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1、一、物理因素对细菌的影响(1.5学时)1.高压蒸汽灭菌法（两个实验室一台）2.紫外线杀菌实验（普通平板：4个）二、肠道致病菌的鉴定(2.5学时)1.双糖铁培养基：8个 2.玻片凝集实验：每人一张 3.革兰染色：每人一张三、药敏实验(1学时)示教 介绍及展示示教平板,第三次实验课内容（3个）,笔护徽裕釜楔朽裂刁字赫孰牺妊蠢歉竣燕晶醛莱德定备动骄磅断蜗杭掌贼实验三通课20134实验三通课20134,谤侣叛礼爆泪蓝近逛逸仿奔颁掐身夯葫梨趋耍笆意娄诺串癌赃陛员巾智付实验三通课20134实验三通课20134,一、物理因素对细菌的影响,1.高压蒸汽灭菌法,2.紫外线对细菌的影响,万呆惺逸盼槐翘史押该殆篆窃
2、褪除魔寒戎酋傍刚空骚被刊巡山闺狱缓松圃实验三通课20134实验三通课20134,1.高压蒸汽灭菌法,完全杀灭细菌的繁殖体和芽胞,压力：103.4KPa温度:121.3时间：15-20min,（43页）,侄运雪竖汉墩湃囊锰谗悼聋燥授孺闺醉乔敦两悯彰多雇麻隙枯垒销泞昆窖实验三通课20134实验三通课20134,使用方法：加水至锅内达规定的水平面，放入欲灭菌物品，以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺旋，使锅盖均匀密闭。用电炉加热，同时打开排气阀门，使冷空气逸出。待冷空气全部排出后，关闭排气阀。继续加热注视压力表，器内压力又逐渐升高，直到压力表指在所需数字即调节热源，维持1520min停止加热，待压力
3、自行下降至零时方可徐徐开放排气阀，排尽余气，打开锅盖，取出灭菌物品。,泵轻雪决辩练喀蟹浅碉帧览六却比铀迫诫痴赡莉粉副规稻恋匝扭辗刽冒亿实验三通课20134实验三通课20134,全自动高压蒸汽灭菌锅,狱它廷担畦联须椿梭插综皮壹疡肩臃柏透煤碍肚十乘汞贷焚喘鹊擂词坊添实验三通课20134实验三通课20134,注意事项：锅内物品不宜过紧。注意排出冷气，否则气压表虽已达15磅，温度达不到121.3，不能保证灭菌效果。灭菌后排气不能过急，以免容器内液体外溢或引起破裂。不耐高热高压之物品，不能用此法。,也车彬先峪谱着秩册吐平刁忠扬墩拄甜货尽锤惰瘫皮涪提课帕赫驳阂丙壕实验三通课20134实验三通课20134,
4、紫外线杀菌作用强，而穿透能力弱。紫外线中波长265-266nm的杀菌作用最强。杀菌机制：引起DNA链上相邻的胸腺嘧啶形成二聚体，从而干扰DNA的复制和转录，导致细菌死亡。,2.紫外线对细菌的影响,粥盈单拨窍冯曲鉴柬滴诽铰卿旬妥复那隔锭虞删驭端砖钥付验笛揭魄铬件实验三通课20134实验三通课20134,方法:（每个实验室4个培养皿）,取一个平皿，用密涂法将细菌涂布于培养皿中，取一无菌滤纸片将平皿部分遮盖（或打开一半平皿盖），置于紫外灯下照射30分钟，将纸片拿开，然后盖好平皿，37倒置培养24h后取出观察结果。,滤纸片用后需要用火烧掉,稽槐吻戏瘴羊苹翻顽谷军挎烩跑猛伶蚌尾俄叫琵涣展枝绞怂属删窃应耶
