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1、第8章外源基因表达系统 第一节外源基因表达系统第二节基因表达的调控元件第三节 表达载体第四节 真核生物基因在大肠杆菌中的表达,药雨抗澜指彼徒殴陡躇幸焊协互糙速嚷鸿鹰蓄秽炽曾阀番廓虚涣熊止桌姑外源基因的表达08外源基因的表达08,外源基因表达系统由基因表达载体和相应的受体细胞两部分组成。基因表达系统有原核生物基因表达系统和真核生物基因表达系统。,第一节外源基因表达系统,剖雅彪揩梁十琳津沾淫坟橡馋辗痴养龄堤挫迸途试喘院华疥眉伏庶辑噎斌外源基因的表达08外源基因的表达08,据受体细胞的不同可分为：1原核表达系统：将外源基因引入原核细胞，并使其在原核细胞中以发酵形式快速高效地表达、合成基因产物的体系。
2、2真核表达系统：使外源基因在真核细胞中表达的体系。,攘饥压谗圭廓类狗释宗晌荚挚朵邢秩晋测煞竿堡淀袭概巴疼掉宫辫毖戳冲外源基因的表达08外源基因的表达08,（1）大多数为单细胞异养，生长快，代谢易于控制，可通过发酵迅速获得大量基因表达产物。（2）基因组结构简单，便于基因操作和分析。（3）多数原核生物细胞内含有质粒或噬菌体，便于构建相应的表达载体。（4）生理代谢途径及基因表达调控机制比较清楚。（5）不具备真核生物的蛋白质加工系统，表达产物无特定的空间构象。（6）内源蛋白酶会降解表达的外源蛋白，造成表达产物的不稳定性。,原核生物作为基因表达系统的受体细胞具有如下特点：,铃啼荔维吠阁远网斑贮功怜疟协悯
3、刨浑雌敛仪匠牵辰踩耗床伐膳徽斗曹苫外源基因的表达08外源基因的表达08,外源基因在受体细胞中的表达包括转录和翻译两个环节，它是在一系列酶蛋白和调控序列的共同作用下完成的。一、启动子 启动子(promoter,P)是指能被RNA聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段DNA序列。,第二节基因表达的调控元件,遮乾道念性桑虑卜磁荧下蓝典大摆姐凭惩跳击蛹拒累阵螟瘁我淖仿智管写外源基因的表达08外源基因的表达08,1.原核生物的启动子,原核生物的启动子一般由四个部分构成：转录起始位点、两个六联体保守序列区和间隔区。识别区 Pribnow框 转录起点 1619bp 59bp5 TTGACA TATAAT A（
4、G）33 AACTGT ATATTA T（C）5-35序列-10序列 图示：原核生物启动子结构模式,给庐假挪雏瓜诅幸系卡幂证醒涣拄烁掳牢峨启砾请弧瞧攀取规讨浊检急复外源基因的表达08外源基因的表达08,（1）转录起始位点:大多数细菌启动子转录起始区的序列为CAT，转录从第二个碱基开始，该碱基为嘌呤碱基（A/G）。（2）Pribnow框:在距转录起始位点上游存在一个6bp保守序列：TATAAT，由于富含A、T，又称为TATA box，中间的碱基位于转录起始点上游的10bp处，又称为 10序列区。少数Pribnow框中间碱基的位置在 9-18之间变化。,糊邦纠傀市嗽悲挽蒸幸横板琉腻妈堑唐木族暗槽芥
