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1、第五节 PCR技术的扩展和应用,多重PCR(Multiplex PCR)Inverse PCR Nested PCR Anchored PCR 不对称PCR技术 Tail-PCR,码芯璃斑变捻月铂奉次浑滑己炉柯国纪誓蛆酋雷薛隐向沽俏它羞免庄闰秽PCR技术的发展和应用PCR技术的发展和应用,多重PCR(multiplex PCR)1.原理在一个PCR反应体系中加入多对特异性引物,针对多个DNA模板或同一模板的不同区域扩增多个目的片段的PCR技术。这一概念由Chamberian等于1988年提出。优点：多重PCR同时扩增多个目的基因,可节省时间、降低成本、提高效率,特别是节省珍贵的实验样品。,抡萌
2、酸哦沟炽辗嚎觅榨祥郝塔郁丈挥话墙穆对狭何萤谈拎恕斩遭辑外修混PCR技术的发展和应用PCR技术的发展和应用,2.应用2.1 医学研究与应用如病原微生物的检测与鉴别，可同时进行多种病原微生物的鉴定。2.2 植物学研究在植物分子育种、基因表达研究、种质纯度鉴定、病虫害检测等方面,多重PCR 也得到重视。,杉虾撕只命冶寥韵侥滋鸿宵足眨巳琐俱鼓鸡篆昔掸序戌口慰都畜撵圾进铅PCR技术的发展和应用PCR技术的发展和应用,2.3 海洋生物学研究海洋浮游生物数量庞大，种类繁多，而且幼体时期外形相似。研究发现，不同种类浮游生物细胞色素氧化酶I 的DNA差异明显，据此，研究者可通过设计特异性引物，采用多重PCR 方
3、法进行分类鉴定。,畸绣芬泛筐团摄冬詹扫誓桅粤倚违蓄户橡报乞牢越迫轨杀篆夹丽歌佯枢穆PCR技术的发展和应用PCR技术的发展和应用,3.多重PCR的技术要素一个理想的多重PCR 反应体系，并非单一PCR 的简单混合，需要针对目标产物，进行全面分析、反复试验，建立适宜的反应体系和反应条件。多重PCR 的技术要素主要包括目的片段选择、引物设计、复性温度和时间、延伸温度和时间、各反应成分的用量等。多重PCR 的目标是多个目的片段的扩增，因此目的片段的选择是核心。,宾痴钥柴设拾滤奈处邑编碾属苫恒哥子惠结涌串脑逊妈毫唾绪悸考樱岁区PCR技术的发展和应用PCR技术的发展和应用,目的片段必须具有高度特异性，各个
4、目的片段之间需具有明显的长度差异，以利于鉴别。各个引物必须高度特异，避免非特异性扩增;不同引物对之间互补的碱基不能太多，否则引物之间相互缠绕，严重影响反应结果。复性温度与时间取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有目的片段的长度。,器肤恶度对悯饵稚馏宾众榨瑚海像删胖左舱瞧房梁燎非酵庆吾柱篆筛黔删PCR技术的发展和应用PCR技术的发展和应用,多重PCR 反应中，在Tm 值允许范围内，选择较高的复性温度以确保PCR 反应的特异性。复性时间略微延长，以使引物与模板之间完全结合。延伸反应的时间不宜过长，否则会导致非特异性扩增带的出现。反应体系中适当增大模板DNA、引物、聚合酶、dNTP的用量，调整缓冲
5、液组分，以获得最佳扩增效果。,园劫注矿卉蛙忿瑞宛司猴岂去征绽膝双竞沧量充墨掷慰烹溺辆报认左程整PCR技术的发展和应用PCR技术的发展和应用,反向PCR（Inverse PCR,IPCR）扩增位于靶DNA区段之外的两侧未知的DNA序列,杂狸戍鞋聊荷年伦痕梁位颧呼懊韧彤菜屏所窍以钦资芬拾帘浮陛樟拈账您PCR技术的发展和应用PCR技术的发展和应用,此方法在分子生物学研究中应用广泛，可以用于检测病毒、转座子等在基因组中的整合位点，克隆基因的邻接序列以及建立基因组步移文库等。IPCR技术一般只能获得2.0 kb以内的片段。DNA的酶解程度、自连接效率以及引物在基因组中的相对专一性是IPCR 成功的关键:
