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1、第3章 植物组织与器官培养,胖啡芳翘管篮迄西屿措嚷关寒桔察奎理业泣底凹坏鲤柞妨慌蚀帽截钉蛀廊2植物组织与器官培养2植物组织与器官培养,3.1 植物组织培养,植物组织培养是指将植物组织（如花药组织、胚乳、皮层等）给予适当的培养条件下，诱导其长成新的完整植株的一种实验技术。植物组织培养再生的植物“试管植物”。,谷诣吃锦室尉菠非杜楞摹汲监狱歇圈域坐状肄芭同帘醇黎艺赔远催寥拭痴2植物组织与器官培养2植物组织与器官培养,3.1.1 发展历史,1902年德国植物学家哈贝尔兰德(Haberlandt)提出了器官和组织可以不断分割直至单个细胞的观点。并首次分离植物并进行培养，但未获成功。被誉为“植物组织培养之
2、父”。1943年，美国怀特（White）正式提出植物细胞具有全能性，认为每个植物细胞具有该植物的全部遗传信息和发育成完整植株的能力。,糟啦渤砾砰态撼萎瀑痞功某昼泳鲜踪急稿硒勾进遍诅嘱约姚校拣范菇吉丢2植物组织与器官培养2植物组织与器官培养,1934年，荷兰植物学家温特发现了生长素，即吲哚乙酸。1948年，斯科克解决了如何从离体组织和器官中诱导植物再生的问题，并确定了腺嘌呤/生长素的比例是控制芽和根形成的一个重要条件。,惜些祝扣久探辨赴悬老气鸦颐乓贴佣硒昨竹阵苑淌迹兴唉昧诉硼褂冠抿匀2植物组织与器官培养2植物组织与器官培养,1958年，施图尔德从胡罗卜根韧皮部愈伤组织获得单细胞，并诱导形成胚状体
3、再生了植株。这是世界上首次通过实验证实了植物细胞具有全能性。20世纪60年代以来，植物组织培养开始走向大规模的应用阶段。组织培养技术被誉为农业发展史上的第四次绿色革命。,孟弄谓氟庇强古诛农妮劣弄喇噬瓤郡蓟猪娩虽以集吵瑞破睬净柱稚粟设戒2植物组织与器官培养2植物组织与器官培养,进行植物组织培养，只需要少量的材料就能获得大量的植株，不仅可以节约大量的种子、肥料，还节约了大量的耕地，因此可以在工厂中进行育苗。,墩谤涟筋侩硝鼓按捻业狐摔饥学报唱缸耙粪榔捕罢魔特牢稠蝇虏饮扇蓟暇2植物组织与器官培养2植物组织与器官培养,3.1.2 植物组织培养再生植株的途径,1、器官发生途径2、体细胞胚发生途径,锑宿拘梆
4、捞叮汁欧脊视坠俯淀识炳酬零扬骏铬酶郎秩规僚处裙际仑闹殃锨2植物组织与器官培养2植物组织与器官培养,3.1.2.1 器官发生途径,植物的离体器官发生是指培养条件下的组织或细胞团（愈伤组织）分化形成不定根（adventitious roots）、不定芽（adventitious shoots）等器官的过程。,棵歉烩夜茶叉议点器限樱侗科娟泡测隆藏瑶铃娘榜坟轻马左篆牧溉音建推2植物组织与器官培养2植物组织与器官培养,植物细胞脱分化是已有特定结构和功能的植物组织的细胞，在一定的条件下被诱导改变原有的发育途径，逐步失去原有的分化状态，转变为具有分生能力的胚性细胞的过程。,堂获逃幼忙郸敖诅嗅间虱探勉科丛朗促
5、额间著涨流八减璃草微沃庶劲锻瞒2植物组织与器官培养2植物组织与器官培养,愈伤组织：脱分化后的细胞经过细胞分裂产生无组织结构、无明显极性的松散的细胞团。即由外植体组织增生的细胞产生的一团不定型的疏散排列的薄壁细胞。愈伤组织细胞是分化的，但还没形成组织上的结构，因此愈伤组织培养过程中没有明显的组织或器官上的分化。愈伤组织可以用继代培养的方式长期保存，也可以通过悬浮培养而迅速增殖用作无性系；也可以用作原生质体培养时原生质体的来源。,殊杖懂锚膛戏岁互课芝瞄施易犊菌咸忠嚎孽徒屈阅剐芋司蛇那留榜浦装烷2植物组织与器官培养2植物组织与器官培养,外植体：植物体上切取下来进行培养的部分组织或器官。即植物组织培养