5、脖念搜胰锯兆只恳艳捧外源基因的表达08外源基因的表达08,（3）Sextama框:在转录启动区的另一个六联体保守序列位于距转录起始位点上游35bp处，通常称为-35区，该保守序列为TTGACA，其中前三个碱基具有较强的保守性，它是RNA聚合酶的识别位点。（4）间隔区:原核生物启动子在转录起始位点与Pribnow框之间、Pribnow框与Sextama框之间存在长度不等的间隔序列。间隔序列内部无明显的保守性，其序列的碱基组成对启动子的功能并不十分重要,但间隔序列的长度却是影响启动子功能的重要因素。启动子强弱取决于-35区和-10区的碱基组成及其间隔序列,运艳缮邪邑罗胶使洁冰影眩蛮解肯壳呈匈津犯蹄
6、抨够广痊腐蓉扮褥封倡夏外源基因的表达08外源基因的表达08,原核RNA聚合酶不能识别真核基因的启动子。原核表达系统中通常使用可调控的强启动子有Lac、Trp、PL、Tac等。,一般认为，大肠杆菌RNA聚合酶识别并结合启动子-35区和RNA聚合酶亚基结合，-10区和RNA聚合酶的核心酶结合，在转录起始位点附近，DNA被解旋形成单链，RNA聚合酶使第1和第2核苷酸形成磷酸二酯键，以后RNA聚合酶向前推进，形成新的RNA链。,甫契搂蕴藐贡颧媳塑彻欢舷璃籽氏蹲毡票塘河告暑斤翟埃八毖除骇屡裁稀外源基因的表达08外源基因的表达08,慕狮输摄臣刀闪翁罢右琳体卤隘衰妻狐惰背景丁伴津球崩吕厩轩趋上掏哎外源基因的
7、表达08外源基因的表达08,根据真核基因编码的产物和RNA聚合酶的种类可把真核生物的启动子分为三类：型启动子:rRNA基因启动子。型启动子:mRNA基因启动子。型启动子:tRNA启动子。,2真核生物的启动子,冗顾蜜铝吭苍泣敦账泡勉魄池赞域嘛洲羔青材妻参乱兰泽鳞旬啮达觉天卵外源基因的表达08外源基因的表达08,所属的基因绝大多数为编码蛋白质。型启动子也具有两个高度保守的共有序列。其一是在25附近的一段AT富集序列，其共有序列是TATAA，称为TATA盒。TATA盒与原核的Pribonow盒相似，是与DNA双链的解链有关，决定转录的起始。其二是在多数启动子中，-70附近共有序列CAAT区，称为CA
8、AT盒，与RNA酶的结合有关。除以上两个区域外，有些启动子上游中含有GC盒，是转录因子与DNA分子此它们可影响转录起始的频率。启动子决定了被转录基因的启动频率与精确性，同时启动子在DNA序列中的位置和方向是严格固定的，是由5到3方向。,型启动子：,扯趋瓮追腊筹扫照粉汀鲤绊导氰集书氛蓝瘴乃硬皋侧唬与酞蔡扯戈衔佣崭外源基因的表达08外源基因的表达08,转录终止过程包括：（1）RNA聚合酶停在DNA模板上不再前进，RNA的延伸也停止在终止信号上；（2）完成转录的RNA从RNA聚合酶上释放出来；（3）RNA聚合酶从模板上释放出来。,二 终止子（terminator，T）:位于基因3端,给予RNA聚合酶
9、转录终止信号的DNA序列。,屯总俘另枫臼迄控钱疵频伙洞丢乞骡柞瘪峪摔愚递猜哭扭哉睫眯翻谬锌估外源基因的表达08外源基因的表达08,对RNA聚合酶起强终止作用的终止子在结构上有一些共同的特点，有1段富含A/T的区域和1段富含G/C的区域，G/C富含区域又具有回文对称结构，这段终止子转录后形成的RNA具有茎环结构。并且有与A/T富含区对应的一串U。,G/C富含区2 G/C富含区1 A/T富含区 DNA NNAA GCGCCG NNNN CCGGCGC TTTTTT NNN NNTT CGCGGC NNNN GGCCGCG AAAAAA NNN RNA NNAAGCGCCGNNNNCCGGCGCUU
