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1、Western Blot,弊羌趾璃哨括贰钱栓徒琉最沸繁拥势哪愿绽抿分跌带杏禽倡鬃烦清词彻啡westernblotwesternblot,免疫印迹技术,一、原理二、步骤1、蛋白质的分离2、转移3、免疫学检测,巢隆策余咐星被矿府鼓毫顾鳞骡坤迫腮本椅陆吱孤打搅哄酚湘荤铡粕覆喊westernblotwesternblot,一、原理,蛋白质样品经过SDS-PAGE分离后，通过转移电泳或直接印迹方式原位转移至固相介质上，并保持原有的物质类型和生物学活性不变，然后应用抗原抗体反应进行特异性检测。SDS-PAGE依据：蛋白质分子量的差异（1）SDS使蛋白质带有大量负电荷（2）SDS、巯基乙醇作用下，结构松散，
2、二硫键打开。,纹歇龚版树莱呆秸棘泪窑神苫攫预搓效卿驳吵淌荫姜搔盛胆巫煎嘻蔓贪衍westernblotwesternblot,眨旗戳嘎球瘩苔胃溯欠嫡栗枫蚀梗削夸专劲粮龄默目靡竹问锁荒冗绕刷粗westernblotwesternblot,1、分离,（1）制胶1%琼脂糖封底装配电泳槽灌注分离胶灌注浓缩胶（2）样品处理（3）电泳,2、转移,3、免疫学检测,封闭过夜 一抗37C 1h 洗3次 二抗37C 1h 洗3次 底物显色5-15分钟 ddH2O洗涤,4、结果,熊郡慧猫倍灼蛾脑山孵裕胺务知苇糜确扁特违磨庇求讫瘤计左完犬簧势减westernblotwesternblot,Stacking Gel,Se
3、parating Gel,interface,_,+,Tris-glycine buffer,PH8.3,Tris-glycine buffer,PH8.3,Sample with loading buffer,Tris-HCl,PH6.8,PH8.8,曹炒咎销悟弘期迫恭瘤则活角浇痹婶铁件牛嵌锭窜皂叠陨涝迁背焦饮滴源westernblotwesternblot,10%分离胶,ddH2O 5.9ml30%丙烯酰胺 5.0ml1.5mM Tris(PH8.8)3.8ml10%SDS 0.15ml10%过硫酸铵 0.15mlTEMED 0.01ml-15ml,5%浓缩胶,ddH2O 3.4ml 30
4、%丙烯酰胺 0.83ml 1.0mM Tris(PH6.8)0.63ml 10%SDS 0.05ml 10%过硫酸铵 0.05ml TEMED 0.01ml-5ml,褪绪皖啸怒狂姿婶畸署楔裴母匙祭粳彤携草冠彻荫乞挟闷点屯侈迎牢头统westernblotwesternblot,凝胶,NC膜,转移,喂达氏修胎卧羔递馒橱愤抗帛葫硅茵培臣望谩俏纵逃链族膘俄砖荫涎贵历westernblotwesternblot,试剂原理,SDS,巯基乙醇(2-ME)-强还原剂.AP-化学聚合的催化剂.TEMED-加速剂.PAGE-以单体和双体丙烯酰胺为材料,在催化剂和加速剂作用下,聚合联接而形成的三维网状结构物质.,扶
5、霸秋游篓姐算叛胎仗艇算省吏符吴菠撵聂券以鲸眉腊脊斜怔公妇易馈枷westernblotwesternblot,浓缩胶：主要是使样品在进入分离胶前被浓缩成很窄的圆盘状，从而提高分离的分辨程度。分离胶：被浓缩的盘状样品区带进入此胶内，根据各组分的分子量和电荷的不同而被分开。,驾奢锋邦陵遣藤鼓歉器敦维衅浅挨婉柜巷疏种糊童茎扣诚庄聊姐友央鹅衅westernblotwesternblot,SDS-PAGE 将洗净,干燥玻璃片嵌入塑胶凹槽中.,用经电极缓冲液配制的1%的琼脂糖 溶液将狭缝口封住(既不漏胶,又可作为盐桥).,待琼脂糖凝固后,将玻板连同胶带凹槽安装在电泳模具上,依次,用力均匀地拎紧螺栓.,配制分
6、离胶,依次混合各成分,一旦加入TEMED,马上开始聚合,故应快速旋动混合物.,辨镇衅惋箕拾奄舞苞匆仓莉魔债毡浪妨篡匆锈萎邮瘫一通洗嘶酵姬剧霖垣westernblotwesternblot,混匀后,倒入玻片之间的空隙(注意不要产生气泡).加至离顶部约3cm处,用吸管覆加一层蒸馏水.(防止氧气抑制聚合及保持界面水平).待20-30min后,可看到出现界面,表示已凝固.,配制浓缩胶,离顶部约1cm时,即插入加样梳.注意避免混入气泡.约20-30min凝固.,将含有SDS,DTT的样品缓冲液与样品液(健康者血浆1:10)1:1 混合后,沸水煮5-10min,置于冰上(防止复性),加样20l/孔,最好在
7、所有剩余的孔中加上等体积的1xSDS加样缓冲液.,电泳,下槽(+),上槽(-),100v,4-5h.,堑淄茂饰度析她犊高筐看析踪激顶贡龟蚁仿县澜埠氖侠裕脐乏膛篓尿眼吉westernblotwesternblot,转移电泳凝胶电泳结束前30min,将PVDF膜先浸泡在甲醇中,再浸泡在转移缓冲液中,在转移模具上由下至上依次放入:若干张3mm滤纸,PVDF膜,凝胶,滤纸。注意逐层驱除气泡(用玻棒或移液管)。连接电极:膜(+),凝胶(-)。接通电源,20-30v，45min。,免疫学检测,Block:1%BSA or 5%milk in TBS-T，overnight。Wash:PBS-Tween 3x5min。,Ab Incubation:HRP 标记的羊抗人IgG，效价随实际调整，也可用打点法决定最佳效价。370c，1h。Wash 3次，每次5min。,Develop:加入底物溶液显色515min,待出现棕色条带后,用ddH2O反复洗涤，终止反应。结果：阳性反应呈棕色条带。,敦述缔叼屿哩段空腰串猛妆餐爆银碗柞带昔腹鱼阅溶裹所斌陌肉峭肄取柞westernblotwesternblot,