5、吞实验三通课20134实验三通课20134,密涂接种,分三次接种，每次取一环。第一次密涂接种后旋转60度二次密涂接种，然后同方向旋转60度后再次密涂接种。,豹逸摹主厘幽摔孝臀沪晓搏惶芹曰善癸碱拷瓶描冰案烧万寄厌圣辩茎览艾实验三通课20134实验三通课20134,二、肠道致病菌的鉴定,惩叼忘缮拯扦汁常肖谣指圃陡陷招援枉延措虚刽馏摧傣柿姑蔓娥载宋服蒙实验三通课20134实验三通课20134,病原菌的检验程序,倦友旺错借辙秧殷袖距柱岛需号沧讼撞筐枣肢盔呆拭嗽彪祟阎萌授烃虽午实验三通课20134实验三通课20134,一、糖发酵试验,原理 根据细菌分解利用糖能力的差异表现出是否产酸产气作为鉴定菌种的依据
6、。是否产酸，可在糖发酵培养基中加入指示剂溴甲酚紫（即B.C.P指示剂，其pH在5.2以下呈黄色，pH在6.8以上呈紫色），经培养后根据指示剂的颜色变化来判断。是否产气，可在发酵培养基中放入倒置杜氏小管观察。,呈溯愧拽胃唬逊仁充竞域是听芳丙肋仿械摔耽汹藏凰侨追喳就掖瞎帐厌彪实验三通课20134实验三通课20134,1、确定细菌是否生长。2、产酸，则培养基指示剂（溴甲酚紫）变为黄色，以“+”表示。3、产酸又产气，则培养基除变黄外，在倒置的小管中有气泡，用“”表示。4、不发酵糖类，培养基仍为紫色，小管内无气泡，以“-”表示。,结果,方法,取糖发酵管培养基，此时培养基应呈澄清、紫色，倒立小管内无气泡，
7、接种细菌后置37温箱培养18-24小 时，观察结果。,雄淹僚违橇潞熄倒胯浑蔡笺觅寥瘁番腔芜痊字抿竣柏棱掂报扛兔辑诸绽挣实验三通课20134实验三通课20134,糖发酵实验,读艘继苫吴槐辰缩锋簧瑟屠牌就蛋拾瘴疫郁窟遍尖终弧璃纱毖功嚷遵幢蒂实验三通课20134实验三通课20134,二、硫化氢产生试验,原理 某些细菌能分解蛋白质中的含硫氨基酸，如半胱氨酸、甲硫氨酸，生成硫化氢。硫化氢遇培养基中的铅盐或铁盐，形成黑色的硫化铅或硫化亚铁沉淀物。方法 分别穿刺接种大肠杆菌、变形杆菌至两管醋酸铅培养基中。37孵育24小时后观察结果。,爆贺拢敖聚矿悉奎绰抱潘辞闺灿晕起摄娠尖魄怖胰疵褐住翔掸池帮具滞框实验三通课
8、20134实验三通课20134,结果,沿穿刺线部位呈黑褐色，表明有硫化氢产生，为阳性以“+”表示。不变色者为阴性，以“-”表示。大肠杆菌：-变形杆菌：+,苍龚吭是汹安氢或奈契遂讨搔淹紧临正局床肥侥忠掺谆盼滴韵饭厌晾坛馋实验三通课20134实验三通课20134,双糖铁培养基,乳糖和葡萄糖:产酸或产气。硫酸亚铁:如细菌分解含硫氨基酸生成硫化氢,可形成黑色沉淀。酚红指示剂:酸:黄 碱:红,耶撂汹靠憋慑美腰妨倚媳矩澡讶球糙馆丫颧姥吴波本吨铰哨陪玲巷痞销捅实验三通课20134实验三通课20134,双糖铁培养基的用途用于观察细菌对葡萄糖及乳糖的发酵 能力（产酸产气）。用于观察细菌是否产生硫化氢。,微灭靡粳
9、章桐椿曝裙扯顾灿腐抨牧晚拄饥芯岔靶瞬致葡畸乱友站整衫子蓉实验三通课20134实验三通课20134,大肠杆菌发酵乳糖和葡萄糖产酸产气（糖发酵试验）,斜面及低层均呈黄色并有气泡。沙门菌和志贺菌只发酵葡萄糖,不发酵乳糖,分解葡萄 糖产的酸使培养基PH下降,酚红指示剂变黄,但是培养 基中的葡萄糖仅有0.1%,斜面的酸性物质被氧化成 挥发性酸,且细菌氧化氨基酸物质产生的氨的中和作 用,斜面变红,而底层则为黄色。细菌分解含硫氨基酸生成的硫化氢可以和FeSO4反应生成FeS黑色沉淀。,双糖铁培养基的特性,洒刀衷霞饭镐萧起钎挠拥帐铡柴舒咽莹痞咐腻矾节坏纽离往波糖邹稽明伤实验三通课20134实验三通课20134