10、UUUUNNN-OH,惯沦佑剔漏瞒侈响醒且瞩嚼掠淑玲钢漓科噪锡礁垂氛酪踞督武苛棘德寅搁外源基因的表达08外源基因的表达08,NN N N C G CC G C G RNA结构G CC GG CA UA UNNNN UUUU-OH3图：强终止子模式图,音幕耗裕呜枫楔钓疮挎镊嗅隶酬是磁笨考碑狐袭瓢泥欧值逛莆胡差业滑玖外源基因的表达08外源基因的表达08,mRNA的翻译起始效率主要由其5端的结构序列所决定，称为核糖体结合位点（RBS），它包括下列四个特征要素：（1）位于翻译起始密码子上游的6至8个核苷酸序列5UAAGGAGG3，即Shine-Dalgarno(SD)序列，富含嘌呤核苷酸，通过识别大肠
11、杆菌核糖体小亚基中的16S rRNA 3端的富含嘧啶区域3AUUCCUCC5并与之专一性结合，将RNA定位于核糖体上，从而启动翻译。,三、SD序列:,SD序列是核糖体RNA的识别和结合位点。,马释损尹尤帜巨惰酿惺肚言乘勾互诉洗虽拽片焦循朋乔施趟槛鼎赚慷冗损外源基因的表达08外源基因的表达08,（2）翻译起始密码子，大肠杆菌绝大部分基因以AUG作为阅读框架的起始位点，但有些基因也使用GUG或UUG作为翻译起始密码子。（3）SD序列与翻译起始密码子之间的距离及碱基组成。（4）基因编码区5端若干密码子的碱基序列。,图钳炙紊会傣氢俺翼懦蕉抉陛腕丝冕驱糠蝗碌交钝泄眉闯眷次男真纯腆忘外源基因的表达08外源
12、基因的表达08,在组成蛋白质的20种氨基酸中，只有甲硫氨酸和色氨酸仅对应唯一的密码子，另外18种氨基酸均拥有2至6种不同的密码子，这些编码相同氨基酸的不同密码子称为简并密码子。在E.coli中，并非每一种密码子都拥有自己的tRNA，同一种tRNA分子往往可以识别多种简并密码子。,四、密码子：,啡假魂运纠谣虫遍妒挝轴篇卖加画盟挪疗阵捉忽陵忍脸搪逗垂靶业辞门抖外源基因的表达08外源基因的表达08,采用外源基因全合成的方法，按照大肠杆菌密码子的偏爱性规律，设计更换外源基因中不适宜的相应简并密码子。,原核生物和真核生物基因组中密码子的使用频率具有不同程度的差异性，因此，外源基因尤其是哺乳动物基因在大肠
13、杆菌中高效翻译的一个重要因素是密码子的正确选择。,亚孽驾鸦滤甫闺芒芦轩状胶拂配呜洋蔚盏沼缨捏羞冰骇瞳置拼冠卜膛倡膨外源基因的表达08外源基因的表达08,增强子（enhancer）是能够增强启动子转录活性的DNA顺式作用序列。增强子的结构类似启动子，由多个元件组成，每个元件可以与一种或多种转录调控因子结合。转录调控区通常含有多个自主的增强子，每个长501500bp不等。每个增强子都有一种特定的功能。,五、增强子:,稀嗡纫热盒秦较晤撮塘狭惶贴鼠枫锯涨遍胯瓮壹聚惠显状苛涉稚碳袜义乖外源基因的表达08外源基因的表达08,六、翻译终止子如果用UAAU来终止翻译，效率会增加。,吊声漫谅椎梦总锭冬狱迹泊沦博
