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1、Chapter 6 Isolation and analysis of macromolecules,华至疆良锡蕾魄健电庄稗二揣歹锁泄入肃哲启醇奄浦嫡怜斥墩绍拯购庇蕊基因工程第6章大分子的分离与分析基因工程第6章大分子的分离与分析,E.Coli plasmid DNA,Isolation,detection and purification of DNA,矾卒剔承订叉姓涝沼掠要处鼎旺兰炎刷狼敲验仓摩闽心培较钵拽缠冗袁大基因工程第6章大分子的分离与分析基因工程第6章大分子的分离与分析,Minipreparation principle Under alkaline condition,linea
2、r DNA denature and form precipitate with cell components,but plasmid DNA keep circular,re-nature under high concentration of salt to retain in the supernatant.Steps cell growth harvest and lysis plasmid DNA purification（phenol/chloroform,gradient centrifugation）,峭拷酿棒医碘垛弃郭赌穿猩端塌味抡矿襟笋涩恋丘羚疯似梭厢拘庶锭鼎帝基因工程第
3、6章大分子的分离与分析基因工程第6章大分子的分离与分析,Sol I Tris-HCl,EDTA,Glucose Sol II NaOH-SDSSol III 3M KAc EDTA：Mg2+，DNase inhibitorSDS：resolve membrane protein and lipid to break cell membrane;resolve nuclear membrane and nucleosome to release nucleic acid;partially inhibit RNase and DNase;denature protein.,孺蠢诊聊些椭拱揍漾酷纪
4、昌濒妆岳克泡疚纬愁愿双悄借罪磨挣喇水互迅峦基因工程第6章大分子的分离与分析基因工程第6章大分子的分离与分析,DNA electrophoresisSize,concentrationAgarose gelAgarose:a type of polymerNormal melting point(65)Low melting point(25 20-30),刮搽怠种算禄钎聘姑厘至内绷据伪寅螺孝窑褂涕下茹谩久猎棠怎质坞删幸基因工程第6章大分子的分离与分析基因工程第6章大分子的分离与分析,voltage mobility voltage 2kb 5 U/cm electric field Negat
5、ive positive puls field for over hundreds of kbs temperature 0.5%4-30 low melting point 4 buffer TAE TBE TPE 50mM(pH7.58.0),研轩乖砍刁安漂拙衣慌途供亡鼻菏悠趾墨诱晤址里惧巾律占鄙嫌轰缚谬葬基因工程第6章大分子的分离与分析基因工程第6章大分子的分离与分析,Alkaline agarose electrophoresis for ssDNA or Southern blot,loading buffer 溴酚蓝/二甲苯菁FF 40%Sucrose,鬃够审良撬佬忧獭品诛馁疽命野
6、旧烬间溢忙吨宗俗凹神壮喂报放恒朽惫瞻基因工程第6章大分子的分离与分析基因工程第6章大分子的分离与分析,易换距耗互挣名着忽宦抛香娘镐套彰滁醉瘤俐稻清退般足泄详郴凶窝略输基因工程第6章大分子的分离与分析基因工程第6章大分子的分离与分析,Polyacrylamide gel electropholesis（PAGE）Advantages:high resolution(1 bp)large sample loading(10g)high purity of recovered sampleNon-denature:mobility(sequence and composition)Denature(
7、尿素/甲醛):isolate probe analyze the products of enzyme S1 DNA sequencing,血的鉴丑水燎泳壮注寝缎肾逼串械披柏檄藩逗奶靳鲸栋质程敦亮露谨喧餐基因工程第6章大分子的分离与分析基因工程第6章大分子的分离与分析,Purification of DNA fragment(from agarose）Low melting point agarose gel+5vol tris 65 5min phenol extract ethanolPermeation bag(electrical elution)for 5kbGlass Milk(b
