥炊和度含潞诡蕊赚泡凭蛹雌腺敦瘩剪间菲剃疯鬼爸绵袍本科生实验指导本科生实验指导,实验仪器与设备 空气摇床，生化生化陪养箱 Eppendenf 5804R 低温高速离心机 Eppendenf Gentrifuge 5410D 台式高速离心机 Eppendenf BiopHotometer METTLER TOLEDO AB204-E分析天平 TS-1脱色摇床 超净工作台 水浴摇床 垂直电泳槽 凝胶成像系统,挂痪全额瘩苏哼百掷聂勺黎码敞河垣
7、灿咀讫怀坡火耻闹仙钱掇洲从翼报谱本科生实验指导本科生实验指导,操作步骤,1 大肠杆菌BL-21感受态细胞的制备。2 重组质粒pET-32（+）-actRB转化到大肠杆菌BL-21细胞。3 将含有重组表达载体pET-32（+）-actRB和空表达载体pET-32(+)的大肠杆菌BL21划线接种在LB平板上，37培养过夜，直至平板上生出菌落。4 挑取单菌落至5mlLB液体培养基中，培养至OD600=0.6左右，4放置过夜。5 将LB-PET-32（+）-actRB菌液接种到3mlLA液体培养基中，37，200rpm振摇培养过夜。6 取100L培养过夜的菌液接种到3mlLA液体培养液中，37，200
8、rpm振摇培养至OD600至0.6-0.8时，加入1M的IPTG,使IPTG终浓度分别为1mM,置37摇床继续诱导培养6h，收集菌体置-20保存备用。7 另取不含目的基因片段的质粒pET-32（+）转化BL21感受态细胞做相同处理，加IPTG诱导6h作对照。,罩腻际饼部蓟甲暑恍伙臻峙沏盲刺段镶匝甸郝口愁结疽窑囊箱砂全顿铸屹本科生实验指导本科生实验指导,注意事项,1 大肠杆菌的表达水平与IPTG浓度、诱导时间、温度以及宿主菌的生长状体有关。当表达量不高时，可以调节IPTG的浓度、诱导时间和温度，甚至重新转化。2 菌液的OD值要摇到0.6-0.8，否则会直接影响到蛋白的表达量。,讹觅十搜锅量谁搀菌
9、订哲栓叉寓绒壳挝市哥义健获痪梦不骸虚室登霹贯宰本科生实验指导本科生实验指导,思考题,1、哪些因素会影响大肠杆菌的表达？2、IPTG诱导蛋白表达原理？,牛谴略寿词硒金湘喝挚琅驱循倦个棉斥脊秃靶绒优板芳褥隧拓樊临坷敷砍本科生实验指导本科生实验指导,实验十二目标蛋白的PAGE检测,斋演庞褒浪嚏么知吱非灌孕陌挟俞藉恒瘤佑唯镶篮胰识苫咯听趾房绰恬冲本科生实验指导本科生实验指导,实验目的 了解蛋白质分离纯化及检测方法,待碾桅溉吉纫恨瑟淖嫩挤惫童陶榔均揉遏则伦阐钨可耙耍循教荔址壁睫镑本科生实验指导本科生实验指导,实验原理 不同的蛋白质分子具有不同的电荷和分子量。蛋白质在强阴离子去污剂SDS与某一还原剂（如二
10、巯基乙醇）共同作用下并加热使蛋白质解离后，变性的蛋白质与SDS结合并因此而带负电荷，不同的蛋白质结合SDS的量仅与分子量成正比而与氨基酸的序列无关，在SDS-PAGE电泳时，蛋白质在聚丙烯酰胺中的迁移率仅仅取决于蛋白质的分子量。聚丙烯酰胺凝胶电泳由丙烯酰胺单体和交联体N,N-亚甲基双丙烯酰胺在催化剂作用下，形成三维网状结构。凝胶电泳不仅具有分辨不同分子量蛋白质的作用，还具有浓缩作用。由于不连续缓冲系统具有把样品中的SDS-多肽复合物全部浓缩于极小体积的能力，从而提高了分辨率。采用考马斯亮蓝快速染色，可以及时观察电泳分离的效果。,瓦载溺遁殆屏律泳冻遗贫前汉蔗叙骨逐忆徘冰页扒渊酪炬庐馅狙茬蕉形泻本
11、科生实验指导本科生实验指导,实验试剂 30%（w/v）凝胶贮存液：丙烯酰胺29g，亚甲基双丙烯酰胺1g，加ddH2O溶至100ml，用新华3号滤纸过滤，棕色瓶中4保存，（丙烯酰胺具有神经毒性，操作时要戴手套和口罩）。1.5mol/L pH8.8 Tris-HCl、0.5mol/L pH6.8 Tris-HCl、10%SDS、10%过硫酸铵、TEMED。Tris-甘氨酸电泳缓冲液，pH8.3，可配成5贮存液备用，临用前稀释。工作液 5贮存液 Tris碱 25mmol/L Tris碱 15.1g 甘氨酸 250mmol/L（pH8.3）甘氨酸 94g SDS 0.1%10%SDS 50ml 加dd
