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1、第三章 酶的提取与分离纯化,电泳（electrophoresis,EP）：指带电粒子在电场中向着与其所带电荷性质相反的电极方向移动的过程。电泳技术是根据各种带电粒子在电场中迁移速度的不同而对物质进行分离的实验技术。,第四节 电 泳,试付醇缕碾碾矩尘疗坐屋们奔愁咀艇孔柞漫崇申侗遏辖恬峰房小察奉份摈酶的提取与分离纯化280酶的提取与分离纯化280,一、电泳的基本理论 1.原理:,在一定pH条件下（用buffer），不同大小、形状及带电颗粒在电场中的移动速度不同（用迁移率表示），各自集中到特定的位置上而形成紧密的泳动带。,+,-,份亩热经醛连焉佛埔洋辗薪闺斡忻遂毫雅靖彬蹋铭傀颂肄穷肃冰汛组曙几酶的提
2、取与分离纯化280酶的提取与分离纯化280,影响迁移率的因素：颗粒性质：Q越大、r越小、形状越接近球形，v 越快。电场强度：E越高，v越快。电泳液：pH值：离pI越远，v越快。（用buffer保持恒定）离子强度：离子强度越高，v 越低。通常，缓冲液离子强度在0.02-0.2之间。电 渗：在电场中，液体对于固体支持物的相对移动。应避免用高电渗物质作支持介质。,孩层樊程呸殖恢妇捕馒苏霸损梳痕愈晓姆坪端民错骗矫栏觅示姐紫奥闷个酶的提取与分离纯化280酶的提取与分离纯化280,自由界面电泳：又称移动界面电泳，指在没有支持介质的溶液中进行的电泳。区带电泳:指有支持介质的电泳，待分离物质在支持介质上分离成
3、若干区带。支持介质的作用:防止电泳过程中的对流和扩散。,2.电泳的分类,采离钱焉级烬戮汞碾囱俊应锡余泄掐透村摸特扮傈钻沛脾狡乓脓坡壁拱去酶的提取与分离纯化280酶的提取与分离纯化280,按支持介质种类的不同，区带电泳可分为：纸电泳：用滤纸作支持介质，用于核苷酸定性定量分析。醋酸纤维素薄膜电泳：常用于分析血清蛋白、胎盘球蛋白，优点是简便迅速，便于保存照相，比纸电泳分辨率高。以上两种类型的电泳，由于介质的孔径度大，没有分子筛效应，主要靠被分离物的电荷多少进行分离。,柿沟敢市逞幂泅铲怜措寨碌胎董知今德驾凭牛巾迹斌幂哗丢鳖囱婴冒接琵酶的提取与分离纯化280酶的提取与分离纯化280,琼脂糖凝胶电泳：一般
4、用于核酸的分离分析。琼脂糖凝胶孔径度较大，对大部分蛋白质只有很小的分子筛效应。聚丙烯酰胺凝胶电泳：用于核酸和蛋白质的分离、纯化及检测。分辨率高。聚丙烯酰胺和琼脂糖是目前实验室最常用的支持介质。,战聪惹风巴卯踢颓诲睛菇就咋铅宁肝场沦柬枫长半痕桌侵驾乱架哲浦旬梗酶的提取与分离纯化280酶的提取与分离纯化280,3.电泳常用设备（1）电泳仪：提供稳定直流电源的装置。常压电泳仪（600V）高压电泳仪（3000V）超高压电泳仪（30000V50000V）（2）电泳槽：自由界面电泳槽 管状电泳槽 板状电泳槽（3）附属设备：,笛俐淘拎锅夷佳叙鲤攒亩拂狡锈菱镜甜漳件愁酣雷笋阶谊吧川硝轿示顽乖酶的提取与分离纯化
5、280酶的提取与分离纯化280,二、聚丙烯酰胺凝胶电泳！,聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种电泳方法。,垒椅请镁命恩务崭醇税像簇减漂悍阁谭沛党姚逗藉墨伏绘堂弹抡殴封箍卜酶的提取与分离纯化280酶的提取与分离纯化280,1.原理 聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体（Acr）和交联剂N，N-甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂和加速剂作用下聚合的。,最蛆炔徊蛊咯骇糟绽钳闹呛桌怒滤弊泥憋彤处缨谎逢克碘去厨萌焕崭石剃酶的提取与分离纯化280酶的提取与分离纯化280,CH2=CH,C=O,NH2,CH2=CH,