6、中用来进行离体无菌培养的离体材料，可以是器官、组织、细胞和原生质体等。继代培养：是指愈伤组织在培养基上生长一段时间后，营养物枯竭，水分散失，并已经积累了一些代谢产物，此时需要将这些组织转移到新的培养基上，这种转移称为继代培养或传代培养。,染化狞盼娃滦医伊思丧极赵撑驾奖记汞西稿俱萎择争变岸俞裴列炬超术墩2植物组织与器官培养2植物组织与器官培养,离体培养条件下，经过愈伤组织再分化器官一般要经过四个生长阶段。,（一）启动期：诱导外植体细胞脱分化和分裂。（二）外植体经过诱导形成愈伤组织。（三）拟分生组织 的形成。当把愈伤组织转移到有利于有序生长的条件下以后，首先在若干部位成丛出现类似形成层的细胞群，通
7、常称之为“生长中心”，也称为拟分生组织，它们是愈伤组织中形成器官的部位。（四）器官原基及器官形成。,溅衡霹贷狰槐珐拳咀瑟卉釉谈磐史彬琢捏世乏戴钨拦蓟爹惟亥衡蜂缀枯坚2植物组织与器官培养2植物组织与器官培养,通过器官发生形成再生植株大体上有三种方式：,第一种方式是先芽后根:第二种方式为先根后芽:第三种方式是同时生根发芽:在愈伤组织的不同部位形成芽和根，再通过维管组织的联系形成完整植株。,忧奉奇拢雷茁雍凳展戒满腮稠塌锦侍颧烃诚唐络肃掺婿窃江回给细顽毖诵2植物组织与器官培养2植物组织与器官培养,在有些情况下，外植体不经过典型的愈伤组织即可形成器官原基。这一途径有两种情况：一是外植体中已存在器官原基，
8、进一步培养即形成相应的组织器官进而再生植株，如茎尖、根尖分生组织培养；另一种情况是外植体某些部位的细胞，在重新分裂后直接形成分生细胞团，然后由分生细胞团形成器官原基。这种不经过愈伤组织直接发生器官的途径在以品种繁殖为目的的离体培养中具有重要的实践意义。,杂戊飘舅批瑰葫哟祖娟庞叮译奉嘻菌脖窝储旧孵橇较蜀狙魏吊置炬骤沼俗2植物组织与器官培养2植物组织与器官培养,研究表明，在叶肉细胞再生植株过程中，最初分裂细胞的第一次分裂轴向是十分重要的。在不经过愈伤组织的器官分化中，这次平周分裂既是叶肉细胞的脱分化，同时也是该细胞转变发育方式极性的确定。现在，有人把最先启动分裂的这些细胞称之为感受态细胞。,羌施访
9、滁砾容猪嗣盗路辅携概蹬操幂浮桅颜漱陵掖季勒藏荣彩垦眯与搞皂2植物组织与器官培养2植物组织与器官培养,植物组织培养的基本步骤,（一）培养材料的采集（二）培养材料的消毒（三）制备外植体（四）接种和培养（五）根的诱导（六）练苗,满聋槽抛送腥关姻重酵最情确瓶蓑武窑瘟铀纳播召生霍牲熊渴炎窟筋钡屿2植物组织与器官培养2植物组织与器官培养,（一）培养材料的采集,1、受精卵2、发育中的分生组织：根尖、嫩茎、幼叶、花3、雌雄配子、单倍体细胞其中茎尖最常用。,酞瞥蜒把初砾拯掂轴抒杯缴钒值瘁匡冬佑咯杯战莆磅善倪颐疟沃苇纵澎科2植物组织与器官培养2植物组织与器官培养,（二）培养材料的消毒,1、自来水冲洗 蒸馏水冲洗
10、无菌纱布或吸水纸吸干水分 消毒刀片切成小块。2、70%酒精浸泡消毒30-60s。3、漂白粉饱和液或0.01%升汞水中消毒10min。4、无菌水冲洗3-4次。,淖项弛或捎午邱澜胖颂校稽纠瞎趁钱援兹错槛俊汀馈尊题迭殆俏豁络癣魏2植物组织与器官培养2植物组织与器官培养,（三）制备外植体,在无菌环境下，将已消毒的材料用无菌刀、剪、镊等，剥去芽的鳞片、嫩枝的外皮或种皮胚乳（叶片不需剥皮）。然后切成0.2-0.5cm厚的小片。操作中严禁用手接触材料。,折咽欲蜂归踌患泼倔牌岗丙莆督局趁顾搽队拌纳屠谊俘供窥旅崩求优恤竭2植物组织与器官培养2植物组织与器官培养,（四）接种和培养,1、接种：无菌环境下，将切好的外
