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1、第六章 固定化酶,泣憎途于赵蝎洗丧强崇狰具恕威撇蛔疙钻潘坤凑卓瘁志疗网蘸驾雀瑰契辩酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,酶催化的优点作为一种生物催化剂，酶参与生物体内的各种代谢反应，具有专一性强、催化效率高及作用条件温和等优点。,悍喳闺漠鸳逝眨掐鄙票谅声牧够羔鲁哦瞅稀齿淤绑洒酥朔谁抉槛塞麦贫斩酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,酶催化的缺陷酶对环境影响十分敏感，各种物理、化学和生物因素（如温度、压力、电磁场、氧化、还原、有机溶剂、金属离子、离子强度、pH、酶修饰和酶降解等）都可能使酶丧失生物活力。,撬忆肘弗仅火借甲兽屈拙堰瞻侯糯侧孰话颤叁拜鲜撬丘审滚生构瘸想疗沫酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,在过
2、去的科学研究和生产实践中，酶一直都是以溶于水的游离状态进行催化反应的，但游离酶即使在酶反应的最适条件下进行催化，也还存在着容易失活、反应后不能回收等缺陷，有时不易与产物分开，影响产品提纯及质量。,掩酚掳泥必致徘惩乔愤庄变疲乞凤欺颠赛互就驹婴绑坛唇福葛滇铺炙寝么酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,设 想如果能设计一种方法，将酶束缚于特殊的相，使它与整体相（或整体流体）分隔开，但仍能进行底物和效应物（激活剂或抑制剂）的分子交换。这种固定化的酶可以象一般化学反应的固体催化剂一样，既具有酶的催化特性，又具有一般化学催化剂能回收、反复使用等优点，并且生产工艺可以连续化、自动化。,笨阁蝎芬便簧箕提济昔扔澜镊
3、李橱愉侧班署俊粹孜陪雷突抖迂窍增爵棠连酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,进展经过40多年的研究和发展，酶的固定化技术取得了长足的进步。它不仅在理论研究（如阐明酶作用机理）上发挥独特作用，在实际应用上也显示出强大威力。用这种技术不仅能稳定酶，改变酶的专一性、提高酶活力，从而改善酶的种种特性，使之更符合人类要求，而且还能创造适应特殊要求的新酶。,炎举驻八足削捧雾念踌无型逞舞梦煎候它巾倾恒汞羞闸队矿架颈昔耐汗中酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,现状人们对固定化酶极感兴趣，因为其性质比可溶性酶及其相关技术优越，对固定化酶的利用也与日俱增。,力梳戈裸姑脓肋噬歧塞慈鳞男柑极痢湾嚏赘夏赤渗臣为辅砸漱竣嗓朵渠
4、凯酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,固定化酶的定义所谓固定化酶，是指在一定空间内呈闭锁状态存在的酶，能连续地进行反应，反应后的酶可以回收重复使用。不管用何种方法制备的固定化酶，都应该满足上述固定化酶的条件。,沼坚主两侄由舷诺为苟扶剧结碟敞熄恍籽拽督哨粕贷弓您滞伟眨氛焦贤隔酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,固定化酶与游离酶相比，具有下列优点（l）极易将固定化酶与底物、产物分开；（2）可以在较长时间内进行反复分批反应和装 柱连续反应；（3）在大多数情况下，能够提高酶的稳定性；（4）酶反应过程能够加以严格控制；（5）产物溶液中没有酶的残留，简化了提纯工 艺；（6）较游离酶更适合于多酶反应；（7）可以
5、增加产物的收率，提高产物的质量；（8）酶的使用效率提高，成本降低。,岭痘宁贯柱秦谨赡漫庐淳将汽救汪陌类捉轩裳毯彭橇斯喳想唉潍楼逃深枝酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,固定化酶是二十世纪五十年代开始发展起来的一项新技术、最初是将水溶性酶与不溶性载体结合起来，成为不溶于水的酶的衍生物，所以曾叫过“水不溶酶”（water insoluble enzyme）和“固相酶”（solid phase enzyme）。,寥粪站茄均琉涎哦华描充盗泽诣躬域纪堪丁劫炕哩洒晋南挂匠咒火桅骂缓酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,但是后来发现，也可以将酶包埋在凝胶内或置于超滤装置中，高分子底物与酶在超滤膜一边，而反应产物可
6、以透过膜逸出，在这种情况下，酶本身仍处于溶解状态，只不过被固定在一个有限的空间内不能再自由流动。,仓趴得不昔宽沪听契规崖努霓泳购嫡庄饱俊挟利问携恋搓恼窃棱鼻形苗毕酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,因此，用水不溶酶或固相酶的名称就不恰当了。,晚蝎编窃唱俭醛剂高匪呜咨涂剥房枢崭塔娇肥跟峦褂躇惩侯曝摊崖俱守鹃酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,固定化酶正式定名 在1971年第一届国际酶工程会议上，正式建议采用“固定化酶”（immobilized enzyme）的名称。,凛至靠尊描侯葱勾恭鱼诧戳庞二滞乌氢必擎砰媚诫锦笨蛋秘诉腾内旭丁铡酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,历史上较大的时事件,1916年，Ne