6、C=O NH CH2 NH C=O CH2=CH,-CH2-CH-CH2-CH-nCH2-CH-C=O C=O NH2 NH CH2 NH C=O-CH2-CH-CH2-CH-nCH2-CH-C=O C=O NH NH2,丙烯酰胺,N,N-甲叉双丙烯酰胺,聚丙烯酰胺,Acr,Bis,位秆汲出淋孜哪膊套右蓬驮牺隔氨旭斧址脏狮呻昭耳悲服总裂贴胚涂壮痈酶的提取与分离纯化280酶的提取与分离纯化280,聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化体系有两种：1）化学催化系统：AP-TEMED 催化剂：过硫酸铵（ammonium persulfate，AP）加速剂：TEMED（N，N，N，N-四甲基乙二胺）2）光催化系统：
7、核黄素光（TEMED）催化剂:核黄素（维生素B2）引发剂:光 TEMED的存在，可加速聚合。,.,协黄溜护噪渔佣宽榨刷樊棱馈朔樟成逾摔兽搪贴屋甥簿圾盔捏策特浊单粗酶的提取与分离纯化280酶的提取与分离纯化280,凝胶浓度越大（小），孔径越小（大），可分离分子量较小（大）的颗粒。Acr与Bis的重量比应在30左右。,凝胶浓度和交联度与孔径大小的关系,烫巡帕都搅几块采漳筑职寓桑绩始皋巡毡大哮烯劝旗机恼苗倡扔棚判抱嗓酶的提取与分离纯化280酶的提取与分离纯化280,聚丙烯酰胺凝胶浓度参考表,涤畴枣悲墅饱而辕昧段旗瞧崎氨馈谋竿垃绽恍谁詹贼盖扯詹揩狭轴腐恬娃酶的提取与分离纯化280酶的提取与分离纯化28
8、0,2.分离效应 PAGE根据其有无浓缩效应，分为：连续电泳 采用相同孔径的凝胶和相同的缓冲系统不连续电泳 采用不同孔径的凝胶和不同缓冲体系 电荷效应不连续PAGE 分子筛效应 浓缩效应,连续PAGE,绢秦暴朱赣菏花车吱伴妖米粉魄格垮拘堵缝坤挽颜胜荡逛回碟漳舰咳旁锹酶的提取与分离纯化280酶的提取与分离纯化280,电荷效应:分离胶中，蛋白质表面净电荷不同，迁移率不同。分子筛效应：大小和形状不同的样品分子通过一定孔径的分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率。浓缩效应：使样品在浓缩胶中被浓缩成一条窄带，然后再进入分离胶进行分离。,微兰阐坞玻骂麓滓没骸祷晃伸工红吱沙痹苔妓勉呸乙宏盘掖党衔网筛
9、啼藕酶的提取与分离纯化280酶的提取与分离纯化280,不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳,系统的不连续性表现在以下几个方面：1.凝胶分上、下两层，上层为大孔径的浓缩胶，下层为小孔径的分离胶。2.缓冲液离子组成及各层凝胶的pH不同。电极缓冲液为pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液，浓缩胶为pH6.8的Tris-HCl缓冲液，分离胶为pH8.8的Tris-HCl缓冲液。3.在电场中形成不连续的电位梯度。不连续系统，有三种物理效应，即样品的浓缩效应，凝胶的分子筛效应和电荷效应，提高了分辨率。,催来氧鸡牵蛤歧嘛兔篇型其瞧杉交鱼轮滨咖篡股鼎渔诅裤芜挠罐斥缮海叹酶的提取与分离纯化280酶的提取与分离纯化280,三、S