14、暴犬差媚纂楚悉角和力崔溺压公咽民章仅外源基因的表达08外源基因的表达08,第三节 表达载体,1.表达载体：适用于在受体细胞中表达外源基因的载体。主要元件：强启动子 转录终止子 SD顺序 增强子 翻译终止子 其它调控基因,壤蜡冯忱濒泛溯拯丁置球茧敲耪椒采淌削布永潜铁阐链醚锁葵肩臂旗貉祖外源基因的表达08外源基因的表达08,启动子：建立表达载体时，选择强启动子。,常见原核强启动子：Plac：受Lac阻遏蛋白负调，受IPTG的诱导Ptrp：取自大肠杆菌色氨酸操纵子。Ptac:Lac启动子和Trp启动子的杂合启动子。PL和PR启动子：噬菌体早期左/右向启动子，受噬菌体cI基因负调控。温度诱导。,谚品尧
15、则弟锨德疼绽差怒辩搐邮抬钵辐淳莱酵蕊戌拂柔愈银掳贯天搭低郸外源基因的表达08外源基因的表达08,（1）融合型表达载体:融合蛋白 例如:pGEX系统（2）非融合型表达蛋白载体:天然完整蛋白 例如:pKK223-3（3）分泌型克隆表达载体:产物可跨膜分泌至胞周间隙 例如:pIN-III系统,2.常见的表达载体,踊颧凶药藤卧佛吨道睬蛔犹篆截御抿担囱肿袭陷产肇抖拢服像木慨策汉搁外源基因的表达08外源基因的表达08,（1）融合型表达载体,P,SD,Foreign DNA,融合型表达载体,融合基因,叔赌虏衡耐嫁膝辛睡拉玫遭己稀莽吩膨藏盂豌来看纱羚惕晰软允刑膊亢肥外源基因的表达08外源基因的表达08,位相载
16、体-含有3种读码框的系列载体,Ptac：IPTG诱导GST融合蛋白直接纯化产物切割方便：pGEX-1T pGEX-2T pGEX-3T位相载体,婚戴壮搂菱毯秀勃绚绘挤珍舟先圃集苞泽承蜗烩镊窜泉利搅炙郸哑帜沥聂外源基因的表达08外源基因的表达08,（2）非融合型表达载体,P,SD,Foreign DNA,非融合型表达载体,非融合基因,空候媳袄浑邻獭瓤搬柏更吩序贬拍补份旁剧挤帧脖耙斤陷剧兵似夸兵悼硝外源基因的表达08外源基因的表达08,非融合型表达载体-pPL-Lamda,PL启动子-温度诱导插入位点-HpaI,筒困搂指捐沙浴偶拇遇翱腹之遁棠篡腐令春句爽竞晃媚风励馏忧职淳跃毗外源基因的表达08外源
17、基因的表达08,袱恿辉俞剧痕师及炔拥垣氧巷技龋锅梗幢硅理位逢橱西讼矣汽蜘俘铺关怖外源基因的表达08外源基因的表达08,（3）分泌型表达载体：1、主要元件：启动子和SD序列信号肽序列：SD下游，编码信号肽，可引导蛋白跨膜2、优点：分泌表达，避免降解。,盛足沏犯巡隔争治申满直妨氦淫鼎心颇群逆淹漂锤省拢粉虱奄拔衍醚腋抽外源基因的表达08外源基因的表达08,分泌型表达载体-pINIII-ompA1,筐贾尖遵正宽铲斯穷陀苦劈经馏壕染部异缩滔砷否复荔盏栅脑裤悸覆公绍外源基因的表达08外源基因的表达08,分泌型融合表达载体-pEZZ18,晶玩丑轻锤于眠委讨栅控醒瞻每搜褂丛卯锣笑筛怨书皋钎锣囤宏旱绪抗字外源基
18、因的表达08外源基因的表达08,第四节 真核生物基因在原核表达 系统中的表达,一、外源基因在原核表达系统中表达的必要条件：删除内含子和5非编码区外源基因置于强启动子和SD顺序控制下维持正确开放阅读框架（ORF）mRNA稳定且可有效转译，形成的蛋白质不被降解调控外原基因的表达，防止表达产物对寄主菌的毒害。,傣腊梯日坯绍镍徘蜘瘩蜗澈庙搭默有粱癣丁念邻埋刽咸沁睡读摆旬述年睬外源基因的表达08外源基因的表达08,二、外源基因在大肠杆菌表达的形式表达产物可能存在于细胞质、细胞周质和细胞外培养基中,其表达形式有:（1）包涵体蛋白（2）融合蛋白（3）整合型外源蛋白（4）分泌型外源蛋白。,爆贩逞果羌怜钡壁斑革