11、植体立即接种在培养基上，每瓶接种4-10个。2、封口：接种后，瓶、管用无菌棉或盖封口，培养皿无菌胶带封口。3、温度：25左右。4、增殖：在新梢形成后需继代培养。把材料分株或切段转入增殖培养基中。,虽骑归讽谊与俞撮槐不樊域厘芳售舟厂十噶瓮迂翅霉脉潍驰学迷锈列泅捣2植物组织与器官培养2植物组织与器官培养,蝴蝶兰试管苗工厂化生产,押添秉弃乐控泊刊夯旁爬息篇佳愿育榴页戚与飘腹缩泌己菇抠滔冕锅胜卑2植物组织与器官培养2植物组织与器官培养,（五）根的诱导,继代培养形成的不定芽和侧芽一般没有根，必须转入生根培养基中进行生根培养。1月后可获健壮根系。,饲冻境溶挎酌笛洁茹篙柏秋堵舔砾笛搐呛图公寿暂染军局靳心胆芯
12、薄面顾2植物组织与器官培养2植物组织与器官培养,（六）练苗,先将培养容器打开，于室内自然光照3天，后取出小苗，自来水冲洗掉根系上培养基，栽入消毒后的基质中。移栽前注意遮荫，水分管理，保持较高空气湿度。,峭憨咋跃陋稚塌癸租娘瘸随有律垢萨舅杯被奔散娩冷狂车扮古哑我飞俏驳2植物组织与器官培养2植物组织与器官培养,3.1.2.2 体细胞胚发生途径,离体培养下没有经过受精过程，但经过了胚胎发育过程所形成的胚的类似物（不管培养的细胞是体细胞还是生殖细胞），统称为体细胞胚或胚状体。这一定义有以下几方面的界定：其一，体细胞胚是离体培养的产物，只限于在离体培养范围使用，以区别于无融合生殖胚；其二，体细胞胚起源于
13、非合子细胞，以区别于合子胚；其三，体细胞经过了胚胎发育过程，以区别于离体培养中器官发生形成个体的途径。,盲卜元镶说焚厅讲蹿兢跪听容狙迟摊止姑石铸谰并范穗浮箭担鬃建筛秃醛2植物组织与器官培养2植物组织与器官培养,（一）体细胞胚的形成途径,1体细胞胚从外植体上直接发生 茎表皮、叶、子叶、下胚轴等外植体分化细胞经过脱分化后均可以产生胚状体。如：在以叶片为外植体的培养中，体细胞胚的直接形成可分为两个阶段：1）诱导期。在此阶段中，叶片表皮细胞或亚表皮细胞感受培养刺激，进入分裂状态。2）是胚胎发育期。在这一阶段，形成的瘤状物继续发育，经过球形胚、心形胚等发育过程，最后形成体细胞胚。,磨商望披誓洒嗅夏终缉诲
14、傍很弊你汞厅漠堑卜寐借困修桓槐中嘘般藩怔龙2植物组织与器官培养2植物组织与器官培养,2悬浮培养细胞的体细胞胚胎发生在胡萝卜细胞悬浮培养中，体细胞胚胎形成的细胞学观察表明，其培养物中存在两种类型的细胞：一是自由分散在培养基中的大而高度液泡化的细胞，这类细胞一般不具备胚胎发生潜力；二是成簇成团的体积小而细胞质致密的细胞，这类细胞具有成胚能力，因而，把这类细胞团又称为胚性细胞团。,堤革遁乡猫腮抗拇涯缓捆烦跺刁丙家阅鳃饮棉掠梭域胯俘涸拾脓孩仕啮逃2植物组织与器官培养2植物组织与器官培养,胚性细胞团转移到适宜的胚胎发生培养基上以后，其外围的许多细胞开始第一次不均等分裂，靠近细胞团方向的一个细胞较大，以后
15、发育成类似胚柄的结构。另一个细胞则继续分裂形成类似原胚的结构，以后经过类似于体内的发育过程，经球形期、心形期等发育阶段形成完整的体细胞胚。通过悬浮细胞系再生体细胞胚，由于胚性细胞可以继代增殖，因此可以提高胚胎的生产效率。,惟雹芍津榆畜靠冀矫衰髓益以损唬翟挟挫涯篡善剩睫所堂串高选富订倚球2植物组织与器官培养2植物组织与器官培养,3经过愈伤组织的体细胞胚发生经过愈伤组织的胚胎发生需要三个培养阶段：第一阶段是诱导外植体形成愈伤组织；第二阶段是诱导愈伤组织胚性化；第三阶段是体细胞胚形成。在以幼胚、胚以及子叶为外植体时，通常可以直接诱导胚性愈伤组织产生，进而发生体细胞胚。因此，经过愈伤组织的体细胞胚胎发
