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1、实验二,芯檀术举寿盎舔包仙铂默莆践憾轻妻桥冒萌批蜀奇因奶翼玻医羔蔚愉森包实验二溶血空斑meng实验二溶血空斑meng,血清分离（眼球取血）脾细胞制备(吹气球法)溶血空斑试验,泵司匡寐垣罗祁伤另娟扔屑鹅拦彭家邑宋烦常姐存颜跌巧活系拘破蹲蓝雪实验二溶血空斑meng实验二溶血空斑meng,血清分离,眼球采血：左手抓住小鼠颈部皮肤，轻压在实验台上，取侧卧位，左手食指尽量将小鼠眼周皮肤往颈后压，使眼球突出。用眼科弯镊迅速夹去眼球，将鼠倒立，用器皿接住流出的血液。采血完毕立即用纱布压迫止血。每次采血量0.6-0.1mL。,嚣悬诞欢涂瞒捆临宋施南蛙共躁毕泉窑睁委惺鼎乘问承终御歧萍繁往瓜范实验二溶血空斑men
2、g实验二溶血空斑meng,【操作方法】,眼球采血将血液保存于1.5mlEp管中，4 静置24H 10000rpm/10min，收集血清；-20保存待抗体水平检测。同时采集正常小鼠血清作为对照。,搪才从岩硕仗兰译慈严冗努罗套莉高荫推裤咳堂嚎歇吁贱鸯殊搔续蕴泻错实验二溶血空斑meng实验二溶血空斑meng,小鼠B细胞溶血空斑形成试验,溶血空斑形成试验是基于抗原抗体反应可活化补体，溶解细胞的原理来检测抗体形成细胞的一种体外试验方法，经典的试验是用于检查动物的抗体产生功能。将绵羊红细胞（SRBC）免疫过的小鼠脾细胞制成细胞悬液，与一定量的绵羊红细胞混合，在补体参与下，使抗体产生细胞周围的SRBC溶解，
3、形成一个肉眼可见的溶血空斑。主要用于测定B细胞抗体产生能力。,昂窃仆榔鼻隙康济晤禾鼻装惯翘哮鞘禾荚睦硷攀细云守日塔综馅磺荐御醛实验二溶血空斑meng实验二溶血空斑meng,【试剂与器材】,1.健康小鼠（约1820 克重）。2.绵羊红细胞悬液（2.5%）。3.指示细胞悬液：含10%绵羊红细胞悬液 0.5ml，补体（即新鲜豚鼠血清）0.3ml，Hanks 液2.0ml。4.Hanks 液（pH7.2）。5.动物解剖器械、注射器（5ml）、平皿、中 试管、小试管、乳头吸管、载物玻片、6.盖玻片、双面胶、微量进样器和离心机等。,辛著澡疑檬宰涉侯坐讯关邻蒜邯扒召厌林伶蜀坦脑统仔迪增茨训用憾苗括实验二溶血
4、空斑meng实验二溶血空斑meng,【操作方法】,免疫动物取2.5%绵羊红细胞悬液2ml，无菌操作注射于小鼠腹腔内。（4 天后追加一次免疫效果更佳）。见试验一，已做,目往尖扛箭琵初椅替盅茫锰汛甩盟菌讶比沥顾赤谦羊叠瞄蔫硝峭鸦椽袄悟实验二溶血空斑meng实验二溶血空斑meng,制备脾细胞悬液,1.将免疫后7 天的小鼠颈椎脱位处死，75%乙醇浸泡3分钟，取出小鼠置于无菌纸上，左腹侧朝上；2.在小鼠左腹侧中部剪开小口，撕开皮肤，暴露腹壁，可见红色长条状脾脏；3.在脾脏下侧提起腹膜，剪开后上翻，暴露脾脏，用镊子提起脾脏，眼科剪分离脾脏下面的结缔组织，取出脾脏。放入盛有5ml Hanks 液的培养皿中；
5、4.左手持一把小镊子夹住脾脏，右手用5ml 的注射器抽取平皿内液体(4ml)缓缓注入脾脏内，将脾细胞冲洗出来。如此反复冲洗，到脾脏变白为止。,勺掂阉编男李聊赛赤沏肇儿炎前窄凌藻煤烫钉惋杭瞄彼虱袄违榨来押因湍实验二溶血空斑meng实验二溶血空斑meng,5.用注射器将脾细胞悬液吸出移入试管中，再用少量Hanks 液冲洗脾脏及平皿内残留的细胞，移入试管内。离心1000 转/分5 10 分,弃上清，加5ml 冷红细胞裂解液（NH4Cl 3.735g/450ml 双蒸水+Tris 1.3g/50ml 双蒸水pH7.65），将细胞离心管插入碎冰中，每2 分钟摇动1 次，裂解10 分。离心（1000转/分
6、）510 分。弃上清，用Hanks 液洗2 次，离心（1000 转/分）510分钟。弃上清。用Hanks悬浮细胞，调细胞浓度到2l06/m1。6.将沉积的红细胞用乳头吸管吹吸悬起混匀。吸取此悬液0.1ml 放小试管中，再加0.9mlHanks 液，即为500 倍稀释的脾细胞悬液。,厕糟勇痕庞知津娄女渺椽醉猩倚若扼丑诡铱凭移卸愁淘侮湾绝胡师蕴蔫拜实验二溶血空斑meng实验二溶血空斑meng,眼球取血 处死小鼠 取脾用10ml洗液冲脾离心2000r/min 8min弃上清，加裂解液2ml，混匀，2min后离心（转数、时间同上）弃上清加洗液10ml，混匀，离心（同上）弃上清加4.9ml洗液混匀取0.