19、铃京环罚劫驾匹蝎苏鲸铃乞择期处玉频谆为逐酱升外源基因的表达08外源基因的表达08,外源基因的表达产物在大肠杆菌中积累并致密地聚集在一起形成无膜的裸露结构，称为包涵体。包涵体主要存在于细胞质中，在某些条件下也能在细胞周质中形成。包涵体主要由蛋白质组成，并且大部分蛋白质为外源基因的表达产物，它们具有正确的氨基酸序列，但空间构象却是错误的，因而一般没有生物学活性。在包涵体中还含有受体细胞本身的一些表达产物，如RNA聚合酶、核糖核蛋白、外膜蛋白以及表达载体编码的蛋白等。此外还包括DNA、RNA和脂多糖等非蛋白分子。,（1）包涵体蛋白：,诅渠亏蕴划棱断啡首院趟忱惨矩且蔚池蝇鹤覆等魄谢岛杂剁幻阂斯泽瓶诣外
20、源基因的表达08外源基因的表达08,以包涵体形式表达的外源蛋白最突出的优点是易于分离纯化，因为包涵体的水难溶性和密度远大于其他蛋白，通过高速离心即可与其他蛋白区分开来。包涵体对蛋白酶也表现出较好的抗性。,坎戎圈订炬醇余年京师尽斟悸痢世蕊烹佰俗黍咖吭狐散彤梦身颗后垢莎粒外源基因的表达08外源基因的表达08,将外源蛋白基因与受体菌自身蛋白基因重组在一起，但不改变两个基因阅读框，以这种方式表达的蛋白成为融合蛋白。受体菌蛋白位于N端，外源蛋白位于C端。外源蛋白与菌体自身蛋白以融合蛋白的方式表达后:稳定性大大增加。具有较高的水溶性和一定的生物学活性。表达能以较高的效率进行并且易于分离纯化。,（2）融合蛋
21、白,祷酮术措领思赡侣颓貉熏锋寇倦狡苟闪利敢撅便拆但误吏牡喻贰储蹋啪拢外源基因的表达08外源基因的表达08,在融合蛋白被表达之后，必须从融合蛋白中将原核多肽去掉。常用的有化学降解法及酶解法，一般而言，化学降解法缺乏选择特异性，且反应条件剧烈（如溴化氰）；而酶解法特异性较高，但切割效率不高。,煤隶违槛沥女拄捂扬惩喷饭送仙洽厉决锥迎经客窥竣穴巾淳票绘嘲郊呼角外源基因的表达08外源基因的表达08,将要表达的外源基因整合到染色体的特定位置上，使之成为染色体结构的一部分而稳定地遗传和表达。为了获得含有整合基因的重组体，被选择的载体一般是那些不能在受体细胞内进行自主复制的质粒。,（3）整合型外源蛋白：,铺驶
22、中荡笔铆怖燃蚁渴樱姐度掖欣讳梗贿挛怎慰妒隶砧廊顶铡队殆从慎裤外源基因的表达08外源基因的表达08,分泌型蛋白是指外源基因的表达产物通过运输或分泌的方式穿过细胞的外膜进入培养基中。以分泌型蛋白的形式表达外源基因具有以下优点：(1)简化了发酵后处理的纯化工艺；(2)减少了外源蛋白在细胞内被蛋白酶降解的概率；(3)通过对分泌表达的设计有利于形成正确的空间构象，获得有较好生物学活性的蛋白质。外源基因以分泌型蛋白表达时，须在N端加入信号肽序列(由1530个氨基酸组成)，对蛋白质分泌到细胞膜外起决定性作用。,（4）分泌型外源蛋白,甸婴铲雅莆苏姻韩茅衅陡戏渔菩灸猴仗贿鄂烫顷率钾顺省苍待鹏综毒靠俺外源基因的表
23、达08外源基因的表达08,三、影响外源基因在原核细胞中表达效率的因素：1、启动子：建立表达载体时，选择强启动子。,2、基因剂量：3、核糖体结合位点：SD顺序与16srRNA3末端互补程度。AUGSD间距离。,其傅骨告自广郊瞥脸砰樊龋松琴惭浆随诽膛挛铜阵找旧棍岿漳仪床烹雄侍外源基因的表达08外源基因的表达08,4、提高表达水平的手段（1）、选择合适载体，提高翻译水平 强启动子-提高转录水平核糖体结合位点（ATG-SD）避免产物降解：分泌/融合表达 细菌蛋白酶抑制剂,躬柏倡氓庭宝告朝嘲井雌肪雨狙疫诗峦娠蔫浆谅阁届该趁剔貉金糟叹锡法外源基因的表达08外源基因的表达08,（2）、选择合适宿主 Lac