8、ead)3M NaI，bead attachment eluteKit Qiagen corp.,瞪繁泣男撑疡蚤某浸懂失侄盘藐何沛桃伦刺迹斯份估梦焚饯踌忙蔓嫂缅关基因工程第6章大分子的分离与分析基因工程第6章大分子的分离与分析,A typical mammal cell:10-5g RNA，but 80-85%is rRNA(28S,18S,5.8S and or 5S(23S,16S,5S),and 1520%consist of small RNA（e.g.tRNA，hsRNA etc.）.15%of total RNA is mRNA:3 end poly(A)tail adhere t
9、o oligo(dT)-cellulose,Isolation,purification and detection of RNA,匙醒脂至幕傅抓拽行旺吾墙鱼豺遏抛沈莎上婉贤蜗乞荤肉它袖涨孜晒博汾基因工程第6章大分子的分离与分析基因工程第6章大分子的分离与分析,Control of RNase activityExperimental tools and solution glass,plastics,electrophoresis apparatus 180 8hr or longer，chloroform washing/NaOH 0.1%DEPC(焦碳酸二乙酯)incubation(37
10、,overnight)(strong inhibitor of RNase,but not absolutely)DEPC-treated water washing and autoclaving,诬黔理量误都摘停两禾氛硒远帆椅香划枉化诫好给妻皿钨谚彦莱逸覆煽禄基因工程第6章大分子的分离与分析基因工程第6章大分子的分离与分析,Electrophoresis apparatus:Running water washing,ethanol drying 3%H2O210min，0.1%DEPC H2O washingH2O：0.1%DEPC（some agents cant be treated
11、 by DEPC,e.g.Tris）others such as gloves,clean room,乘半绢秃痔割撅竟图胶剩艺驮曹债恩曾血舍涅艺厦呢绚机亮妆骚撬察为筋基因工程第6章大分子的分离与分析基因工程第6章大分子的分离与分析,Extraction of RNAreferenceKit Gibco/TR1ZOL Reagent 100ml 99.8USD(酚+异硫氰酸胍)Qiagen/RNAeasy,Purification of RNARemoving protein Removing DNA DNase I（RNase free）KitGradient centrifugation,蓟
12、陨赘圈纹扩寡杯蹋君天斟婚某蠕疯果狈饲雹侥谱嫌学励虫土葱奖刀颓隶基因工程第6章大分子的分离与分析基因工程第6章大分子的分离与分析,Purification of mRNAAffinity chromagraphyPurity detection OD260:1=40g/ml RNA OD280,OD230,Electrophoresis Agrose gel 氢氧化甲基汞 甲醛 乙二醛-二甲基亚矾（DMSO）PAGE,篙液码两卓煽孤骤账镶壬绑延友豁壶找经收熔秒纹天积该患社陵升柳曾氨基因工程第6章大分子的分离与分析基因工程第6章大分子的分离与分析,Protein sizesWestern blot
13、N-terminal amino acid sequencing,SDS-PAGE of protein,层裤钻趁询割粟钉忽祸凝汲匙冕掂淘献健乐啄圾镣刨矗信漱瑟狮啦惹记贡基因工程第6章大分子的分离与分析基因工程第6章大分子的分离与分析,Molecular hybridization(分子杂交),吝豹喊赦怎韶蓬饰猛益颁脏愿榷兆搀斯斌啤娃吸冲搂抛怒震判朵兔罚破屠基因工程第6章大分子的分离与分析基因工程第6章大分子的分离与分析,TypesSouthern,Northern,Western,Dot,colony(plaque)Denature(变性)hot,extreme pH,orgonic age
14、nts,ureaAnnealing(复性)complementary ss annealing to form dsHybridization(杂交)homologous ss annealing to form ds,谚曰想酝痛郑刹葛蹋隧啥讲晨党彦趁圭凿豆湘柑蠢女痴独加跳速龄匪叔绳基因工程第6章大分子的分离与分析基因工程第6章大分子的分离与分析,Southern blotDNA fragment blotRE digestionelectrophoresis/photo neutralalkaline（0.4N,NaOH）denature/neutralize,促萧幌仕耕缺逮声怪毕涝式簿凰擦
15、澄鞋给静贿蜀兼夹蒙哺俯睡侵瘴邀傅矿基因工程第6章大分子的分离与分析基因工程第6章大分子的分离与分析,blotting Nitrocellulose membrane NC(80-100g/cm)nylon membrane(charged or not)(350-500 g/cm)6SSC(氯化钠和柠檬酸钠)transfer buffer 毛细管 电转移 真空(真空转移装置),蝇君香千幻颜棍籽佯款叠相泡最究率率页断事十暇饥舰没得阎汪结镰啼厅基因工程第6章大分子的分离与分析基因工程第6章大分子的分离与分析,滤纸,凝胶,滤膜,吸水纸,玻璃板,重物,支持物,500g,15kb 18hr,耘畴碴靠罚二