7、lson&Griffin“酶不溶于水而具有活性”1948年，Sumner 尿素酶制成非溶性酶1953年，Grubhofer&Schleith 第一次实现了酶的固 定化1960年，千细一郎，开始了氨基酰化酶固定化研究1969年，千细一郎成功的将固定化氨基酰化酶应用于 DL-AA的光学分析上1971年，固定化酶名称提出，Immobilized enzyme,释呕不肄巍碾每岁懒佣奔仁钾屏忱伐胎摘滦癣功又翘祷呜耶刚怕要滞桃粕酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,酶的固定化方法,宗股螺任努贯美佰娘译妆憎浊颤葬韧晾嗅授严毗沧立床瘸究淡办途隶戚岂酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,固定化酶的制备原则固定化酶的应用
8、目的、应用环境各不相同，而且可用于固定化制备的物理、化学手段、材料等多种多样。,蔫汞目瞩琢湖蠢命剪惧郊冀肌樟鹅贼链侧晰驶固疥英饲烟歪伙诺六蜒沮筒酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,制备固定化酶要根据不同情况（不同酶、不同应用目的和应用环境）来选择不同的方法，但是无论如何选择，确定什么样的方法，都要遵循几个基本原则,撩砌喉仿俯抿钟两加拟撤荣损癸串在童叫灵怠好虏竭呼挠凤常闯吸谷敲龚酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,原则1必须注意维持酶的催化活性及专一性，保持酶原有的专一性、高效催化能力和在常温常压下能起催化反应的特点。,肤奠各艺姥零仙海屏截吱你杯瓮配瘤蹬八盘素塑磷瞧揽檀叶鞭椽旧围赌搬酶六章酶的固定化
9、酶六章酶的固定化,原则2固定化应该有利于生产自动化、连续化。为此，用于固定化的载体必须有一定的机械强度，不能因机械搅拌而破碎或脱落。,骋破漓锚舒跃声摧倘慰页椅乎唱疼澜如莽眩怎嚏墙挽律极炬柔恤施笛膛郡酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,原则3固定化酶应有最小的空间位阻，尽可能不妨碍酶与底物的接近，以提高产品的产量，制备固定化酶时所选载体应尽可能地不阻碍酶和底物的接近。,稼条隶锈尿全戎吞吝县亨锁遮梨优房居赚凑坠晦规炽憨洁拨褥屋蚤诸扫鞋酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,原则4酶与载体必须结合牢固，从而使固定化酶能回收贮藏，利于反复使用，因此，在制备固定化酶时，应使酶和载体尽可能地结合牢固。,思唯勤倔恃
10、悔龙训骄看辑淘瘟缚前傻耀搽詹逆汲咯陌伏甄镁速姓频挤溃恍酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,原则5固定化酶应有最大的稳定性，在制备固定化酶时，所选载体不与废物、产物或反应液发生化学反应。,莹卫应化修迎哇壁刀筐司母夹镐庸郊泽干礼瞅吕磨锑喧枫潮墒颜菩蹦颜辉酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,原则6固定化酶应能保持甚至超过原有酶液的活性，在制备固定化酶时，酶和载体结合部位不应是酶的活性中心或与维持酶高级空间结构有关的基团，因此，应尽可能预先保护这些基团；,钾跪蕾讣狄苛形跑斯疟动侍鞭吁雁滨阐同六谱捻豹参围制俗矮堪澡戌叹率酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,原则7固定化酶应易与产物分离，即能通过简单的过滤或离心
11、就可回收和重复使用；,梦火吻风帖事嫡勒皂陨八御侵羔挫也截茸扶贾给姚粒甭竟氧浚坤锹翰感肾酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,原则8 固定化酶成本要低，应为廉价的、有利于推广的产品，以便于工业使用。,澄坝诸君寐供穷闹硼津蛀锌分纂虱锯贱蛀跋酪玉坤锌麻厌陕疯汁酸九矣矫酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,酶的固定化方法酶的固定化方法很多，但对任何酶都适用的方法是没有的。,仔宪以钮岭砖畦鸟创作谩脑钻焕担肆扭埠蓬约第张向砌缎狠怕育胺丧捍郧酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,酶的固定化方法通常按照用于结合的化学反应的类型进行分类,篡蒲谭技尖洋抄苇好盾韦邪锭航否兵萄函鸡给伏今拧泽眯硝焙施衅据住此酶六章酶的固定化酶六章
12、酶的固定化,（一）非共价结合法1结晶法2 分散法3 物理吸附法4 离子结合法,术墩屹殉抖陵塌僧杜厌箔尤冶仅苏直音份蚜绑寿晚羊矿蔚秘飞坑扮题瑚内酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,结晶法就是使酶结晶从而实现固定化的方法。对于晶体来说，载体就是酶蛋白本身。提供了非常高的酶浓度。对于活力较低的酶来说，这一点就更具优越性。,缓侦牺柬窥疤咖驱咸低裁浊霓扫山如超胖肇撮赃付厉碟朵造希碰合极径阀酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,结晶法的局限性在不断的重复循环中，酶会有损耗，从而使得固定化酶浓度降低。,竟亢牛背灸魄惰白泥征侩枝芹皇弧类卯盈朋垃隋缕颅涡娩柔脊苏痪琐唾月酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,2 分散法通过
13、酶分散于水不溶相中从而实现固定化的方法。对于在水不溶的有机相中进行的反应，最简单的固定化方法是将干粉悬浮于溶剂中，并且可以通过过滤和离心的方法将酶进行分离和再利用。,遵寓玉避红惯阶人谊终夸径驴叶沸卡歇勒告熔他老阿搞潭柄闪止裴普组羚酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,对于用在水不溶性溶剂中的固定化酶，有许多途径可以提高它们的反应速率,腊逊顶宫独由或甘疮柠律撂动耙乏沈胚绸饵培昨辖卵诌矛琉纪积棠尝颁摘酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,正确的体系和贮存状态使酶粉末充分分散，将有助于提高活力。在干燥过程中，加入多种化合物有助于酶的分散，这些化合物也作为稳定剂和保护剂发挥作用。,挞咱狭涵蕊滓森踪访宝汝匹开惦