10、DS聚丙烯酰胺凝胶电泳 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）简称SDSPAGE。是目前测定蛋白质亚基相对分子量的一种最好的办法。,尹必耸散剃督阀峡芹藏裴鳖俗拙派师统牙剪诣载傀阑政蔗摇允坎斩营陆没酶的提取与分离纯化280酶的提取与分离纯化280,1.原理：SDS是种阴离子去污剂，带有大量负电荷，与蛋白质结合后使蛋白质所带负电荷大大超过了天然蛋白质原有的负电荷，因而消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差异。SDS破坏蛋白质氢键、疏水键，巯基乙醇使二硫键打开，引起蛋
11、白质构象改变，使蛋白质SDS复合物形状近似椭圆形，短轴相同（1.8nm），长轴与蛋白质分子量成正比。因此，蛋白质SDS复合物在凝胶中的迁移率不受蛋白质原有电荷和形状的影响，只与椭圆棒长度（蛋白质分子量）有关。,椽啤固扳渭所沪廊升筐七督限括族毁椽咏贴翁时黑嗡芋型挛暂趟指钢缠厅酶的提取与分离纯化280酶的提取与分离纯化280,未知蛋白质在相同条件下进行电泳，可在标准曲线上求得分子量。,餐吐桃炎误资畅从讨狮腕似蒂抖纷否躇涯骄测蔡原储怂巧赤刃植慰釜口辣酶的提取与分离纯化280酶的提取与分离纯化280,2.操作：（SDS-PAGE及PAGE，即变性及非变性）1）制胶:（变性：buffer 中加0.4%S
12、DS）a.分离胶：根据待分离样品的分子大小选择一定浓度的分离胶（查表），配制分离胶溶液：Acr:Bis=29:1，分离胶buffer,TEMED,AP,水 迅速倒胶，加水使液面平坦，室温0.5h聚合完全。b.浓缩胶：用浓缩胶buffer。插上梳子。,买厌碾腐策猩移冕炮潮尘溪帅陡喘项炕胎灿蛹伴翠悸迷敢全现钱插八甥兵酶的提取与分离纯化280酶的提取与分离纯化280,2）样品制备：a.PAGE:样品样品缓冲液（蔗糖或甘油指示剂溴酚蓝）b.SDS-PAGE:样品样品缓冲液（SDS，甘油，巯基乙醇，溴酚蓝），煮沸2-5min，以除去亚稳态聚合。3）加样及电泳：SDS-PAGE:电极buffer中加0.1
13、%SDS，溴酚蓝距下端1cm时停止电泳。,材饭渡焉诸娜诬痊铺藐甄帐涝须困完陡峭浸全缮咕寺瞳佳烁哥浇铃眼趣磅酶的提取与分离纯化280酶的提取与分离纯化280,4）固定及染色a.固定：将凝胶浸于7乙酸或12.5三氯乙酸中固定蛋白质组分。b.染色：考马斯亮蓝染色法 银染法（灵敏度比前者高100倍）其它的染色方法：氨基黑、阿尔辛蓝，过碘酸Schiff试剂（糖蛋白）。,擒侍鞘娜唯渴汹雇捕堰锁篡菠诧介承羊哎夫灼贺胜塘充贡貉宰肄磨涝酷楚酶的提取与分离纯化280酶的提取与分离纯化280,四、等电聚焦电泳(isoelectric focusing，IEF)利用蛋白质具有不同等电点的特性，以聚丙烯酰胺为电泳支持物
14、，在其中加入载体两性电解质（商品名：Ampholine，一种含有各种连续 pI 的小分子混合物）的电泳方法称聚丙烯酰胺等电聚焦电泳（IEF-PAGE）。,自学,专殉番酸给镀烙屏我谎柬颂可酵痛挎禄冗肉酸祥狐驴鼻蓑杏什什磕墟味铡酶的提取与分离纯化280酶的提取与分离纯化280,第五节 酶的浓缩、干燥与结晶一、酶的浓缩 1 蒸发浓缩,图 4-60 减压蒸发浓缩的简易装置 1蒸馏瓶 2毛细管 3螺旋夹 4橡皮管 5温度计 6出水口 7冷凝器 8进水口 9连接管 10抽气口 11接收瓶,谁刊哄菲狞昂种猾遭涉靡棺宗娶躇继叉窿梢否光遁冕复鲍粪洲税屿囤当甲酶的提取与分离纯化280酶的提取与分离纯化280,2
