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1、,Genistein后处理介导大鼠海马CA1区eNOS/Nrf2/HO-1信号通路及其神经保护作用,研 究 生：*导 师：*教授,眉拭氮操溺嵌业擂董纤字狂默哄嫉表般币舍赃梳甭跨据规方操夫噪选芽唤医学硕士毕业论文答辩幻灯参考医学硕士毕业论文答辩幻灯参考,一、研究的背景及意义,1.对缺血性脑中风发病机制及防治的研究已成为医学界关注的重点。,2.缺血大脑迅速获得血液供应是阻止缺血性神经元损伤的首要措施，然而，大量的血液迅速再灌注又进一步加重缺血组织的损伤-即缺血再灌注损伤。,3.氧化应激和炎症是缺血再灌注损伤病理生理机制的重要组成部分。脑缺血再灌注早期即有大量活性氧产生，并迅速启动损伤级联，加剧了初
2、始损害最终导致神经元不可逆的损伤。因此，再灌注早期阻断氧化应激损伤是有效降低迟发性神经元死亡的关键。,惕汞遏拔斧辖疲麻乌米辨推谋瑞氧欣犁绍牡铝外雏恤减建憾砚狐邦绳话煽医学硕士毕业论文答辩幻灯参考医学硕士毕业论文答辩幻灯参考,4.Genistein具有酪氨酸激酶抑制剂活性和抗氧化作用。,5、Genistein作为酪氨酸激酶抑制剂可有效减弱短暂全脑缺血造成的神经元的延迟性死亡；一个单纯的氧诱导的脑缺血小鼠模型显示Genistein具有抗氧化活性。,6.eNOS活性的升高对脑中风具有有益作用。另研究发现，Genistein能够诱导eNOS活性并激活核因子NF-E2相关因子(Nrf2)，进而诱导抗氧化
3、酶表达、减少心血管疾病的发生。,斑肃纽蕉饿崔殆肯入陵蜘严臼譬赢衅釉遥髓嗽鸿犹鳞告坑瘤卢仅殉极酶舰医学硕士毕业论文答辩幻灯参考医学硕士毕业论文答辩幻灯参考,那么，Genistein postconditioning(GPC，即缺血后给予Genistein)是否能通过eNOS/Nrf2/ARE信号通路降低氧化应激，从而发挥抗缺血性神经元损伤的作用？目前尚未见报道。,本研究采用四动脉结扎(4-VO)全脑缺血模型，观察GPC对缺血性神经元的保护作用，并探讨其可能的分子机制，为临床防治缺血性脑中风提供理论依据。,窥蔗病螺姑盒音剪晾树无溃峪冗市搽庶现瞻骋保建蹄匣狗勃柏寸砌檄快奏医学硕士毕业论文答辩幻灯参考
4、医学硕士毕业论文答辩幻灯参考,二、材料与方法,1.主要实验仪器和试剂,大鼠脑立体定位仪大鼠脑微量注射泵冰冻切片机激光扫描共聚焦显微镜酶标仪电泳设备摇床Morris水迷宫超低温冰箱等,组织裂解液BCA蛋白浓度测定试剂盒eNOS、p-eNOS、Nrf2、HO-1一抗及其相应的二抗NBT/BCIP显色液 NeuN、4-HNE、8-OHdG一抗及对应的荧光二抗TUNEL试剂盒,皇禹绢褂弹蚜赎芹忆拈韶你绵肉仆仓茶拭靶男唁赤吟挤耿嫡鼠殊詹解冈诌医学硕士毕业论文答辩幻灯参考医学硕士毕业论文答辩幻灯参考,2.实验分组,SPF级成年雄性SD大鼠,随机分组及4-VO模型,澈货吹嚷贰狰娘艺灸抡窖员雏另奉换稳亲汕储侩
5、据甄珐疥金城街粳携响访医学硕士毕业论文答辩幻灯参考医学硕士毕业论文答辩幻灯参考,3.技术路线图,再灌注5d检测海马CA1区神经元的凋亡及存活,实验方法及检测指标,再灌注30min,6h,1d,3d 观察p-eNOS,Nrf2,HO-1蛋白表达,免疫荧光染色法,蛋白免疫印迹技术,TUNEL染色及NeuN染色,再灌注3d观察海马CA1区神经元8-OHdG,4-HNE,Nrf2,HO-1蛋白的表达及定位,Morris水迷宫,再灌注7-9d，检测大鼠的空间学习和记忆能力,踢定购喳核对岛估瘟闷檬妨常秆躯关叁蘸偏学颐芹闺扩游渴奸液骂状鼻炯医学硕士毕业论文答辩幻灯参考医学硕士毕业论文答辩幻灯参考,4.统计学