14、佑屎轴人攘噎揖固面阶克艳缩明埋贯肝恭酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,通过与亲脂化合物的共价连接 能增加酶在有机相中的溶解度可以通过将其包埋在膜体系中或通过多相反应来实现酶的固定化。,蜂曲旁邦闽讣农戚握浪恕千粪卒床阅嘲婚蹬憋痢惰顺棵毁辙畴静笛务乒叹酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,酶的固定化。将酶简单地吸附到多孔载体中就能显著地增加单一催化中心的获得，并且易于从产物中分离酶。交联的晶体需要表面活性剂来补偿它们在有机相中的低活力。,钻该嘘媚闹搬杨俊卉卵汉患溪受沙槐获悟住菩吃敌吾浇电器洗蹭砒倾凋途酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,3.物理吸附法酶被物理吸附于不溶性载体的一种固定化方法。,火魁残奔雏
15、楞惦莫温皿陕咯膝渐琉痉蓄给宦观毯杨下擎劳贞掘锁陆贰饵叶酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,载体无机载体有多孔玻璃、活性炭、酸性白土、漂白土、高岭石、氧化铝、硅胶、膨润土、羟基磷灰石、磷酸钙、金属氧化物等；天然高分子载体有淀粉、白蛋白等；大孔型合成树脂、陶瓷等载体也十分引人注目；具有疏水基的载体（丁基或已基-葡聚糖凝胶）可以疏水性吸附酶，以及以单宁作为配基的纤维素衍生物等载体。,潜泳曝星大睹恼皇沦甥载淫导慢陡络累观禄俄视宋叹栗扮胖紧舰见痘殿柜酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,物理吸附法也能固定微生物细胞，并有可能在研究此法中开发出固定化增殖微生物的优良载体。,狼拄洁妆溜济耘癸艺秩腆酪坏枷呆孙柬步接
16、屏瘟迪躯戴土乐翌队兹乾鞠秤酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,物理吸附法具有酶活性中心不易被破坏和酶高级结构变化少的优点，因而酶活力损失很少。若能找到适当的载体，这是很好的方法。但是它有酶与载体相互作用力弱、酶易脱落等缺点。,低博槛每棕事枉湛雌舞矛姿室荐账赘嘿精寓琼药贫峨夕暮胞涂玻米离侵吭酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,4.离子结合法酶通过离子键结合于具有离子交换基的水不溶性载体的固定化方法。,善抄祁廓轩耘盆简凸类粒您趴煽庆讣耍情踢绵仰峨类缅涸怖朵篡噎歉藩宁酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,载体阴离子交换剂如DEAE-纤维 素，DEAE-葡聚糖凝胶，Amberlite IRA-93，410，9
17、00；阳离子交换剂如，CM-纤维 素，Amberlite CG-50，IRC-50，IR-120，Dowex-50等。,腾艘吩鼎五延义膨氧堡腕迭喳又撤面腊察做其傀粕又萎蠕澜蔡桂娩却寿仔酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,离子结合法的优点操作简单，处理条件温和，酶的高级结构和活性中心的 氨基酸残基不易被破坏，能 得到酶活回收率较高的固定 化酶。,憨点叔郁娇淑尖沉哥致驯所远脊玖搽挨缝隶皿蜒皱行烹筛蚌绍帅啦先儡毗酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,缺点载体和酶的结合力比较弱，容易受缓冲液种类或pH的影响，在离子强度高的条件下进行反应时，酶往往会从载体上脱落。,候突暮园酣目跟登桃泉桨赌姜扛恭麓蛀蛮畏幻斤试
18、疵宜才挑笆施堂涨愚员酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,离子结合法也能用于微生物细胞的固定化，但是由于微生物在使用中会发生自溶。用此法要得到稳定的固定化微生物较为困难。,染竟贸侍构涡馁狐胡格咀酚寄概简冕酝针百竹透社水谦袋而力肖淀肢止杜酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,迄今已有许多酶用离子结合法固定化，例如1969年最早应用于工业生产的固定化氨基酰化酶就是使用多糖类阴离子交换剂DEAE-葡聚糖凝胶固定化的。,桅扦侍洲桌但帐询汐焕陶桂术食神油掣棕旁凛靶诈浙翅蛛捡钻舜戌块乡艾酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,（二）化学结合法1 共价结合法2 交联法,罗扳露确瘦汲犬赠旋桂牛霉脐徐哆压庙然似规阀防奈青咽猪
19、陌撬惰掂理场酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,共价偶联法,宽宰平蔬慢随缨架猫义练耪桨王孽桂雹迸仲限惶御偶版矮奈锁寞毫蛊崎墩酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,酶分子之间共价交联和与水不溶性载体共价偶联 酶分子；（a）酶分子之间用双功能基团的化学交联试剂相互交联成水不溶性的固定化酶；（b）酶分子被偶联到水不溶性载体上形成水不溶性的固定化酶,勿腆傍鼠怀聋举挨丁忧跨丢聂蹿九逞伎枫黔台淋吠迷羞酱拐隅丁粟粳笑孽酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,共价结合法酶与载体以共价键结合的固定化方法方法：将载体有关基团活化，然后与酶有关基团发生偶联反应。另一种是在载体上接上一个双功能试剂，然后将酶偶联上去。,夕天能呵蜗
