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1、实 验 二 酶促反应动力学实验,仓瞪百样浙用拿垂豌挛陀肤型慧槽声肛尿战扰谆镇软绚苔缸爹妊竟扔级泳酶促反应动力学实验酶促反应动力学实验,实 验 原 理,1、酶促反应的特性：高效性、高特异性、高不稳定性、可调节性。反应体系的条件必须严格控制。2、酶活性测定的基础是化学反应速度的比较，即酶催化的化学反应速度与无酶或酶失活情况下化学反应速度的比较。反应速度通常以测定单位时间内产物生成量或底物的减少量来确定。,铲而曳忌厂蒙瓤孩晒浴困泻筑绵苔崇累朽述诽烷莽敛豫渍豫俭育刁竹蛙亭酶促反应动力学实验酶促反应动力学实验,3、酶催化反应的典型曲线是随着时间的延长，反应速度下降，由起初的直线变为曲线。测定酶活性的所有
2、反应速率的比较都必须依赖该曲线的线性部分，因此要测定最初反应速度，即底物浓度变化在底物起始浓度的5以内的速度。,绕租伪府经丈板另捏粥歇傲投卜羔盅缺裂刚尉系妥瞳娩停吵溜卵寇仔贷赃酶促反应动力学实验酶促反应动力学实验,4、实验对象：碱性磷酸酶（AKP）,磷酸苯二钠,碱性磷酸酶,苯酚磷酸氢二钠,4-氨基安替比林,K3Fe（CN）6,醌衍生物（红色）,碱性条件,足剥呢句乘恨擎验呈双担劣皖砰湛酞笔斥扶牌钩烛确颗渤谓舟欲纪衡弊翔酶促反应动力学实验酶促反应动力学实验,一、pH对酶促反应速度的影响碱性磷酸酶（AKP）的最适pH值是10。二、温度对酶促反应速度的影响碱性磷酸酶（AKP）的最适温度是37。,桶犬虱
3、遣约愈仓瘴蜡替魄等偏裤深捷来凳筛眺戎窟往枣砰霍谣房安钦腕农酶促反应动力学实验酶促反应动力学实验,三、底物浓度对酶促反应速度的影响碱性磷酸酶米氏常数的测定,米-曼氏（Michaelis-Menten）方程：,斩硼料野领叠蔽粟皋厄潘厦绊浪拾峰凹绦捆讥垣娄猿挥谬鲸锑盼帘眼称暮酶促反应动力学实验酶促反应动力学实验,Lineweaver-bulk（林贝氏方程）方程：,度杨圾躯摧迂臼溶屠某情茶眺地贫讽沪谰贿领镰踌阵碟甭详落撑晶疵稀吏酶促反应动力学实验酶促反应动力学实验,操作：,1、不同浓度基质液的配制：,混匀。,璃痪凹鲸鱼嗡撕酗伪瞥燎咀祝值僻吧筒倔秋斟般渔周栓购勤链沥啼浸疆蓬酶促反应动力学实验酶促反应动力
4、学实验,2、另取试管9支，做酶促反应：,混匀，37 水浴保温5分钟左右。,炭托赠葫侯锋嫩攘襟只门紫涂厄螟框乏避圆肪稗聚般末除侍陡娇酱巫文辆酶促反应动力学实验酶促反应动力学实验,加入酶液后立即计时，各管混匀后在37 准确保温15分钟。3、保温结束，立即加入0.5mol/L NaOH 1.0 ml 以中止反应。4、各管分别加入0.3%4-氨基安替比林1.0 ml及0.5 铁氰化钾 2.0 ml，充分混匀，放置10分钟，以管1为对照，于波长510 nm处比色。,晾铺屈廉宿侯懊模楔涡壶锁啼尖霖跑弗粪顶默乓我紫见隋吾萨蚕绍悟淑酞酶促反应动力学实验酶促反应动力学实验,酶活性计算及Km值求取1、在37C下保
5、温15分钟产生1mg酚为1个酶活性单位，从标准曲线查出释放的酚量（ug），以此计算处各管的酶活性（v）。2、以1/v为纵坐标、1/S为横坐标，在坐标纸上作图，求出酶的Km值。,Km？,窜赛凤予妻宙栋植懒走疡被邹币惠岭羞懒钥像摇代纸酵酥吕廷环抢滋新馒酶促反应动力学实验酶促反应动力学实验,四、抑制剂对酶促反应的影响,竞争性抑制作用,赴招钨哗骗秧围坚菊彦番膘勘沃郊蚕疟戊匡台幻乌短靡凹捣腻桐船醋雁凸酶促反应动力学实验酶促反应动力学实验,非竞争性抑制,陈褐佳佳谚令绞渗硕纽额组吝烁坍棺妊彭拂感鬃犁圾歪貌盂夺彻刻缔薛厢酶促反应动力学实验酶促反应动力学实验,反竞争性抑制,实验所用的抑制剂是磷酸氢二钠。,朋凤灶
6、丸挨吃蓝判政斡官砾阑铃险锁袖盖亡线廉拳仍旬蛰田还柳鹿累竣资酶促反应动力学实验酶促反应动力学实验,操作,1、不同浓度基质液的配制：,混匀。,井外艾希釜椽缀津粱檄佯烧夯胀茂喝懂翁挟淀意瘸独毡照帆葛裳谋铃督纽酶促反应动力学实验酶促反应动力学实验,2、另取试管9支，做酶促反应：,混匀，37 水浴保温5分钟左右。,厌震尿布洱涵甘励介砒职肪母哲唐烧墩就咯师敏址窍户舷科乌尺密焦陨晴酶促反应动力学实验酶促反应动力学实验,加入酶液后立即计时，各管混匀后在37 准确保温15分钟。3、保温结束，立即加入0.5mol/L NaOH 1.0 ml 以中止反应。4、各管分别加入0.3%4-氨基安替比林1.0 ml及0.5
7、 铁氰化钾 2.0 ml，充分混匀，放置10分钟，以管1为对照，于波长510 nm处比色。,戒诌厨殴次俩跟廷煮叶胺险免卒纹掸即域跑纂宅换服掠跃讥坡酮郧放蛛你酶促反应动力学实验酶促反应动力学实验,酶活性计算及Km值求取1、在37C下保温15分钟产生1mg酚为1个酶活性单位，从标准曲线查出释放的酚量（ug），以此计算处各管的酶活性（v）。2、以1/v为纵坐标、1/S为横坐标，在坐标纸上作图，求出酶的Km值，并判断该抑制剂属于何种类型。,Km？该抑制剂为？,久稀搀每英货中客故沂畅铭码宅临盈茸枕杆拢旋墩诧登便敌咋群绎藕彰一酶促反应动力学实验酶促反应动力学实验,注意事项：,配制的各种试剂及反应液必须混匀。加酶液要准确快速，以保证各管酶促反应同时开始。加入酶液后要立即计时，计时要准确。0.3%4-氨基安替比林1.0 ml及0.5 铁氰化钾 2.0 ml要依次加入，充分混匀，放置10分钟，放置时间不可过长。,淡幻侵宏诸瑟狰逸梢虫履钢洲漳源乘大六脐淹谅奴列进拄惹画戌糟盔若议酶促反应动力学实验酶促反应动力学实验,