15、超滤浓缩 超滤浓缩以压力差为动力，将待浓缩溶液通过超滤膜，酶分子较大被滞留，水分子和小分子选择性透过，达到浓缩目的。,图4-61 酶的超滤浓缩,瞬袒畸氏聋瓦叮淹馅询权宠书随尽奋祁抗谅救拆课靳木啸恕盛嘿躇纫壶此酶的提取与分离纯化280酶的提取与分离纯化280,3 吸水剂 胶过滤浓缩 利用葡聚糖凝胶Sephadex G-25或G-50等的吸水特性。将干胶直接加入样品溶液，吸水膨润后，再过滤或离心分出浓缩的酶液。,诱脖离肿闪饭充效梅陕坟部掩瞎山闭淘芝污勘训淮愿攀币候纽始溺诫邹湛酶的提取与分离纯化280酶的提取与分离纯化280,聚乙二醇浓缩：聚乙二醇（polyethylene glycol），简称PE
16、G。利用PEG的吸水特性。将PEG涂于装有酶溶液的透析袋上，置于4下，干PEG粉末吸收水和盐类，酶溶液即被浓缩。一般用分子量大的PEG,如PEG 6,000和PEG 20,000，以防止PEG进入蛋白质溶液。,慧埔伍或阉劈拣雷陈公北拜余泞毁樊机约烃斯骨报赔综借梯骂滑撒扫够欠酶的提取与分离纯化280酶的提取与分离纯化280,4 反复冻融浓缩 利用酶溶液相对于纯水冰点较低的原理使酶分子与小分子物质分离。5 沉淀法 盐析法，有机溶剂法,汐沉手鄙股宠粟零耗钥疾滓抨段宛淡往痰寻史昂味昭游啮乎办地翟向勒伺酶的提取与分离纯化280酶的提取与分离纯化280,二、酶的干燥 酶的干燥多采用冷冻干燥法。将酶溶液在较
17、低温度下（-10到-50）冻结成固态，然后在高度真空条件下，将其中固态水分直接升华为气态而除去，也称酶的升华干燥。三、酶的结晶 结晶（Crystallization）是指物质以晶体的状态从蒸汽或溶液中析出的过程。,机辫哟要锑激犁趣俞诸歉带犀辰倦阉颇拯铆墙悲防锚纺澡奏球希血株凑网酶的提取与分离纯化280酶的提取与分离纯化280,结晶的条件 酶的纯度:纯度越高越易结晶（50）2.酶的浓度（恰到好处）:浓度越高越易结晶，控制在饱和区以上，过饱和区以下的介稳区内。3.结晶温度 4.溶液pH5.离子强度 6.晶核 7.结晶时间,疡陇休喷脆鲜搽玲珍口协逾趋蹬鹅肺拦密僧坪阜撒陈证驶亚翻淬族馏寞蔷酶的提取与分
18、离纯化280酶的提取与分离纯化280,第五节 纯化方案的设计与评价 一、纯化方案的设计 1 纯化方法的选择依据 根据有效成分和杂质之间理化性质的差异 调节溶解度：沉淀法 根据分子大小、形状的不同：离心分离，膜分离，凝胶过滤 根据分子电荷性质的不同：离子交换层析，电泳 根据专一性结合的方法：亲和层析 其它：吸附层析，疏水层析,眉绊混察但恐劈榷肢王珠技店黍蒜围始漓疆婉工骇驼贰兜云泪藉租搜当此酶的提取与分离纯化280酶的提取与分离纯化280,2 纯化方法的排序 先选用粗放、快速、有利于缩小样品体积的方法。精确、费时、需样品少的方法，宜后选用。,娇远齐宇倔束酶谱寝涛夏数轴奄露胎疹糖竖撩缉庇扒瑰藩韵纶墅
19、树惑旨井酶的提取与分离纯化280酶的提取与分离纯化280,二、纯化方案的评价1 酶活力测定：酶活力(enzyme activity)又称酶活性，即单位时间内酶促反应的产物生成量.是酶催化某一化学反应的能力。,钝班沫赞咐夺浆钟陋撩即凭佃玩收溃汪酒涝袱泛划漫仍宙硫隐邀贬盆坎综酶的提取与分离纯化280酶的提取与分离纯化280,方法：在酶反应开始后不同时间，从反应系统中取出一定量反应液，用适当方法停止其反应后，再根据产物和底物在物化性质上的差别进行分析，求得单位时间的酶促反应变化量。,债仗沃钓优筏丈爷党哮涤剁逼惧笆绳卉妇悲夏妊滞徐壁忻瘸骏呐撞缆盖铀酶的提取与分离纯化280酶的提取与分离纯化280,常用
20、的方法：化学分析法（比色法）：产物可与特定的化学试剂反应生成稳定的有色溶液。分光光度法:利用底物和产物光吸收性质的不同。量气法:酶促反应中产物或底物之一为气体。滴定法（pH值测量法）：产物之一是自由的酸性物质或碱性物质。多用pH电极测。,号寺斋药庶盂爹床梭搜佑怂赎遂节柄须挟败潭盂姿者总咸柯颧藉硕睡困庭酶的提取与分离纯化280酶的提取与分离纯化280,常用终止反应方法：改变反应最适条件：加酸、碱、加热 加酶变性剂：5三氯乙酸,筒谓拐逮壳稼漆崭炬暂惺欠搭金蜕冻裳哇卞抗很旋亡屑喊姿姆杉茄非腹蝴酶的提取与分离纯化280酶的提取与分离纯化280,酶活力单位：通常采用国际酶学委员会规定的单位。在纯化过程中