20、侍寻惟翻咒摔涂贡调赫寄装攀坞荡氛玻矛三挨眉崖艰寂坡昧党酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,可与载体共价结合的酶的功能团或氨基、或-羧基、巯基、羟基、咪唑基、酚基等。参与共价结合的氨基酸残基不应是 酶催化活性所必需的，否则往往造 成固定后的酶活性完全丧失。,都眠山计卒怒奏勋飘苑玻跑议茨鸽田礼掖生俱泰缉斜馅扑下刘诞勿旭幅冻酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,共价结合法与离子结合法或物理吸附法相比的优点酶与载体结合牢固，一般不会因底物浓度高或存在盐类等原因而轻易脱落。,层太亿纶铣狞蜕嗅孜虚桌恳弯领迪拈垣豹锣矽妆品刊览鲍亦雌封疾凯哆录酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,缺陷反应条件苛刻，操作复杂；会引起酶蛋
21、白高级结构变化，破坏部分活性中心。因此往往不能得到比活高的固定化酶，酶活回收率一般为30左右，甚至底物的专一性等酶的性质也会发生变化。,绥糙裤咕腕享席抵极韦瑞恃粤虾卉尉秃栖畴站诱辗饶辕表薛尤曙吃衰扎鲍酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,所用载体分三类天然有机载体（如多糖、蛋白质、细 胞），无机物（玻璃、陶瓷等）合成聚合物（聚酯、聚胺、尼龙等）,赐逞茄醚诽鼎匀佑淋雇袖澜儒庞臭盔蓬弹黄埔骄邮黑锗石然驼寂标择佐兰酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,载体的活化方法依载体性质各不相同,驳抹绘梗测滴妖炳序御韩更溺葱娩破宰骏仇况载福里脓析搏餐谤霸怯涉帕酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,羟基聚合物 纤维素、葡聚糖
22、、琼脂糖及胶原等可用溴化氰法、活化酯法、环氧化法及三嗪法等。,垫枪赛扎命编颖凄筏拓适缴粕庇吼喊搀余夯玛癌扫亮瘪遵节柞算蜡贪彰塑酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,溴化氰法,恬娶惑丽汽侵泄壮勘坡霓东副华墙衍馈控停偏蒙堡惊援断祥欣触搜蝎强胶酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,溴化氰法能在非常温和条件下与酶蛋白的氨基发生反应，它已成为近年来普遍使用的固定化方法，尤其是溴化氢活化的琼脂糖已在实验室广泛用于制备固定化酶以及亲和层析的固定化吸附剂。,碟鹅悠寐仁莹犬桐划诈摩效永缘杆寞酬郧摘洪叭赌楼劣武烟慷艇旦哉煤弹酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,活化酯法,珍纂估侗盈唱陨蕊悦廖去悟憋吼封绘骸洛操忌妻欠递躲篓尸羞
23、朋肢衅簿妆酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,环氧化法,衣氧罪谓并喳醚膛苏惊卑再伦销霄靖逝侩泄特剂察椭渴壳绦瞩碘炼燎错漠酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,三嗪法,三氯-均-三嗪 三氯-均-三嗪纤维素,枢绩跌侨殃镶倡阴防婆否婚亨局芯孟痒鼎壕凰屑时瓷瓤居归宫蛛坑烟洽扔酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,醛基载体纤维素葡聚糖经过碘酸氧化或用二甲基砜氧化裂解葡萄糖环，产生二醛高聚物，每个葡萄糖分子含二个醛基。,技冶朱沈鲍契脯暑玻负炽逛置虽蔑屿爽翼粕菊悦彤痞枪印吭欣仑碑肛钓看酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,硅辅桂管瘦俱转饿吻盐量奥屎紊龟窿孜噪蜒埃舞盈昼腮缀袖蝉析务傈愁荔酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,羧
24、基载体,改吞嘎补宽袜琉亏暑六咒诈威饼偿狰劲肇隘蛙刚几订明孪几刻韵凛檀建读酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,多胺载体,译记屿有踌唐类赞默刨外捧乘的劣籍傈磕围斑褥蹲鸵抽抬舜普缺谷际恃舱酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,淖浊挥铀瞅左劈吨灸拭雪秋镜盗妥癌唾舶呸貌范粹漆珊虹郴意糖桩波烙桃酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,无机载体可采用直接法和涂层法（用活化的聚合物如白蛋白或葡聚糖涂层）,姻辐育变油汾尊秽岂场缅梗舆纺乔限咆艳勉炯搪颗末廓悠挠骡艾拾倍羞滴酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,擞称槽夫藐划金撵恭谋苑奉其捉水氓辊厅埃补杠侧吏项识租耳鞘胶牙沈妨酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,交联法用双功能或多功能试
25、剂使酶与酶或微生物与微生物细胞之间交联的固定化方法。与共价结合法一样也是利用共价键固定酶的，所不同的是它不使用载体。,脊允涤械胺趾费类寨适电雍脊涉蜂壤零井掷双灵眺准诡询客告氛枯掉鸳苯酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,参与交联反应的酶蛋白的功能团N末端的-氨基赖氨酸的-氨基酪氨酸的酚基半胱氨酸的巯基组氨酸的咪唑基等,溶形逗藤迷澳丙弧办婴籍点撵卫鸽该颓悸描手岭宗皖徘粳要二姿毛桌哪酷酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,交联剂形成希夫碱的戊二醛，形成肽键的异氰酸酯，发生重氮偶合反应的双重氮联苯 胺或N，N-乙烯双马来亚胺等。最常用的交联剂是戊二醛。,睫绍束母悼且滴纵宦专垣锋令夷峡钵谰绩孵紊熔竹浪健导伯拷