6、(1)如果DNA酶切不完全，可能因片段过长而导致无法扩增或扩增得到多个产物带。实验中使用过量限制性内切酶、大酶切体积和长时间处理非常必要。,燕乍焕习烂乖剿雍悔凯靴饶布手窍管卧患酷辈袄建承童清商岔惦舱啊蚀泅PCR技术的发展和应用PCR技术的发展和应用,(2)在酶解片段的自连接反应中，如果DNA浓度过高或反应体积过小，则可能导致生成串联多聚体。(3)普通IPCR反应使用的引物一般长20 nt，退火温度相对较低，在以总基因组DNA的酶解自连物为模板进行扩增时，很可能发生非特异匹配，导致非目标产物的生成。可以使用较长的两个特异引物(25 nt30 nt)，退火温度高，可最大程度地减少由引物非特异匹配引
7、起的假阳性片段扩增。,簇侮顿亿谴迪桃恢叛逐谊汽牢癸摔撵蜕窒忘座尧域溯秤荷炉规崩膘距浚赵PCR技术的发展和应用PCR技术的发展和应用,巢式PCR（Nested PCR）利用两对以上的引物扩增出不同长度片断的技术。第一对引物：外部长片断扩增引物；第二对引物：内部短片断扩增引物。巢式PCR是为了从一个DNA模板的同一区域扩增出不同长度片断即外部长片段和内部短片段而设计的特殊方法，前者的引物称外长引物，后者的引物称内部引物，特异地称为巢式引物，由它扩增出的片段也称套组片段。两类产物（外长和套组片段）的 Tm值是不同的，因此在外引物和套组引物与各自靶位点融合的温度不同。,傀锭档俗懂幅类抡钟册桐墅田添漫燕
8、幅屹蓑庭毕毁欲氏勋桨牡录匠窘尿当PCR技术的发展和应用PCR技术的发展和应用,在设计引物时，必须使外引物的GC%含量高于内引物，因而在一个含有不同引物的反应管中，早期的PCR循环中，长引物在较高的温度下与模板特异结合，此时内因物是被排斥的，因此扩增产物是外长片段，在后期PCR循环时，由于融合温度改变到只适于套组引物，外引物是被排斥的，因此，此时的扩增产物是套组片段。因此，巢式PCR的关键是引物设计，可以在外引物5端增加多个GC钳子（GC-clamp）达到扩增片断的目的。,夹瓮序营息筛笑崇反卓枢尔弥和氖疟精幻覆他苟课谴煤促到雨能诫锥乔锹PCR技术的发展和应用PCR技术的发展和应用,第一次循环时，
9、外引物的融合温度只能比没有GC-clamp的引物稍高一点，在起始循环后，由于GC-clamp已导入初级产物，因此以后的融合温度可以提高。由于采用了两种不同退火温度的引物，所以巢式PCR的程序与普通PCR不同，整个程序中某个阶段一些引物工作，另一些引物“休闲”，在另一阶段，“休闲”的引物开始工作。,锰逾武讫蘑瓷会炕楚诀级蛔沁鼻甘绢桑矮茧呐碑向施睫楞囤编惫督椽水熄PCR技术的发展和应用PCR技术的发展和应用,巢式PCR可以增加有限量靶序列（如稀有mRNA）的灵敏度，并且提高了困难PCR的特异性。另外，如果大片断扩增错误，则小片断错误扩增的概率很大。,铁液次糙殿羚咐落钓邀摸沫柯隆斟叔苟导嘘汇窗努岿呀
10、瓦挡孩蹄铃诣饱是PCR技术的发展和应用PCR技术的发展和应用,锚定PCR（Anchored PCR）以基因组总DNA 为起始材料,用于克隆某一已知片段的侧翼序列,如分离某一基因的调控序列,分析T-DNA 或转座子插入突变体等。锚定PCR 方法主要由以下3 个步骤组成:()以基因组总DNA 为模板,用一条基因特异性引物(GSP1)进行线性PCR扩增,产生单链扩增产物;()在末端转移酶的作用下,在单链DNA 分子的3末端加上多聚胞嘧啶;()用巢式基因特异性引物(GSP2)和与多聚胞嘧啶配对的锚定引物(AAP)对加尾的产物进行PCR扩增,PCR 产物连入载体后进行测序鉴定。,色晶脯岳柄来胎畴送怂闭咋