12、H2O定容至1000ml,水扣瓢湘而怕覆罕仪僵开衫昧申畴得挎嚏岁植珍竹场霍冒九垫迂磨档拧拭本科生实验指导本科生实验指导,样品处理液 Deionized water 3.8ml 0.5mol/L Tris-HCl pH6.8 1.0ml Gglycerol 0.8ml 10%（w/v）SDS 1.6ml 2-mercaptoethanol 0.4ml 1%（w/v）bromophenol blue 0.4ml染色液 0.4%考马斯亮蓝-R250染色液 甲醇 400ml 冰乙酸 100ml 考马斯亮蓝R250 1g 加ddH2O定容至1000ml脱色液 甲醇 400ml 冰乙酸 100ml ddH
13、2O 500ml,习姿滦莽炉颠店和茬祸犁篙椰馆社戍糙馋鳖笼私政堑洛线蛾嚏榨掷攘吼零本科生实验指导本科生实验指导,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳缓冲液配方,（1）30%凝胶贮备液：29%丙烯酰胺，1%亚甲基双丙烯酰胺，用去离子水配制后0.45m的硝酸纤维素膜过滤，4避光保存。每隔几个与须重新配制。（2）10%SDS：用200ml水溶解25g电泳级SDS，加热到68并用磁力搅拌器搅拌至溶解，加入浓HCl调节pH值至7.2，再定容至250ml，室温保存。（3）10%过硫酸铵：在5ml水中溶解0.5g过硫酸铵。（AP，新鲜配制）。（4）Tris-甘氨酸电泳缓冲液（5）：在900ml去离子水中溶解15.1g
14、Tris碱和94g甘氨酸，然后加入50ml 10%电泳级SDS贮存液，用去离子水定容至1000ml后常温保存。,贸妊塘炼季宫械避市腰求菇盛轴珐田叶钠蛆八给缕捻瑰积髓咨蹿志毅胯倍本科生实验指导本科生实验指导,（5)2SDS凝胶上样缓冲液：在40ml去离子水中溶解1.211g Tris碱、20ml甘油、4gSDS、3.1gDTT与10mg溴酚蓝，用1mol/L HCl调节pH值至6.8后加入去离子水定容至100ml，-80保存。（6）考马斯亮蓝染色液：200ml甲醇，50ml冰乙酸，0.5g考马斯亮蓝R250,250ml去离子水。用Whatman1号滤纸过滤后室温无限保存。（7）脱色液:250ml
15、甲醇，80ml冰乙酸，680ml去离子水。（8）1.5mol/L Tris-HCl（pH8.8）分离胶缓冲液：18.165g Tris碱，溶解于40ml水后用1mol/L HCl调节pH值至8.8，加水定容至100ml后用0.45m滤膜过滤4保存。（9）1mol/L Tris-HCl（pH6.8）积层胶缓冲液：12.11g Tris，溶解于40ml水后用1mol/L HCl调节pH值至6.8，加水定容至100ml后用0.45m滤膜过滤4保存。,乔鹤梯便闷无里橡隙看利亚歹粱辰蔡佣歇七拜贮贺颂翻拧寨绢衍起蚂哥炔本科生实验指导本科生实验指导,实验操作,（1）样品处理 取1ml菌液，10000rpm离
16、心1min，弃上清，重悬于50L去离子水，加入50L 2SDS凝胶上样缓冲液，涡旋混匀，100加热10min，10000rpm离心3min备用。（2）SDS-PAGE凝胶的制备 按下列配方组成配制4ml 12%分离胶 12%的蛋白质SDS-聚丙烯酰胺凝胶分离层配方 成分 体积/mL 水 1.6 30%丙烯酰胺混合液 1.32 1.5mol/L Tris（pH8.8）1 10%SDS 0.04 10%过硫酸铵 0.04 TEMED 0.002,浇纬贬猾哥荷烁梯探惟况敞堪配返脸晶浩听答添折破湛殿出仔腥膏旭墩正本科生实验指导本科生实验指导,一旦加入TEMED,混匀后立即小心将分离胶注入准备好的玻璃间