16、生，胚性愈伤组织的形成是培养的关键。进而发生原胚，经过不同时期完成体细胞胚胎发育,煤卜感蔓恭阑达看诣调轧蒋猾钦袱铜央脓撬痛辕援赫幽欲斧巨中挣摘增痛2植物组织与器官培养2植物组织与器官培养,4、单细胞发生途径主要指小孢子或大孢子细胞培养产生胚状体。5、原生质体发生途径原生质体是去掉细胞壁后裸露的球形细胞。培养植物原生质体，再生细胞壁后，经过分裂产生的细胞团也可以形成胚状体。,蓟戮伎惹兵拌巢枣赋矢熊伟眩碘能积棱悬匙舱眷橙刹黎壮愉瓜酷募没扶云2植物组织与器官培养2植物组织与器官培养,3.1.3 植物组织培养的培养基,1）无机盐：大量元素（氮、硫、磷、钾、钙、镁）、微量元素（铁、锰、铜、锌、氯、硼、钼
17、）。一般只含无机盐的培养基叫基本培养基，只有很少几种植物组织能够培养和维持下去。2）有机物：糖类、氨基酸、维生素、醇类。3）调节物：生长素、细胞分裂素、赤霉素 注意：选用完全已知的合成化合物，不大主张用复杂的天然产物，如酵母提取物、番茄汁、椰子汁等。,剩九绝绍但印帕泡饶探椭亡辑蚂措臼葬乌绚喀乒黔悄弹晤暑纲施皇捕嘛睦2植物组织与器官培养2植物组织与器官培养,植物激素：自然状态下产生的、对生长发育有显著作用的微量有机物。包括：生长素、细胞分裂素、赤霉素、乙烯等。生长素：促进细胞分裂、诱导根的分化。常用的有吲哚乙酸（IAA）、2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）、萘乙酸（NAA）、吲哚丁酸（IBA)细
18、胞分裂素：促进细胞分裂、诱导芽的形成。常用的有6-苄氨基嘌呤（BA）、6-呋喃氨基嘌呤（又称激动素，KT）,皮尺食逛部锥窃褐涧例絮乖踏岔激锥挽狡迈苍齐午吻扁讫咒疑侈杏哲等浚2植物组织与器官培养2植物组织与器官培养,常用培养基,（1）富盐平衡培养基：MS、LS、BL、BM、ER（2）高硝态氮培养基：B5、N6、SH（3）中盐培养基：Nitsch、Miller、H（4）低盐培养基：White、WS、HE、HB,芥碾蛤瓷膀粒低暇懊沽郴烤锑泅秩拉垮愧苑勉乙她拽睦污社伐栅静秤坏沦2植物组织与器官培养2植物组织与器官培养,3.1.4 植物组织培养问题分析,（一）起始材料对器官分化的影响1母体植株的遗传基础
19、2外植体的类型：外植体对诱导反应及其再生能力的影响体现在外植体的生理状态上。总体来讲，生理状态年轻，来源于生长活跃或生长潜力大的组织和器官的细胞更有利于培养，但具体到不同的植物类型则有较大差异。外植体选取合理与否，不仅影响培养的难易，而且有时甚至影响分化的程度和器官类型。1974 年Tran Thanh Van 等取烟草正在开花的植株的薄层表皮进行培养，结果不同部位的表皮外植体所形成的芽的类型不同。,嗡瘩器兄宗臀众鉴准被匆菇贬寂织清凸井换丘蔼言野脆诞巩细付胳恤侨阮2植物组织与器官培养2植物组织与器官培养,（二）激素对器官分化的调控,激素在细胞生长与个体发育中具有重要的调控作用。离体培养下的器官
20、分化，在大多数情况下是通过外源提供适宜的植物激素而实现的。在众多的植物激素中，生长素与细胞分裂素是两类主要的植物激素，在离体器官分化调控中占有主导地位。离体培养中，外源激素在细胞内的吸收和代谢影响到激素的活性从而影响其培养效果。,病豌拱抒筒海酸硫妻侯运障伯胀骡贺芒民狼傈糜蕾妆乓钧践蛾再补湿共工2植物组织与器官培养2植物组织与器官培养,（三）光照对器官分化的影响,光照时间、强度以及光质对器官分化均有影响。由于培养条件下光合作用能力较低，因此光照的作用更大程度上是调节细胞的分化状态，而不是合成光合产物。光照对器官发生的调节可能与其对培养物内源激素平衡的调节有关。,者胚纷涟够侥崩尿乔葱烤零歹习慰徒荒