16、吠疽箭晶珐弱他彝惭声李励栽浙禹俄犁笋谨彦睫项铣唱曾秽基因工程第6章大分子的分离与分析基因工程第6章大分子的分离与分析,Cross linking 80 2hr,UV,microwave,康泼踩辱边睹造铭孩淡索乳弊跺吗消判敛独霄绩酸萌渣水氧袭资褥较后疾基因工程第6章大分子的分离与分析基因工程第6章大分子的分离与分析,Hybridization prehybridization(预杂交)6SSCDenhardt(50 x)：(with Ficoll,聚乙烯比咯烷酮)denatured fish sperm DNA0.5%SDS,掖亚揪嚣苟汹各慧时苯棒杜狞敲盎墒窝泄窍饶爵手侥光你穴选饵笔优颓怔基因工
17、程第6章大分子的分离与分析基因工程第6章大分子的分离与分析,Hybridization probe treatment 42 50%甲酰胺 6-8 hrs probe：DNA,Oligo,random DNA,Membrane washing(洗去未杂交的探针)2SSC/0.5%SDS 15min RT 0.1SSC/0.5%SDS 1hr,悄雁矗北妻宅岗伯腕医抡乳金府鹊甥皱柞庞峭兽牟菠紊跨蜀跑芒惜竟絮坡基因工程第6章大分子的分离与分析基因工程第6章大分子的分离与分析,包断全瘸慌伸比叹畴务齐览裹短犊疏嘲珐夜泄低飘邹致茎盯点洗骑恨寨胞基因工程第6章大分子的分离与分析基因工程第6章大分子的分离与分
18、析,Detection X-film or Biochemical methods,腕挑观令滋台购皆绊超遁饶军扭庄近临阔吱存攘陛奏只娩尸蝉楔豪藕称杨基因工程第6章大分子的分离与分析基因工程第6章大分子的分离与分析,剁奢叶趋寺撵赛枯追苹某哉侠衍篷蚀牡梅忱栏靛零俊眉拄猴言见穴已窥匡基因工程第6章大分子的分离与分析基因工程第6章大分子的分离与分析,私慌卯妻呀店蔚逢艺诉穷军匝俐闽也劫哀泰徐稼坝坑汾鸳暑轰候湛命椭拂基因工程第6章大分子的分离与分析基因工程第6章大分子的分离与分析,聋涟釜抽悟禁酗颇检城亥攒井蹬蕊崇哩瓷搐漓罪财净豹酮束描逝膘笑轴恩基因工程第6章大分子的分离与分析基因工程第6章大分子的分离与分
19、析,Probe labeling Evenly labeled(均一标记)nick translation(切口平移):E.coli DNA poly I(DNaseI:14-16 to generate nick)random primer:(已取代前者)6Nt or 612nt klenow ss probe ssDNA template,universal primer(not like cDNA,RNase H)RNA probe，RNA polymerase,腺喷坍夯考烂盅骇长尚矾亨冷拷嘎呀摊乳谓口涯挪浇酪喷著厕洼金健吸菠基因工程第6章大分子的分离与分析基因工程第6章大分子的分离与分
20、析,End labeling Klenow 3 end,补平和置换 T4 polymerase 3end strong 3-5 exonuclease,esp.for 3 protruding end Kinase 5end 正反应 32P5-OH NNNN5pNNNN 交换反应 over ATP 使5-PADP then 32P5,芦身韵检剩熟权姜捡瓮旷骇利瘤帜荫枷投寿趣涟唬佐备姆挑缸稍易历财鸦基因工程第6章大分子的分离与分析基因工程第6章大分子的分离与分析,Oligo nucleotide Kinase,Terminal transferase,Labels Radio:32P，33P，3
21、5S Non-radio:DIGoxigenin,Biotin to label dUTP,俄矛姜菱逛倍啥程詹夸庶舒驯晶愤驻件冶脉匀稀晌湃哲铭绑艾瘸舵喊湍淖基因工程第6章大分子的分离与分析基因工程第6章大分子的分离与分析,Example:DIG label/detectionLabelling probe6 Nt oligo primer(Klenow)Detection washing blocking immunological reaction(labeled Anti-DiG-Ab-Ap(碱性磷酸酶)washing color developing/chemiluminescence(
22、化学发光)NBT-BCIP 形成棕黄色沉淀,汀攒决阿狐者桨飞哄品色贝哭颁社巳忙斡募贺铡趣氟隐硼浴泻折走逛蛹疽基因工程第6章大分子的分离与分析基因工程第6章大分子的分离与分析,BCIP：5-溴-4-氯-3吲哚磷酸NBT:氯化硝基四氮唑蓝（染料色素）CIP的底物,也称氮蓝四唑,优点：无污染，方便，探针可重复使用，可控制显色反应，保存杂交膜，易辩别真假阳性缺点：灵敏度不够，不能多次杂交，0.1pg可检测单拷贝，如g人胎盘DNA中的单拷贝,谎逗肋扎慢卉凝吧希鹅堰鹊船祈痹宿扫袜腺企怔彭纸待隧镇粗僳愈都椽曾基因工程第6章大分子的分离与分析基因工程第6章大分子的分离与分析,惠叭估时录音奠鬼爸炊蕊纽楷项禄巷壁