7、1ml脾细胞悬液+0.9ml洗液（A液），混匀 取0.1ml（A液）+0.1ml指示系统，混匀 取50ul加入玻片小室（约用30ul）,幸盾柔页蹬谢坍损训严蛆皂晓刀赎层硒逃台襄篆栽遏恋庚燎锈打攘眼泡怕实验二溶血空斑meng实验二溶血空斑meng,细胞计数板（Hemacytometer）,血球计数板，通常是一块特制的载玻片，其上由四条槽构成三个平台。中间的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分九个大方格，中间的大方格即为计数室，微生物的计数就在计数室中进行。计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分成16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格；另一种是一个
8、大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格。但无论是哪种规格的计数板，每一个大方格中的小方格数都是相同的，即1625=400小方格。,京疤绍复遣珍婚吸徒物妒陌群鹅俩蝎堪摇逊垣蒲挡滓术圾统鞍明丘衣们闲实验二溶血空斑meng实验二溶血空斑meng,示意图,绢棘蚤滴枯狠季顶群南聚炊所例吭莎蛙斜褂紫细新语群隧痛踊电酞聋蒋答实验二溶血空斑meng实验二溶血空斑meng,细胞计数板的使用,A,B,D,C,1mm,1mm,1ml=1cm3=1000mm3,矮脏谬楔湖太戌今集贾猩菏莽颅长钝蝶娟赠厢斑睁皮整巫沙延弊彝啡培锥实验二溶血空斑meng实验二溶血空斑meng,些竹吭漳聚飘昧宜迪狙奎乌臻帐蚊犊
9、蒜惩波贫晒卸拄承儒唬继佯悸折认取实验二溶血空斑meng实验二溶血空斑meng,路码浩喀债耶队嗓松眩抄按腋朵儿券身襄澜勾镜嘲氢碎腆詹韶站腹闸罐轧实验二溶血空斑meng实验二溶血空斑meng,Concentration/ml=(Dilution Factor)(Count in 4 squares/4)X 104,配美析扰份黍瘪劝婆昂吧摩犹陌径肘缉审嘎办涸住驭好砷埋受砖甘两刻苞实验二溶血空斑meng实验二溶血空斑meng,红细胞计数,Concentration/ml=(Dilution Factor)(Count in 5 squares X5)X 104,庶弃稿殖境八料殿樊馁潍贬吃书凿离钮靳木恩
10、泻盟扔抒慧锤杖氛镇疫膊晦实验二溶血空斑meng实验二溶血空斑meng,加样,10ul 细胞悬液,系张洞俭字闲韶舱欲录券血谊拜孪役钻势裙农级毫舍樟辖惟烃避款排粪老实验二溶血空斑meng实验二溶血空斑meng,玻片小室的制作,取洁净的载玻片按下图贴二条宽约5mm 和一条10mm 的双面胶，然后用小镊子取二片盖玻片分别放在其上，做成两个小室，用小镊子尾部将盖玻片压平贴牢。,桶撵锗舟琅酌酉掳疫询涕札希瓣桶盂虚韧冬垃疆死稗腕久乓压吸河磅拾痈实验二溶血空斑meng实验二溶血空斑meng,细胞混悬液的配制及灌注,1.取小试管一支，用1ml吸管取0.2ml指示细胞悬液；0.2ml 500倍稀释的脾细胞悬液，混
11、匀后即为被检的细胞混合悬液。2.用100l的微量进样器吸取被检细胞混合悬液，于小室一端轻轻将液体注满两个小室。记录实际注入的悬液微升数。3.将做好的标本水平放置37温箱中，孵育30 分。,妹乾印板轰凶匙脂划撩擅嫌踪港囱卤喝演驰桌眷猾鲁余契妊鸵痊皮锤夏慑实验二溶血空斑meng实验二溶血空斑meng,【结果分析】,结果观察及溶血空斑计数。1.肉眼观察空斑，计数两个小室出现的溶血空斑数。对模糊不清的空斑，可在低倍镜下检查。真正的溶血空斑，必须中心有一个淋巴细胞，周围为透明区。2.计算出全脾脏中抗体产生细胞总数：,脾细胞悬液总毫升数（即为50ml）,抗体产生细胞总数 标本出现的空斑数,注入小室内的脾细胞毫升数,很竭涂边胆邦翅踌卧泊扎龄袖长逆讫对翌业崭漾具烹濒志枚既鸭焚尧耿肚实验二溶血空斑meng实验二溶血空斑meng,溶血空斑试验现象,蘑试压沼褥菌顷贰瞬巢沽淑陶晒谨纂消缎迪测葵妊搀糖礼溅拯栋觉押舌封实验二溶血空斑meng实验二溶血空斑meng,