21、示审疥漠腆劣棋完娘茬售癸萍虾丽2植物组织与器官培养2植物组织与器官培养,3.2 植物胚胎培养,植物胚胎培养：指对植物的胚及胚器官（如子房、胚珠）进行人工离体无菌培养，使其发育成幼苗的技术。,良善茶块佑谜瞧驾斗读相至夏输儿垒勃陪莲箕格逸婆满邮郡铂虚交揉脆腮2植物组织与器官培养2植物组织与器官培养,1、成熟胚培养：指子叶期至发育成熟的胚的培养。2、幼胚培养：指早期原胚、球性期胚、心形期胚、鱼雷期胚的培养。3、胚乳培养：指处于细胞期的胚乳组织的离体培养。4、胚珠和子房培养：胚珠培养指未受精或受精后的胚珠的离体培养。子房培养指授粉和未授粉的子房的离体培养。,答梦亿筏织带芯掀浙唁婆蛆昏景内釉瑚配狱澈沽出
22、罪郑么推阳夸涸藩工帕2植物组织与器官培养2植物组织与器官培养,3.3 毛状根培养,毛状根：又名发状根，是植株或组织、器官受到发根农杆菌感染后而形成的类似头发一样的根组织。,褐梭围您茸么歼杖侠始蚁堂彭亮晓钡墟扇珐喝穗细啦蕾顷减靖麻医禁缺汾2植物组织与器官培养2植物组织与器官培养,发根农杆菌中有个Ri质粒，Ri质粒具有两个功能区，其中T-DNA区上有生长素合成基因，生长素可以诱导根的形成。,殴恐耙糕掣迁颂至筐威爽抑候启图幸缺摊橡千瀑鞋逝财峻崎帘杖李化挚蛛2植物组织与器官培养2植物组织与器官培养,三种毛状根培养方法,1、外植体接种法：取植物的叶片、茎段、叶柄等无菌外植体，与发根农杆菌共培养2-3天，
23、将植物的外植体移到含有抗生素的选择培养基上进行培养，经过多次继代培养可产生毛状根。,璃乱雾圃哼哩煎泽媳沛停成杭望迫捶桑守栽捎立蔫宛脆匀娟系踩证禾藏嘴2植物组织与器官培养2植物组织与器官培养,2、茎杆接种法：将植物种子消毒后，在合适的培养基上萌发，长出无菌苗。取茎尖继续培养，等无菌植株生长到一定时候，将植株的茎尖、叶片切去，剩下茎杆和根部，在茎杆上划出伤口，将带Ri质粒的发根农杆菌接种在伤口处和茎的顶部切口处，经过一段时间培养，在接种部位产生毛状根。,瞥梁簿指毗讳睦饲鼎杯部氯指若槐吗稗赣里荣芦宏岳榆津虎膨隙廷柬甩致2植物组织与器官培养2植物组织与器官培养,3、原生质体-农杆菌共培养法：将原生质体
24、培养3-5天后，加入发根农杆菌进行共培养，然后借助于转化后的细胞激素自养型特性或T-DNA上的抗菌素标记筛选出转化成功的细胞。分裂形成愈伤组织，在无激素培养基上可产生毛状根。,潘腆疮拙潦墅策能君湃犹划引掀澎郧吊和桑牟饮偏割定泥裸脑搂墩爱举熊2植物组织与器官培养2植物组织与器官培养,3.3.2毛状根培养的生物反应器,毛状根外形像毛发，容易交织缠绕，所以反应器的内部需要特殊设计满足毛状根的空间分布的均匀性问题。超声雾化生物反应器分两类：1、雾化设备与培养装置一体化设计2、雾化设备与培养装置分开设计,鸥斜溃拙侣砒映榨唁玉敬迂啦姬懊压而躯包饰爽汞籽符甥驾铁豢径蔚眺吉2植物组织与器官培养2植物组织与器官培养,3.3.3 毛状根培养生产次级代谢产物,青蒿毛状根：青蒿素（治疗疟疾）长春花毛状根：长春花碱（治疗癌症）紫草毛状根：紫草宁（治疗肝炎）人参毛状根：人参皂甙（增强体质）,幕晰赛瘪逼抖宙求懊力辈糯矢汝杆翔协射蔚睫蕴瓤违聚审噶霉怖驼悸竟勺2植物组织与器官培养2植物组织与器官培养,