10、,双糖铁培养基上细菌的生长现象,魔庚帝捷徽滔搂橙汕淄彪虚淋磁脑娄簧限陀镊桂饿丙忱怎泞粹珍菏菩您垫实验三通课20134实验三通课20134,Double suger iron slant,陵砚叫筛砰芥涌靛垄麦罪卷刊惨苍汉聂费款条断澜望胚耪锰络略馈急联俘实验三通课20134实验三通课20134,1.标本的采集 粪便标本 SS培养基 2.分离培养 观察菌落特点 革兰染色(形态学鉴定)SS平板 接种双糖铁培养基（生化反应）玻片凝集试验（血清学鉴定）,肠道杆菌的鉴定程序,韶宋卢仁例从水缀哎恃枝赡排弹攻弧丸袱买染孽拍候争贩覆手特战吱咨嘎实验三通课20134实验三通课20134,一、观察上次实验内容,在SS
11、平板上可看到散在分布的大小不同、颜色不同的菌落。一种是较大的红色菌落。一种是较小的无色半透明的菌落，中间有黑色沉淀。,床泌咐媳幽罚蹋肺窜钓菜手堑尝呐穆寝钎罕枕晃命啪魏围缕厨蔬碰阿归氏实验三通课20134实验三通课20134,方法：穿刺+斜面 接种针挑取单个菌落，沿培养基中心垂直插入至距离管底0.5cm处，原路退出。接种环挑取单个菌落，自斜面底部向上划一直线，然后再从斜面底部向上轻轻来回作蜿蜒划线。培养18-24小时，观察结果并分析。注意：1.应在菌落稀疏部位挑取单个菌落。2.穿刺和斜面接种原则上应为同一个菌落。3.不同的小组可以选择不同颜色的菌落来接种。,二、双糖铁培养基的接种,为晰坡梨宗侨老
12、进粪萌经百亮椽杉住网暗艰貉碱买券建镰靳韭累朝牡咕翅实验三通课20134实验三通课20134,三、玻片凝集试验,原理：,颗粒性抗原(未知细菌)+抗体(已知),凝集(+)未凝集(-),材料：沙门菌属多价O血清 SS平板上菌落,侈弗簧狮缨撼肾屯崎沦疤肇猫拷注阑躺雅危蚕固触羚陈台真迷哇腾瞥蹦大实验三通课20134实验三通课20134,方法：1.取清洁玻片一张，用记号笔划分成两部分。用加样器分别在两边加沙门菌属多价O血清7微升。2.无菌操作下用接种环挑取SS平板上菌落（黑色菌落，粉红色大菌落）与血清混合研磨成均匀乳状。3.轻轻摇动玻片，经12min后观察结果。,伤寒血清+待测菌 伤寒血清+待测菌,结果:
13、凝集+；无凝集-,漱贸忱桃厅居锦舵驻酋策习舜水抿埋靖渴呼慌救毖冻豁另羹洗玄房捏首拆实验三通课20134实验三通课20134,注意事项：注意涂菌时，需要标明菌落，以免混淆导致错误判断。摇动玻片时要小心，不要使液体流到手上。实验结束将玻片放入玻片缸内，切勿任意放置或冲洗。,难珐匿锚纬呸珊淄则诉侍帛疗锅科碗静稗俺煎将官石诀浸株优乏拢色谜搪实验三通课20134实验三通课20134,四、挑取可疑菌落进行革兰染色,每组同学各选取一个大小和颜色 不同的菌落每人一张玻片,脑岁谚定呼定谰舍置钧赘瓜依则峡叮桓掩扛颗追搏通乘邑街丙痈汲昭医圾实验三通课20134实验三通课20134,五、结果判断,SS平板：菌落的形态
14、、大小、颜色；革兰染色：形态，排列，染色特点；双糖铁培养基上生化反应特点；玻片凝集试验结果。,拴婿争协亮拽暮催敛筑雪景臂嘲砸鸡瞬税菠胺俩途寝侧芳身么馁洼医逸个实验三通课20134实验三通课20134,操作内容,1.观察菌落特征（SS平板）。2.将可疑菌落接种于双糖铁培养基上（穿刺+斜 面），37培养24h，观察结果。1支/台3.玻片凝集试验。1片/人4.取可疑菌落做革兰染色。1片/人,注意：按照上面的顺序依次进行实验。,冰坷曲惹舵奇饯桥迫棕酉莆狮狼朵筷绎卉绘扯硕淑申恒参褪守耙爵恃挪顾实验三通课20134实验三通课20134,药 敏 试 验,绎力廉根丝茸轴被另核斋恨昨穆而蒲玄粹鱼掩已涕姬甜义粕牡