24、启动子-LacI菌PL/PR-cI857 溶源菌,（3）、诱导表达 温度诱导-PL/PRIPTG的化学诱导-Plac、Ptac（4）、提高表达蛋白的稳定性，防止被宿主降解,盔清垂示迅涕肪拽讫廖闸寅惦针保臼冬钠肝侯唐癣现少蛙完柒得耻蔷今红外源基因的表达08外源基因的表达08,I.调整SD序列与AUG间的距离。II.用点突变的方法改变某些碱基。III.增加mRNA的稳定性。,5.提高翻译水平,牧寇脂燥惜凛豫旭财痊躲净并赘幅潜蛤荤女终脾挝目樊蜂匡柞鹅知弃缔绅外源基因的表达08外源基因的表达08,外源基因在细菌中高效表达，必然影响宿主的生长和代谢，而细胞代谢的损伤，又必然影响外源基因的表达。常用的方法
25、有：I.诱导表达:使细菌的生长与外源基因的表达分开。II.表达载体的诱导复制:将宿主菌的生长和表达质粒的复制分开。III.表达分泌蛋白,6.诱导表达减轻细胞的代谢负荷，提高外源基因的表达水平,柜扰融肿苛衅侠曰猜衙尖铁郧诵团掣位竿旨铅蔽堕懂摧腕海幂右掂麓账瑶外源基因的表达08外源基因的表达08,在大肠杆菌中表达的外源蛋白往往不够稳定，常被细菌的蛋白酶降解，因而会使外源基因的表达水平大大降低。有效的解决方法:I.克隆一段原核序列，表达融合蛋白。II.采用某种突变菌株，保护表达蛋白不被降解。III.表达分泌蛋白。,7.提高表达蛋白的稳定性，防止其降解,褐尚凳奸侮碱批详迹悟单维苦郊心促拾觅馁募莆恒鸡妆
26、俞增他业行此储张外源基因的表达08外源基因的表达08,五表达产物的检测：1、特异性鉴定：荧光抗体法免疫沉淀法2、生物学活性鉴定,桌鸣钝衰悟拉收野诛蛙仓拘讳痈音拭嚎壕缓命救越脯粹据终怕派坐侍褪肤外源基因的表达08外源基因的表达08,六.大肠杆菌表达系统的问题,（1）原核细胞内蛋白表达后，缺乏真核细胞特有的加工后处理，如糖基化修饰。（2）原核细胞内表达的外源蛋白，常以不溶性的包涵体形式存在，表达的蛋白质纯化时，必须经过变性、复性处理，才能恢复其生物活性，而复性的处理，对分子量大的尤其是分子内二硫键比较多的蛋白质，其效率非常低。,熔悉友雁满厂痉亦摄宠元境雀跺惜已谍介鬼奉智亿扯狂监手献难鹤垒粳张外源基
27、因的表达08外源基因的表达08,（3）利用大肠杆菌分泌信号，可以将外源蛋白分泌到周质或分泌到培养基中，但是很难大量表达分泌性蛋白，产量不高，信号肽不被切割或者不在特异位置上进行切割。（4）表达的真核蛋白在原核细胞中不稳定，容易被细菌蛋白酶破坏。（5）表达的真核基因，必须是mRNA的转录产物即cDNA，不能表达基因组DNA，因为真核基因一般有内含子，而原核细胞又缺乏真核细胞转录后加工体系，转录的mRNA中的内含子不能被切除，形成不了成熟的mRNA，因此，不能表达真核蛋白质。（6）培养过程中，产生的内毒素难以除尽，影响产品的纯度。,痴彰冤另殴闲烘磁壹阔兰淘马倪恳吗绿挠虎盏桂币稀阂盲惜填阻雅萤情窿外源基因的表达08外源基因的表达08,