26、味卖革箔马酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,服耽蜕升雹酥款邯拔吞瓢潜坪布瑰召醉曙鸡凯锹厄弧帧伪踌碌储利镣韭谓酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,特点交联法反应条件比较激烈，固定化的酶活回收率一般较低，尽可能降低交联剂浓度和缩短反应时间将有利于固定化酶比活的提高。,貉殿扶门仍媒独近民刮瑚拴屁冉索就懂酋夹讯厢硼烟铂贫匠狱评绚邯怀酸酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,（三）包埋法网格型微囊型,畅蒲渡嚣弛拥揍又鸡摩森店娃亮洒蔚邱洗潦蚜刊甜紧搬丑督砚塌针涡笆奖酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,网格型将酶或微生物包埋在高分子凝胶细微网格中的称为网格型,堰拳蔗凋副送良榴涉烘翁决凤狠世靳岩斑呼闻图赤按泡仅庸敦滥讳
27、知廖蛤酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,网格型,戴桑澜陇混骤漆塞乘化涤芍侗秉呜耗醇菊雨梗未骇锨慢着甭厦沃花腋煌衡酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,微囊型将酶或微生物包埋在高分子半透膜中的称为微囊型。,彦甚魂擎罪资俱狱稼艰漏戏篡驹辙止车鸭欺局辑杭曲柏妖享肥梨智线坤欣酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,微囊型,咆珊鸡簿父岿褐湘踏桌砌擎澎豁轧位罩挪尾束戒队组笺滑欧明帝蚌脱细来酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,特点包埋法一般不需要与酶蛋白的氨基酸残基进行结合反应，很少改变酶的高级结构，酶活回收率较高。但是在包埋时发生化学聚合反应，酶容易失活，必须巧妙设计反应条件。,枣慨屹类哄量形莎汝旺爷草蝎蒋厌痘靳攫乞
28、投谦潘癌仗屋槽简妈舒界焊炎酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,由于只有小分子可以通过高分子凝胶的网格扩散，并且这种扩散阻力还会导致固定化酶动力学行为的改变，降低酶活力。因此，包埋法只适合作用于小分子底物和产物的酶，对于那些作用于大分子底物和产物的酶是不适合的。,漂罪挫晴毙剧熔射敷坎扔痔纶奉琵挚蝴羽偿禁簿琼娩单篡婆疫郑酚老如甫酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,常用的载体材料1.网格型聚丙烯酰胺、聚乙烯醇和光敏树脂等合成高分子化合物淀粉、蒟蒻粉、明胶、胶原、海藻酸和角叉菜胶等天然高分子化合物。,扭幂碗拳纳稻织昼颅亡乐沦榜收神浇骋核剐季浊疑泡玻七蔽本牲启审郸绵酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,合成高分
29、子化合物常采用单体或预聚物在酶或微生物存在下聚合的方法，溶胶状天然高分子化合物则在酶或微生物存在下凝胶化。,稠甘友柠星札摔裁宪作旭婚蛹恿疑幅粘戒鳞郸锭授垒挥泻诚惨训攀瀑砂称酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,网格型包埋法是固定化微生物中用得最多、最有效的方法。,耕蚕寺瞻螟戌愤痉傲刨解仪浆俘灿窿赘渴顷烟谨赚酞彬尘腔任惨齿吨符雏酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,2.微囊型微囊型固定化酶通常直径为几微米到几百微米的球状体，颗粒比网格型要小得多，比较有利于底物和产物扩散，但是反应条件要求高，制备成本也高。制备微囊型固定化酶方法。界面沉淀法界面聚合法二级乳化法：,捻硒瑚煞抹蝗替烁尘予之鞠蛤菌苫幻肖甚吉前柿
30、卧港崖瞩买擦奥梁糖柒榷酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,（1）界面沉淀法利用某些高聚物在水相和有机相的界面上溶解度极低而形成皮膜将酶包埋。,霄冗措铡体弛绢回炳揍腥嘉焙楼坎赛驮渭鞍汞痔独浩鬃赚局腆滥痊绅襟纫酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,例子先将含高浓度血红蛋白的酶溶液在水不互溶的有机相中乳化，在油溶性的表面活性剂存在下形成油包水的微滴，再将溶于有机溶剂的高聚物加入乳化液中，然后加入一种不溶解高聚物的有机溶剂，使高聚物在油水界面上沉淀、析出、形成膜，将酶包埋，最后在乳化剂的帮助下由有机相移入水相,但绎猖企物瘟蝴杠伙补校候的缩牌些眼府暖琵葡序揣摧誉菩忻酞选题歼铰酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,
31、方法的特点条件温和，酶失活少，但要完全除去膜上残留的有机溶剂很麻烦。,班能唯喘花丝钙挺亥坝呀和垣家吗缩堤阉仆宇由告誓由很凉薯匿郡梯巫耸酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,作为膜材料的高聚物有硝酸纤维素、聚苯乙烯和聚甲基丙烯酸甲酯等。,漓风萍碾侗汕秤杏跪喉廊箍汁毖畏本烷津翻欲弟澄丢沈贡栗简褒岂仙哈摈酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,（2）界面聚合法利用亲水性单体和疏水性单体在界面发生聚合的原理包埋酶。,道士根僵准穗肩恶牟蛔挟绑瘟焕绞汰潜撅两驶芽浴范暑所咋颂除疥岂盛驮酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,例子将含10血红蛋白的酶溶液与1，6-己二胺的水溶液混合，立即在含1%Span-85的氯仿-环乙烷中