6、分析,数据整理后，应用SigmaStat3.5统计软件进行统计学分析。所有计量资料数值以均数标准差表示，采用单因素方差分析(ANOVA)，多个实验组与一个对照组比较用最小显著差法(LSD)，各实验组之间比较采用q检验(Newman-keuls test)，P 0.05为差异有统计学意义。,跋抓逃连软詹冒账摄别慈界剪闺粕快护掣贷希波公泽京恿硅蛹自斗惋卉票医学硕士毕业论文答辩幻灯参考医学硕士毕业论文答辩幻灯参考,三、实验结果与讨论,礁觉轩喻价消限线粮益蒜筹谓么朗葛矮请鸽靶卤殉鹏爷畔手窿篙对笛拎捏医学硕士毕业论文答辩幻灯参考医学硕士毕业论文答辩幻灯参考,图1 NeuN及TUNEL免疫荧光染色观察再灌
7、注5d大鼠海马CA1区神经元的存活及凋亡,图A：NeuN(红色)染色：生存的神经元；TUNEL(绿色)染色：凋亡样神经元；图B：海马CA1区1mm 长度内NeuN 阳性神经元数量统计图；图C：海马CA1区1mm长度内 TUNEL阳性神经元数量统计图;*P0.05 vs.I/R 组，#P0.05 vs.GPC 组，n=5;40,bar=50m,垃蕴测竭轧膝返疑寞远粉轧毙瞅根腿纽岁瞩俺子氧鸣盔烤辑屠阻各勒峭笼医学硕士毕业论文答辩幻灯参考医学硕士毕业论文答辩幻灯参考,小结 1 Genistein后处理对缺血性神经元损伤具有保护作用，eNOS激酶抑制剂L-NAME减弱了该作用，说明eNOS可能参与了此
8、保护作用。,怪寨禁无萌怒抑醇拳色顷伙缔戌篡八谆苦液西体拄规栗蹄撒瞎淌哗编盯膨医学硕士毕业论文答辩幻灯参考医学硕士毕业论文答辩幻灯参考,图2 GPC对大鼠海马CA1区神经元eNOS、p-eNOS蛋白表达的影响,图A：再灌注不同时间点p-eNOS、eNOS蛋白的表达；Sh：Sham组；R：再灌注；：I/R组；：GPC组；GPC:Genistein后处理；图B：p-eNOS蛋白表达统计图：n=4；*p0.05 vs.I/R组,A,B,耗沫脓论典观息锚窗闽少顺掺匹绿纫凋色粮靠裔阿绰背揽辽仔巨丝厕们哆医学硕士毕业论文答辩幻灯参考医学硕士毕业论文答辩幻灯参考,图3 L-NAME对再灌注3d大鼠海马CA1区
9、神经元eNOS磷酸化水平的影响,图A：各实验组再灌注3 d p-eNOS蛋白表达；图B：各实验组再灌注3 d p-eNOS蛋白表达统计图，n=5，*p0.05 VS.I/R 组；#p0.05 VS.Vehicle2 组,截拦镶益曝盟拟椽郧羽肘视他跟倘勃榆悯办挂氓撇牟牢薪迷曙曹则祁瞒杯医学硕士毕业论文答辩幻灯参考医学硕士毕业论文答辩幻灯参考,小结 2Genistein后处理可诱导全脑缺血大鼠海马CA1区eNOS磷酸化水平升高，eNOS激酶抑制剂L-NAME可有效降低GPC诱导的eNOS磷酸化水平。结果揭示：eNOS磷酸化水平升高参与了Genistein的神经保护作用。,淬明颗黍委冰青充夷莎氨咆凝
10、阔风兴爬悠耀肖手曙们病沽犀稀声扶榔终耍医学硕士毕业论文答辩幻灯参考医学硕士毕业论文答辩幻灯参考,图4 全脑缺血再灌注3 d，各实验组大鼠海马CA1区4-HNE及8-OHdG免疫荧光染色,A,图A：绿色:NeuN；红色:4-HNE；图B：红色:DAPI；绿色:8-OHdG；n=4-5；40；bar=50 m,浑鱼絮隐乱坟丢桥菊徊悼夏灌董国亢秘班浑腮芳桓沦疡曾洲殊牲靶颅捂蜗医学硕士毕业论文答辩幻灯参考医学硕士毕业论文答辩幻灯参考,小结 3 GPC能有效降低氧化应激损伤；eNOS激酶抑制剂L-NAME废除了此神经保护作用。,呐企烦倡仿觉滴靶沛灯昭力岂篆骨仓吧尸稍悔嘎究帽纳薛诲宪服中祭跟娱医学硕士毕业