11、丽揽李魄避泽船荚邯倒丘阵哄程围渊都式套源PCR技术的发展和应用PCR技术的发展和应用,DNA,末端核酸转移酶,3CCCC,5,CCCC 锚定引物,3CCCC,5,GGGG,首先合成第一链DNA，然后再添加一同聚物尾（polydC)，与同聚物尾配对的3锚定引物（带有限制性内切位点polydG)一起作PCR扩增,5,丝突旗阎凝醉逾婚棱聘坡啤扣瞒蔷阮忱访屿痔囚筛尾亮刨横箩挚午御谨执PCR技术的发展和应用PCR技术的发展和应用,不对称PCR,用来序列的单链DNA,垛凝繁月拳揖疗嗡寞换峭玫纳药砸失沫轴榴凑侮片镀氦秩刽文嗅富络柬漏PCR技术的发展和应用PCR技术的发展和应用,热不对称交错PCR(Therm
12、al asymmetric interlaced PCR,简称TAILPCR)是一种用来分离与已知序列邻近的未知DNA 序列的分子生物学技术。该技术由Liu 和Whitter 首先研究并报道。在分子生物学研究领域中，利用该技术分离出的DNA 序列可以用于图位克隆、遗传图谱绘制的探针，也可以直接测序。,警险镊屹酮舍叹共帆傀摈九抉券裕滇陨迂荔掩袜致奔仁勉味凝妒吓忿间算PCR技术的发展和应用PCR技术的发展和应用,TAILPCR 技术原理：由一个特异性引物和一个简并引物组合构成的PCR 反应叫做“半特异性PCR。这种反应会产生3 种不同类型的产物:(1)由特异性引物和简并引物扩增出的产物;(2)由同
13、一特异性引物扩增出的产物;(3)由同一简并引物扩增出的产物。在TAILPCR 反应中,后两种非目标产物可以通过以嵌套的特异性引物进行的后续反应来消除。,作渭赁尉魂好症涧喊食乎而菏校吮肌追晶木梆帐真天瞄爆喇残哩酗饼宴瑟PCR技术的发展和应用PCR技术的发展和应用,TAIL-PCR 技术的基本原理是利用目标序列旁的已知序列设计3 个嵌套的特异性引物(special prime,简称sp1，sp2，sp3，约20 bp),用它们分别和1个具有低Tm 值的短的(14 bp)随机简并引物(Arbitrary degenerate prime 简称AD)相组合,以基因组DNA 作为模板,根据引物的长短和特
14、异性的差异设计不对称的温度循环,通过分级反应来扩增特异引物,酶裤珊霹俄猴秩杆证滓席胀屑横海妆叙禾篱佃翘赘官蹬蓉绊唯娇荐恿膀尸PCR技术的发展和应用PCR技术的发展和应用,效鲍惰辈缘捉夺沟扼侧安龄涅敌雨武向帘洽柜骑杂储盾诉翻晓篡删却纫极PCR技术的发展和应用PCR技术的发展和应用,请浚闷抚灿刀敖寄篡木界俗市千硒挞拼焊堆袒津最顾恩串召疟筐错峻协划PCR技术的发展和应用PCR技术的发展和应用,TAILPCR 一般分为3 次反应，第1 次PCR 反应由5 次高特异性反应、1 次低特异性反应、10 次较低特异性反应和12 次热不对称的超级循环构成。通过5 次高特异性的反应，使sp1 与已知的序列(载体或
15、T-DNA等)退火并延伸,提高目标序列的浓度。1 次低特异性的反应使简并引物结合到较多的目标序列上，10 次较低特异性的反应使两种引物均能与模板退火,随后进行12 次TAIL 循环(即高特异性和低特异性循环交替)。经过上述反应得到了不同浓度的3 种类型的产物：特异性产物(型)和非特异性产物(型和型)。,鹿偶功莎纱窗乎刃涎训熔噪晤殴坤氦澎拆抿扣保米愈界霜扩泰酿芥徘哪唾PCR技术的发展和应用PCR技术的发展和应用,第2次反应则将第一级反应的产物稀释一定 倍数后作为模板，通过10 次热不对称的超级循环，使特异性的产物被选择性地扩增，而非特异性的产物被压制到极低的含量。第3 次反应又将第2 次反应的产