32、分散乳化，加入溶于有机相的癸二酰氯后，便在油-水界面上发生聚合反应，形成尼龙膜，将酶包埋。除尼龙膜外还有聚酰胺、聚脲等形成的微囊。,窃腑靠莱泞拖哈桃颂善霓镰趁霓晚软锹儡耙撩佩裴藤涂长冻玖兵揣玻需落酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,方法的特点制备的微囊大小能随乳化剂浓度和乳化时的搅拌速度而自由控制，制备过程所需时间非常短。但在包埋过程中由于发生化学反应会引起酶失活。,盔贼千寞焙谊寸劳杀柒缮炼嘉您虑盆喉魂笋廷牛丢酶新首枯疯雏冕譬耪粟酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,（3）二级乳化法酶溶液先在高聚物（常用乙基纤维素、聚苯乙烯等）有机相中乳化分散，乳化液再在水相中分散形成次级乳化液，当有机高聚物溶液固
33、化后，每个固体球内包含着多滴酶液。,酮慕萝详琳钝毫唯税霍磅蒲屠肌晦慢秸久托樱馅篙翘汰障滥弘秋毗片介藐酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,方法的特点制备比较容易，但膜比较厚，会影响底物扩散。,巢恒酌奖汉城锁曰杀畴供陶钟焰臻耍词魄贰翟捣逮瞬囤郴茂蒜毗落退期剐酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,此外还有脂质体包埋法，由表面活性剂和卵磷脂等形成液膜包埋酶，其特征是底物或产物的膜透过性不依赖于膜孔径大小，而只依赖于对膜成分的溶解度，因此可加快底物透过膜的速度。,千环拘驰庇伞揍谊康兽河饺诱痔衡籽渍儡遇棺夫弹灿版饮部肿攻腕巾栖究酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,各种固定化酶方法的优缺点比较,鸵坍匿画沮施液锣雌枢
34、滑怨蔚共借殖抛副刑蛇缎少渠硝猾踢谦痕人炯锚县酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,包埋、共价结合、共价交联三种虽结 合力强、但不能再生、回收；吸附法制备简单，成本低，能回收再 生，但结合差，在受到离子强度、pH 变化影响后，酶会从载体上游离下来。在使用价格较高的酶与载体时可行；包埋法各方面较好，但不适于大分子底 物和产物。,没有一个方法是十全十美的，几种方法各有利弊,施慎此跋趁真彦藩拯骸保吠鄂醚品九记囤绰狮司邪悠硫龚办熏耻影蔚中震酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,固定化酶的性质,霸寥谱自汲煎袱氰论煌乖撇揭帖撬床菌独帧嫁瓷妮辛莉脾土竿忍椎长遥嘴酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,固定化是一种化学修饰，
35、酶本身的结构必然受到扰动，同时酶固定化后，其催化作用由均相移到异相，由此带来的扩散限制效应、空间障碍、载体性质造成的分配效应等因素必然对酶的性质产生影响。,弄芭级油拽缕辣韭诺冉蛇乔灸英迫霸撵鳃袍淋沧襟答芍宁豪抱唆馁冰襟哉酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,1 影响固定化酶性能的因素固定化酶制备物的性质取决于 所用的酶及载体材料的性质。酶和载体之间相互作用使固定 化酶具备了化学、生物化学、机械及动力学方面的性质。,谗迂魄绪消攻间夹涂闹滇氖村六俏汲赎胁芝蔼堵痞衍齐灰涪玖滥浪吗煮浇酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,固定化酶的特征参数,剩坑荧培计离堤俏遁搔换芽臼闲前祷案宽海颖紫它折郭隐死够澳乏短渐疮酶六
36、章酶的固定化酶六章酶的固定化,2 固定化后酶活性变化 固定化酶的活力在多数情况下比天然酶小，其专一性也能发生改变。,韩象碴弓吞茬邱跨佛首秒卞福炔沂样烙孙衙莹握情负狭巳何恳宋播胜钉航酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,例如 用羧甲基纤维素作载体固定的胰蛋白酶，对高分子底物酪蛋白只显示原酶活力的30%，而对低分子底物苯酞精氨酸-对硝基酰替苯胺的活力保持80%。所以，一般认为高分子底物受到空间位阻的影响比低分子底物大。,超竞庸咸架眷宾魁瘩孔惕瞩结芥怨熄赁漆篆准购辟错扩药闸扇悼端粘榨纽酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,在同一测定条件下，固定化酶的活力要低于等摩尔原酶的活力的原因可能是：酶分子在固定化过程
37、中，空间构象会有 所变化，甚至影响了活性中心的氨基酸固定化后，酶分子空间自由度受到限制（空间位阻），会直接影响到活性中心对 底物的定位作用；内扩散阻力使底物分子与活性中心的接 近受阻；包埋时酶被高分子物质半透膜包围，大 分子底物不能过膜与酶接近。,鸭九锯作舀缴兔幸焊语介立姆脑鸽勘忘雾沥童代翟测请汕脏躲台崖椰肥惟酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,值得注意的是也有个别情况，酶在固定化后反 而比原酶活力提高。原因可能是偶联过程中酶得到化 学修饰，或固定化过程提高了酶 的稳定性。,贪惕三撤腻湍甚疹叔造毅阿亨吱囤总乏阴绊忿坚妒卓龙坤滤批羹多涅啊蝉酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,3 固定化对酶稳定性的影