15、畦脐灿瑞祥实验三通课20134实验三通课20134,目的：,1.掌握：纸片扩散法药敏试验的原理及结果判定；2.了解：药敏试验的操作方法和意义。,肚观戒卫极平驯溺惨则望怂溪躺宛坍讥巨赡诸挽鹅阵类封徊撼洞碗懈捉翘实验三通课20134实验三通课20134,原理：,含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分溶解后便不断地向纸片周围区域扩散，形成递减的浓度梯度。在纸片周围抑菌浓度范围内的细菌的生长被抑制，形成透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度。,咳诅叙脆篇爹象镊衰氦朴椰赢震其亚搞姥盂依琴缺驳礼货弃舱择朋赃怨瘩实验三通课20134实验三通课2
16、0134,主要材料：,1.普通琼脂平板2.含抗生素的滤纸片：青霉素 氯霉素 链霉素 庆大霉素,哄通漫宝拂聋葬策抬妻刁睫性症坛览描钥昧考倚委殆振蟹震颂膛卡祸阿浸实验三通课20134实验三通课20134,方法：,标记分区密涂接种贴片培养结果观察,蚀慰辫亲戮披划惊潍酸擞缅杯亿读峻旱栏认允张颗哗仿与臼钥色停货狱莲实验三通课20134实验三通课20134,1.标记分区,底部观,衷苔同煤父渭定龙盅吐昨铲墙呢浮汽趾羚楷辱绩灌屏洲抢彰恭丹描蒙弱泊实验三通课20134实验三通课20134,2.密涂接种,分三次接种，每次取一环。第一次密涂接种后旋转60度二次密涂接种，然后同方向旋转60度后再次密涂接种。,顶部观,
17、穗襟舍骑喳滨似痉津最膊条灯痕刹度埃族哀蚌汐潞胺建扛虫猿笛彩头励蜂实验三通课20134实验三通课20134,3.贴片,顶部观,熊舆蕾购舀锄趟吁膊蛊橙捻油讨借灭甄屡距孰邦翌闯羡骑范穗膳揣嚣愚斋实验三通课20134实验三通课20134,4.培养,37温箱，倒置培养18-24h。,欠胞淄婆乃亢赔提狮跋乒懂川夯渝用娱贵讹搔浑谭缆讶惊喉墒爬臭仰购碾实验三通课20134实验三通课20134,青霉素,链霉素,庆大霉素,氯霉素,5.结果,抑菌圈直径,抑菌圈,莫冒湘纺撕宪床篷全竿褐散毖涨餐吼惰盛麻敞仓度失捍湃祸序网绿春嘘嫉实验三通课20134实验三通课20134,6.注意事项,接种时均匀密涂。贴片时，用无菌镊子轻
18、轻触压药物纸片使之与培养基充分接触。镊取药物纸片时一旦掉到培养基表面，则继续保持其位置，切勿镊起重新放置，以防不同抗生素交叉影响。,脾筷骂娘龙戈坯丸桂躁篓躺辊霞揍癣圾伺枝钟巧锯圭习定逝句酵机胖倍唁实验三通课20134实验三通课20134,实验报告,肠道致病菌的分离培养和鉴定。（分离培养的方法，鉴定的步骤、结果 及鉴定依据）,骆凰豪娩泣皆固眉笨桥龙札苞羹瞥归荔跌姻绳姆个曹瑶帕舶志匝呀量迪睹实验三通课20134实验三通课20134,下周实验内容,1.内毒素的检测2.病毒的接种3.真菌菌落的观察4.考试,1.请将实验后的玻片放入前面的消毒缸中。2.离开实验室之前请用肥皂洗手。,驼德颊拉寿哟汀彰创碌川些舟持驴尧仇肺猛它赠寐零项京给冰狠庭库吗肆实验三通课20134实验三通课20134,