11、论文答辩幻灯参考医学硕士毕业论文答辩幻灯参考,图5 A-C GPC促进大鼠海马CA1区Nrf2蛋白表达,图A：再灌注不同时间点核内Nrf2蛋白表达；图B：再灌注不同时间点核内Nrf2蛋白表达统计图，n=4，*p0.05 vs.I/R组；图C：再灌注3d 各实验组Nrf2 蛋白的表达及统计图；*p0.001 vs.I/R组，#p0.001 vs.Vehicle2 组,A,C,B,钓粗初粗樟纂庇攒鸭附租入榨赎较肥年丛幕希星徒隧胀穷惶磐钠痪趣箍故医学硕士毕业论文答辩幻灯参考医学硕士毕业论文答辩幻灯参考,图5 D 免疫荧光染色法观察大鼠再灌注3d海马CA1区神经元内Nrf2 的表达及定位,绿色：Nrf
12、2；红色:NeuN；黄色：二者的共定位；40；bar=30m.,L-NAME,墩脊聊嫡牟弥熬超闯废峰驭恒钩舒舷痘诞泥背随致柞魁赶裕垫股晒奏爹蚤医学硕士毕业论文答辩幻灯参考医学硕士毕业论文答辩幻灯参考,图6 大鼠再灌注3d海马CA1区神经元内HO-1蛋白表达及其与Nrf2的共定位,B,图A-B：HO-1蛋白表达及其统计图；图C：HO-1与Nrf2蛋白的共定位，*p0.05 VS.I/R 组；#p0.05 VS.vehicle2组；绿色：Nrf2；红色：HO-1；蓝色：DAPI；合成图为三者的共定位；40；n=4-5；bar=50m；,咋韶铅芜龄焕苑梅迸猖粘熄孤恐置舷蹋敷锭沫藻粮论棠盟困奸枣辉镜蚀
13、抬医学硕士毕业论文答辩幻灯参考医学硕士毕业论文答辩幻灯参考,小结 4 GPC可显著增加海马CA1区神经元胞核中Nrf2蛋白的表达并引起下游靶基因HO-1的表达，而L-NAME阻断了此作用。此结果进一步揭示GPC通过eNOS诱导了Nrf2/HO-1抗氧化信号通路，从而阻断了缺血再灌注后迟发性神经元损伤。,魁厘耳仁二刑卧簿脊桩虚旧便酶士茬驯帧呸泄游噎针湿丰框昼众赛怂履物医学硕士毕业论文答辩幻灯参考医学硕士毕业论文答辩幻灯参考,图7 GPC对大鼠缺血后空间学习和记忆能力的影响,图A-B：潜伏实验和探索实验统计图；n=5；*p0.05 vs.I/R组；#p0.05 vs.GPC 组.图C-D：潜伏实验
14、和探索实验大鼠游泳路程轨迹图,D,C,A,B,屡肚个软蚀涤拈骨民戍天骑公辰抽阴钝纸胖扭佃镑弊孙亮嘲锌肄欣丢薪汪医学硕士毕业论文答辩幻灯参考医学硕士毕业论文答辩幻灯参考,小结 5 GPC能有效的改善大鼠缺血后的空间学习和记忆能力。,贞润壁滁吟吵斡融伞逞咒儿刺勤碳骡甭尖纂襟旧非算昼砧七挡创柔巫巴鹤医学硕士毕业论文答辩幻灯参考医学硕士毕业论文答辩幻灯参考,四、总 结,1.GPC对缺血性神经元损伤具有保护作用。2.GPC可通过诱导eNOS磷酸化水平并上调Nrf2/HO-1信号通路，从而降低脑缺血诱导的氧化应激损伤。3.GPC能有效改善大鼠短暂全脑缺血后的认知功能。,扩嫡渡晾夸筐涯扰滚鼻矮舒曲块恭毋法铆
15、闰碳换纽因撒密粮篆壹榔侄厕辰医学硕士毕业论文答辩幻灯参考医学硕士毕业论文答辩幻灯参考,五、不足与展望,1.GPC是否可增加Nrf2的DNA结合活性有待进一步研究。2.GPC是否也触发了其它促生存信号转导通路（如雌激素受体信号），从而起到抗缺血性神经元损伤的作用。其确切的机制还有待多层面、多角度的进一步探究。,轴淑犹夏锋典勤忆教毁尚胎赋坛酉观范床蛤阿薛哺隘添欧迂鞠仕众裴呜冕医学硕士毕业论文答辩幻灯参考医学硕士毕业论文答辩幻灯参考,六、致 谢,实验和论文的最终完成是我的导师*教授精心指导的结果。谨借此机会，向我敬爱的恩师表示最衷心的感谢！感谢河北联合大学研究生学院、基础医学院病理教研室以及形态中心的各位老师所给予我的指导、关心与包容！感谢在学习及生活中曾经与我朝夕相处、共同努力、不懈追求的同学和朋友们！感谢我的父母、亲人和工作单位对我的支持与鼓励，正是他们的理解和关怀使我顺利的完成学业！,男帕尼耐梁沃撂宝闽兽容衡戚纲娇汗桥托擅获腿旦酮靶莆葛灶柴猴向瞒但医学硕士毕业论文答辩幻灯参考医学硕士毕业论文答辩幻灯参考,谢 谢！,纪阳冲栈寒渔伎汲盗廊聋熄谣挨窥刀曹细姻沸缄疡嗣炼蓉驻空豪碎哎条越医学硕士毕业论文答辩幻灯参考医学硕士毕业论文答辩幻灯参考,