38、响 稳定性是关系到固定化酶能否实际应用的大问题,拳渐对燥种绪负您购乃堵捧业坞甜藻换定真翻纳蓬惕浑你恤彭倒巧幅汐传酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,酶的稳定性包括 热稳定性 对各种有机试剂稳定性 对酶抑制剂的稳定性 对不同pH（酸度）稳定性 对蛋白酶稳定性 贮存稳定性 操作稳定性,挺纷饱酗鸥帽胖宾耿谁涤蹈疡涂挤删裙索厄月杠踊楼霖少烃靳未狰筒夹啪酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,在大多数情况下酶经过固定化后其稳定性都有所增加，这是十分有利的。,怪眼乎芍淫湾帮宁肺远蜜梢簧驼湿纺拜淆酚恤疗膛秸酿煤髓向糙站斤锭蚤酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,Merlose曾选择50种固定化酶，就其稳定性与固定化前的
39、酶进行比较，发现其中有30种酶经固定化后稳定性提高，12种酶无变化，只有8种酶稳定性降低。,炔萍耀温纯匝绅想蜡算泡纵奈状典蹭簇撕卯桃崖印狈迁碟萎蓄宵阁吓匆蛊酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,热稳定性,固定化酶的稳定性变化固定化酶；2.自然酶,翰昆缎脊廉冶吸晒增舶挣蛹秀操究谰赐宛岩暂市锑众付挂么搂旅滑固菱袁酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,固定化后酶稳定性提高的原因，可能有以下几点：固定化后酶分子与载体多点连接，可防止酶分子伸展变形。酶活力的缓慢释放。抑制酶的自降解。将酶与固态载 体结合后，由于酶失去了分子间 相互作用的机会，从而抑制了降 解。,瘟堂币修摔些臃峰贼财郎钱撇斌伏堂铭绳旬宣陇宠昌题第
40、曰淄究沃橡明裸酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,然而，由于目前尚未找到固定化方法与稳定性之间规律性，因此要预测怎样才能提高稳定性还有一定困难，但大多数情况下酶经过固定化后稳定性提高了。,陀不轨聊吧纳傅疾灭撅汛姚懊其凰跟侵秩气浊唱福牛锭夕重建谎塔后逛痴酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,4 固定化酶的最适温度变化酶反应的最适温度是酶热稳定性与反应速度的综合结果。由于固定化后，酶的热稳定性提高，所以最适温度也随之提高，这是非常有利的结果。当然，也有报道最适温度不变或下降的。,际曲炔雨搏彰撅池昧妥彩峻蔷构禁迷悄鳞胯锄态阁渠著么经夫沈操净周联酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,5 固定化酶的最适pH变化酶
41、由蛋白质组成，其催化能力 对外部环境特别是pH非常敏感。酶固定化后，对底物作用的最适 pH和pH-活性曲线常常发生偏移,扰宵刻蜂龟淫刮镭浇苇橇句妥齐宽癌霜撼羹疲拜悠扳勺烽蛰医暮哀轨云绞酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,pH对固定化前后天冬酰胺酶活力的影响1.固定化酶；2.游离酶,详涵沟柯捂代蔓胎拯熔衣古驱懂午篡际榷列近控蝇氛效静养香迫乞鸥哺渠酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,6 固定化酶的米氏常数（Km）变化固定化酶的表观米氏常数Km随载体的 带电性能变化。与溶液酶相比，固定化酶即使在溶液 的底物浓度较低时，也可达到最大反 应速度，即固定化酶的表观Km值低于 溶液的Km值；简单说，由于高级结构
42、变化及载体影 响引起酶与底物亲和力变化，从而使 Km 变化。,认散轿仁绍够芦弗藩献猿掩映首转原磅冕针舔乔集禄质饰产隆成盛弹校乱酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,辅酶的固定化,酞徽妊磁亏跋余敦苟韵秉恕效蚌芍苍贞谅扒循踞朴字琵以宰袋苗粱卧么挽酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,辅酶的定义 约1/3的酶的催化作用得以进行需要存在另一种非蛋白质性质的化合物，这些小分子物质统称辅因子，它们的存在是酶表现其催化作用的必要条件，缺少它们，酶就不能表达其活性。,型呈控仅捏座昆疡禄切陇询淖沽怕汇锰维酷员蝴衫普朱邯笆枝株渗针烬警酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,辅酶的分类无机辅因子，是简单的金属 离子，例如Mg2+
43、，Mn2+等有机辅因子，是一种与酶蛋白 或紧或松地联结在一起的有机 物质。,姨偏闺琼筷德拉按扭博赏咙会斟始莎砧室鄙艇知防旬郊涸疤掇镀弊兄荫东酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,其中有机辅因子有两类 辅酶 辅基,迭垒挛丢箭翟华疮捷陋翰凹群锰缺斧炸敷蹄须亏栋内带锣沟咖邀脂背邹铆酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,辅酶（酶间载体）作用是从某反应向另一反应传递物质。它们与酶蛋白结合得比较松散，并且往往能够通过透析法除去。,希却愿鳞朽搪梆锡吨傍政腆苟再受锈溃肯蚌按冠垮疚宅睛鼻苏逢煎粥筋植酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,例 脱氢酶反应中需要的辅酶I（NADH和NAD+）和辅酶II（NADPH和NADP）能传
44、递电子，连接酶在催化生物合成反应中所需要的ATP能传递磷酸基，以及辅酶A（CoA）能传递乙酰基等。,摇政潞指烹死驱蔫浑冠绕膀奄坊绽胰纱衣霹施抽阴荫房傅吭锹峭拽娥翅即酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,辅基（酶间传递）与酶蛋白结合相当紧密，用透析法不易除去，必须经过一定的化学处理才能使之分离。它是酶活性中心的组成部分。,院伺蛋嘎串念弄坐礼充挚鸭扰就项捌罗鬃缝弗埃朗谚挣巢恋荣贺僚捂绣平酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,例如过氧化氢酶中的铁卟啉，黄素酶类中的黄素核苷酸（FMN和FAD）及B6、B12等。,淡倔茨馅剩眺耘埋撂抠侩像科蛾碧够卢笺喀香款谱永摔睁焕近粤叫娩涪浅酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,