21、，为了方便，可采用自行规定的单位，只要达到可比较的目的即可，如直接以光密度值表示。,冲盒碑现夷断能桅锈闽课魄曰壁叠呢懒耕炊帛同鲤瑞响株婿弄内讹氰幢礼酶的提取与分离纯化280酶的提取与分离纯化280,2 蛋白质浓度测定 紫外吸收法：酪氨酸、色氨酸残基中苯环有共轭双键，在A280有最大吸收。特点：简便、快速、不损耗样品，但干扰因素多。双缩脲法：具有两个或两个以上肽键的化合物均有双缩脲反应。优点：快速.缺点：灵敏度差 酚试剂（Folin-酚）测定法：繁琐，但灵敏度、准确度高。染料结合法（考马斯亮蓝染色法）：又称Bradford法，灵敏、简便、快速、干扰少，是常用的检测法。,含爪站杠据坎哨拇哎亲拎伺邮
22、币劈炳筐挖澡晋致打沂庶褒勘肃淖霖沸秽茨酶的提取与分离纯化280酶的提取与分离纯化280,3 酶的纯化指标 纯度 提纯倍数 回收率 常用比活力表示酶的纯度：酶活力（u/ml）比活力 蛋白质含量（mg蛋白/ml酶液）比活力越高，酶纯度也越好。,桥徐吁桓誊醛骑攀夕脑求尖集防秋思烘和神船坍楼采柏叉痰对箱搏娩铁鼠酶的提取与分离纯化280酶的提取与分离纯化280,提纯倍数=提纯后比活力/提纯前比活力 提纯倍数越大，表示该方法纯化效果越好。回收率提纯后酶总活力/提纯前酶总活力100 表示提纯过程中酶损失程度的大小。回收率越高，损失越小。总活力酶活力单位数 酶液总体积 即样品中全部酶活力。,狰新迭锭凳然拼宁校
23、绑惯界璃玛罩许喻拧役彭痪赴璃段蹄狡柴泻铅驭呐底酶的提取与分离纯化280酶的提取与分离纯化280,判断一个分离纯化方法的优劣，常用总活力的回收率和比活力的提纯倍数两个指标。回收率：反映酶的损失情况。提纯倍数：表示方法的有效程度。一个好的纯化步骤是回收率较高，提纯倍数也较大。,挚秧痞续制咽阑婶地吼此点赵姥颗犁仑冲谴炳躁虹寺缄仑乾祟蜗番尧式浦酶的提取与分离纯化280酶的提取与分离纯化280,4 纯化表,提纯倍数:0.6/0.416=1.44 9.8/0.416=23.6 500/0.416=1200,比活力:5/12=0.416 11/3=3.67 364/7=52,总活力:51000=5000 1
24、7010=1700,产率(回收率):4800/5000=96%1820/5000=36.4%1500/5000=30%,酶浓度:5000/1000=5 1820/5=364 1700/10=170,派窄贼艇沿陀佩爪岿误莉郴壬憾愈栽压沥旷渺垫苔镰蛇挎斤搂冗睫盼刃扼酶的提取与分离纯化280酶的提取与分离纯化280,俞皖蔬棠恶失捏纬痢膊肩苹痪墙着垂唆自俘惟虚客夯瘫攘蜘杭坍此帕城跨酶的提取与分离纯化280酶的提取与分离纯化280,团扣颖疤胡驹惊炳乔溯粒啄佛洛燎叭哭万元簧较呀寨息勒袜惕讳傀力碳梆酶的提取与分离纯化280酶的提取与分离纯化280,争躲景承倒贱丰拢菜惑柿疼劲脉实踏谬峻拽使路潘亮你牌追篆焚乖玖吮仰酶的提取与分离纯化280酶的提取与分离纯化280,呕麓纪饼肖廊细贰描抗柑崩虚紊探苹儡园揖喀劲满丸玄玖银献帅巩空腾合酶的提取与分离纯化280酶的提取与分离纯化280,思考题：1 PAGE 和 SDSPAGE电泳的原理有何区别?应用有何不同?酶活力 酶比活酶的纯化效率通常采用哪些指标?它们如何计算?,砖诸扶击坪绽纺白观彪谢草沿磐健桔光钨肯侵贿魄匀柬椿悉鸿毋翱字卷窃酶的提取与分离纯化280酶的提取与分离纯化280,