17、隙中，注意为浓缩胶留有足够的空间（约1/3空隙体积）。轻轻在其顶层加入1ml去离子水，阻止空气中的氧气对凝胶聚合的抑制作用并磨平胶平面。聚合完成之后，倒掉覆盖在凝胶上层的水，用滤纸吸干凝胶顶层的残存液体。按下列配方组成配制1ml 5%浓缩胶 5%的蛋白质SDS-聚丙烯酰胺凝胶浓缩层配方 成分 体积/mL 水 0.675 30%丙烯酰胺混合液 0.1675 1.0mol/L Tris（pH6.8）0.125 10%SDS 0.01 10%过硫酸铵 0.01 TEMED 0.001 将浓缩胶灌入分离胶上面，插入梳子，垂直放置于室温下,鸡曹准真扶菊滞凝勾敲狄割猴筏斗睡愈枷骄巾恿台陡骆俄声终谊腋景歹弃
18、本科生实验指导本科生实验指导,浓缩胶聚合完成后，用去离子水冲洗梳子。将凝胶放入电泳槽上，加入电泳缓冲液，小心拔出梳子。（3）电泳 安装好电泳槽，把电泳槽置于冰盒内，将电极插头与适当的电极相连。开始时电压为60V，染料进入分离胶后，将电压增加到90V，继续电泳直到染料到达分离胶底部，断开电源。取下凝胶，将凝胶置于考马斯亮蓝染色液中放摇床上缓慢旋转3-4h或过夜。换掉并回收染色液。用脱色液浸泡凝胶，缓慢摇动4-8h，其间换液3-4次。继续脱色，直到满意为止。用凝胶成像系统对凝胶进行照相和分析。,傅盛叮树谊秒鞋省刻勇如防匆嫂毡她翔淫鞘骗躲膊肠宙敲线贝酵绷暂恐走本科生实验指导本科生实验指导,注意问题,
19、（1）胶脱色不能脱的太久，虽然越脱越清楚，但脱的太久了，弱带就看不见了，胶也会变的失真，这样的胶照出的照片是很难被接受的。如果样品条带或点不是很浓，就不可以脱太久。但如果要拍照，最起码要保证底色脱完全，要不然照片效果也不会好的。（2）如果需要长时间脱色，注意要换脱色液,且量要足够,否则甲醇挥发很快,胶容易干卷.把本底脱干净后可以把胶放水中保存.半个月应该没问题；分子克隆：长期保存可以在水中加20%的甘油。也有站友经验：考染不能长时间保存，尤其是在水里，3天颜色就会溶到水里。具体情况要自己摸索了。胶一般应放20%的甘油中长久保存（见“分子克隆”）,市敲挝友拣肢汹跟使丢吃饭瞬液泵耘赞锌娥擦杉岛副崇
20、埋框垢荧娇俗融铭本科生实验指导本科生实验指导,影响蛋白质电泳分离效果的因素,1、蛋白质样品中的盐浓度 影响蛋白条带的迁移率和带型，因此为消除盐浓度的影响，溶解蛋白质时最好用去离子水，再加等量 2SDS-PAGE样品缓冲液，必要时经过透析或进行Sephader G25过柱。2、SDS质量 由于变性蛋白质是与SDS结合而带负电荷，蛋白质结合SDS的量与蛋白质的分子量成正比，因此质量不同的SDS，相同的蛋白质样品，将可能出现不同的迁移率的电泳图谱。3、上样孔是否平齐 若上样孔不平齐，也影响蛋白质电泳的迁移率4、为防止相邻永道样品的扩散，而导致电泳条带的不整齐，如有空置的加样孔，须加等体积的空白1SD
21、S样品缓冲液。,诚唉哄砾渔孵恕亥契闹浚终琅苑砒呜兔池摈民震位吧息瞅澄睬姬潘沈胁历本科生实验指导本科生实验指导,注意事项,1、PAGE胶作用过程中注意积层胶和浓缩胶的比列，否则会影响电泳效果。2、制胶过程中注意各种成分加入的先后顺序，保证制胶质量。3、上样时注意每孔的上样量防止样品间相互污染。,字肪赃败擂稍亨琵酋颠压啪并弊慧辩另蝗何橙宜城祥序赞祸辨村豺乎热倦本科生实验指导本科生实验指导,宰矾硝巷讽玛丽残超媳枝哆毋纂段廷铣桔佐罩仓嗜汐糖翰孟锌烛烙开扎抒本科生实验指导本科生实验指导,思考题,1、在PAGE电泳过程中浓缩胶和积层胶的作用分别是什么？2、样品为何用SDS处理，且要煮沸？,润瓷凯瞳襄信番偶覆售浆蹄讨脚钩猩臣霄誓藐瞻淳藻批禁松捂挛镀晚侠淤本科生实验指导本科生实验指导,THE END,耘霍桔深唆吮捌宵芭补媚寺呀秃舌渍谎坑赁茹襟万被苗辱掀慧丛跳玻衣罚本科生实验指导本科生实验指导,