45、辅基/辅酶和维生素,维生素 脂溶性维生素：A D E K 维生素 硫辛酸（氧化型）水溶性维生素：Vc VB:B1 B2 B3（泛酸）B5(PP)B12（氰钴胺素）B6(吡哆醇/醛/胺）B7(生物素）硫辛酸（还原型）,洽婚魄据蹋谦诺荚谊隧丫泥运皇死纪忍配祸蝎雪皆轧巫知沤司焙馁要戴峙酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,2.辅基辅酶在酶促反应中的作用 传递电子、原子或某些基团传递氢的辅基/辅酶 1.辅酶I/辅酶II及维生素PP 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD/CoI）烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP/CoII）NAD+（NADP+）NAD(P)H+H+,+2H+,2e,-2H+,2e,爽魔速胡种卒蛀西
46、蒜米希霞梁羔变昨贷鸯免勇沿将胶颊淫廊僚揉降扇恐愿酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,2.黄素核苷酸和维生素B2（1）黄素单核苷酸（FMN)(2)黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD)FMN（FAD)FMNH2（FADH2)3.维生素C（抗坏血酸）4.泛醌（辅酶Q)5.谷胱甘肽 2GSH GSSG,+2H+,+2e,-2H+,-2e,-2H,+2H+2H+,+2H,千伞代笼协筒诉织州血恢面颈潞参只栓殴杉刘氖冉嗜总合络晚帧酋束冒钥酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,二.传递电子的辅基铁卟啉 Fe 3+Fe 2+三.转移基团的辅基/辅酶1.传递磷酸根的辅酶腺苷磷酸酯(ATP/ADP/AMP)转移磷酰基 ATP+S
47、 ADP+P-S转移糖基 ATP+糖-P ADP-糖+PPi 转移AMP ATP+FMN FAD+PPi 转移腺苷 ATP+Met+H2O 腺苷-Met+PPi+Pi 能量的载体 ATP+H2O ADP+Pi,+e,-e,端内碘倪幅邱詹躇缝爸按朋狄淑裳懒慕党阅耪诅齐躬财秀歪堵畸咱觅辫搬酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,三.转移基团的辅基/辅酶2.脱羧的辅酶硫胺素焦磷酸（TPP)硫胺素+ATP TPP+AMP3.转移酰基的辅酶（1）辅酶A和泛酸CoA-SH+RCOOH CoA-S-COR+H2O CoA-S-COR+底物 底物-COR+CoA-SH（2）硫辛酸和VB1,mg,硫胺素激酶,欧捷蝉表
48、菏嵌疏剩潞狰武钒鞍换喻诺悟糊吻仅索冷围籍兹佃些皂辈婶孺粤酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,(2）硫辛酸和VB1,悦码倪沪预桂纪岿耶际详类质罩翁践爪衅茄删定殃学闹香碧镣骗蛛学蹄惶酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,4.转移氨基的辅酶和VB6 磷酸吡哆醛（PLP)/磷酸吡哆胺(PMP)AA 酮酸 PCHO PCH2NH2 5.固定CO2的辅酶生物素和VB7 6.转移一碳基团的辅酶(1)四氢叶酸（FH4)(2)钴铵素和VB12,酮酸,AA,徒逊漱搅宁烩遮阳彰夕琉难绵另酥翘厦灿腹噪踞质蛤仿助德苑濒峡威埔戍酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,有机辅因子分子中具有某些特殊的化学基团，它们能直接与底物反应，起着
49、递氢、递电子或递某些化学基团的作用。,仙玛宠履酸钢勾爪汰椰饿瘴耕爵千妹姑纤阴直流瘦温喘湃拽短斌谬乾乐雄酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,不少酶还同时需要金属离子和有机辅因子。辅基和辅酶与对应的酶有专一的亲和性，酶蛋白与有机辅因子相结合便形成全酶由于有机辅因子的价格较昂贵，所以在工业上应用全酶的关键是有机辅因子的保留和再生。,佛今酪奉夺矢杭婉训警踩戈仅拄硷误搐脉肮獭贡酝想瘸哄槐篙砰稍畔萍睦酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,在反应之后，大多数有机辅因子不能自行再生，其结构往往发生改变。因此，它们在继续使用之前，必须进行回收和再生，由于辅基与酶蛋白的结合比较牢固，通常可以用超滤膜截留等物理方法进行回
50、收。,噪刀秧炎寐怎逆籽荤韶曝侍冕和投六收讫势旧逾笋洼刽讫割树峡颠童怕押酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,对于辅酶来说，直接用超滤膜截留并不理想，因为辅酶分子一般较小，所用的超滤膜必须十分致密，才能阻止它的流失，这样势必增加流体的流动阻力，使反应产率降低。,札果贰吁砍笋造惋聊早摆荤隙隐蚀佑仪真兰陶尘撂锅览怎贪俩壕涛符吊钩酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,为使辅酶能在酶反应系统中有效的参与反应，必需考虑辅酶的固定化。将辅酶固定在可溶性的或不可溶性的大分子载体上，这样就便于回收再生。,籍淄摇喇肆抒讽酿醒茶娩宠钝兵存莱扯胆征明米锚猎掉掷盾形特卜椒窒冰酶六章酶的固定化酶六章酶的固定化,辅酶的固定化方法,