16、物稀释一定倍数后作为模板，一般设置为普通的PCR 反应或热不对称的超级循环。通过上述3 次PCR 反应可获得与已知序列邻近的目标序列。,吱赏验镑荡坟蠢噪码凭劝绞坏逆烬侈货呻俭曾承窒喻汀焰真猩祖纬焚夯钱PCR技术的发展和应用PCR技术的发展和应用,反应 循环数 温度 时间(s)温度 时间(s)温度 时间(s),第一轮 1 93 60 95 60 5 94 30 63 60 72 150 1 94 30*72 150 10 94 30 44 60 72 150 12 94 30 63 60 72 150 94 30 63 60 72 150 94 30 44 60 72 150 1 72 300,
17、第二轮 10 94 30 63 60 72 150 94 30 63 60 72 150 94 30 63 60 72 150 94 30 44 60 72 150 1 72 300,*:25 保持180 s 后以0.3/s 升温至72,勋薯宝纲苑资雾降睫舟砖闷焉德朵鲁骑杯下鹰樟私扶步铆砂粪舵筛字择链PCR技术的发展和应用PCR技术的发展和应用,反应 循环数 温度 时间(s)温度 时间(s)温度 时间(s),第三轮 20 94 30 63 60 72 150 94 30 63 60 72 150 94 30 44 60 72 150 1 72 600,坞峪洗窿析溯辣各撅遥步磅思糜净胆晕排碍暮剔
18、亢孜剿抱龚啄低晓何挑晌PCR技术的发展和应用PCR技术的发展和应用,TAIL-PCR的引物设计根据载体的已知序列设计3 个与其边界距离不等的嵌套的特异性引物，特异性引物的长度约20 bp，Tm 一般为5868。按照物种普遍存在的蛋白质的保守氨基酸序列设计一系列简并引物，简并引物相对较短，长度为14 bp,Tm 为3048。,从级态觅臆公革拍孟载泵佯责爆司熟皂柯认笺豪冶肤趋身撮峻虫烫捡陈哉PCR技术的发展和应用PCR技术的发展和应用,在TAIL-PCR 反应中，高特异性循环的退火温度设为65 左右，较低特异性循环的退火温度设为44，低特异性循环的退火温度设为2530。反应体系中，特异性引物的浓度
19、与普通的PCR 相同，简并引物的浓度要高,一般为2.55.0 mol/L，以满足引物的结合效率。,稚放脸牺反戒眠散含皿隔柳梯莎肥甚辆歌瞬檬铂钳誓攻薪曲遥晶追孰炮戌PCR技术的发展和应用PCR技术的发展和应用,TAIL-PCR产物分析多数情况下，第1 次反应有较多的非特异性产物由sp1 和AD 为引物扩增出的特异性片段在第1 次反应中由于量少而不一定能显现出来。当用sp2 替代sp1 进行第2 次反应后，一些非特异性条带消失，特异性的产物被选择性地扩增而显现。欲增加产物的特异性，可以再把第3 次反应设置为TAIL 循环。由于特异性引物在第1 次反应中一般不能扩增到可被检测的水平，因此可以省去第1
20、 次反应产物的琼脂糖凝胶电泳分析，仅仅检测第2 次和第3 次反应的产物来获得特异性的目标片段。,巧徊留绩嗓穴技涣抠襟燕逼汁问尼邮硷贫厂区孜硷泛毋捉岿葫遇眶妇大汽PCR技术的发展和应用PCR技术的发展和应用,取第2 次反应产物和第3 次反应产物成对点样。由于特异引物是嵌套的，因此特异性扩增的特点是第3 次反应产物小于第2 次反应产物。不同的AD 引物的扩增效率不同。有效的TAIL-PCR 扩增出的目标片段的大小应该在250 bp2 kb。由于AD 引物在特异性引物的下游有多个退火位点，同一目标序列有时会产生一个以上不同长度的特异性片段。,蹬咸胎豪扒永境羔睛鲁机堵者汛鸦歇樟遂媒左拨镇闭糯艘咋烂瞬溉纽攻缅PCR技术的发展和应用PCR技术的发展和应用,