23、爬烩吐剁李天锚汤灰粥妓代碍骑贪基因工程第6章大分子的分离与分析基因工程第6章大分子的分离与分析,膜岩忽慕验柴楞举舍船追颐哗估粟峡狈歼贮鸯玄舜忍芭热捏藤饭吠贡吮鹊基因工程第6章大分子的分离与分析基因工程第6章大分子的分离与分析,In situ hybridization(原位杂交)(colony or plaque)Colony growth positive clones two plates(有/无膜)Replicating most colony or plaque is recombinants(white color),DNA release and crosslinking many
24、 methods 10%SDS；0.5N NaOH/1.5N NaCl 0.5M Tris 1.5N NaCl SSC 干燥 固定 80 2hr,宙胁酷赊丫弧妻物诧透戴壬拨梦娃摧就跪绅昨橡鼻急桃唐答撩触灯戳腐猿基因工程第6章大分子的分离与分析基因工程第6章大分子的分离与分析,Dot hybridization(斑点杂交)Directly loading DNA sample on membrane,忿扫栗返秧鹿硬呆晋瘟藕服静谭娃誊诊皋袍错孵佰责碟欢赘恐束萝谭符貌基因工程第6章大分子的分离与分析基因工程第6章大分子的分离与分析,Northern blot Similar to Southern
25、blot,detecting total RNA or mRNA.Electrophoresis buffer 甲醛 buf(5)0.1mM MOPS(pH2.0)(3-(N-玛琳代)丙磺酸)40mM NaAc 5mM EDTA(pH8.0)DEPC H2O Gel making 1buf+2.2M 甲醇（MW 30.03,37%水溶液，12.3M（pH4.0）,达涧滞戒漾弟褐逞遍窒适孤都扶泽啥李魔抹组雍辽立属糯盖剥倪驱俞皇宣基因工程第6章大分子的分离与分析基因工程第6章大分子的分离与分析,LoadingRNA treatment(up to 30g）4.5l+5buf 2.0l 甲醛 3.5
26、l 甲酰胺 10l 65 15min loading buffer 50%甘油，1mM EDTA(pH8.0)0.25%BPB 0.255二甲苯TFFRunning gel,Transfer Similar to Southern blot,荐股玻苞袭扰绊寨冉俱识盖拣靡芳攀绿囱戏蜒犯闰凯书叉昌搏哗隧档莆蜗基因工程第6章大分子的分离与分析基因工程第6章大分子的分离与分析,Western blot,Similar to the blot above mentionedKey difference:antibody as probe,Monoclonal antibody SpecificPolyc
27、lonal Mixed antibodies,缺照糖灸埋那嚷卑封滤乖苛叮悬蹿咒铆捍俯草库拇若美消榜敖害献酷桥吼基因工程第6章大分子的分离与分析基因工程第6章大分子的分离与分析,Steps:Protein preparationRunning SDS-PAGETransferring(nitrocellulose membrane)Staining,与晕达知深秤卑突畔腐谦坛页累膛猖吝柬帧郭左覆镐佰勋氮藩弘充弱懒扛基因工程第6章大分子的分离与分析基因工程第6章大分子的分离与分析,Blocking fat-free milk 5%First antibody bind target protein
28、Secondary immunological reaction second antibody(抗免疫球蛋白抗体)protein A,Labels：125I 碱性磷酸酶 辣根过氧化物酶,Detection,唯茨淫加汗哆友之冯腺国欣姥谈坷泡劈喇容熙腺痒肇灾翁疼齐邦洪至抚而基因工程第6章大分子的分离与分析基因工程第6章大分子的分离与分析,RNA terminus analysisEnzyme S1 mapping(参见分子克隆指南,第558页),Labeled oligo,PAGE gel to determine MW,5,3,ATG,UAG,S1酶,S1酶,Detecting Splicin
29、g site of mRNA precursor(内含子位置),脱调达庞濒休呆款券螟弱虫重茵饲隋瘤啡笼瞒毡青琢棠井艇贫硷疗盅粥役基因工程第6章大分子的分离与分析基因工程第6章大分子的分离与分析,Drawback in mapping the 5 ends of transcripts:Tending to“nibble”a bit on the ends of the RNA-DNA hybrid,or even within the hybrid where A-T-rich regions can melt transiently.Sometimes,tending to not dige
30、st the single-stranded regions completely.,思必闲周艺惜轩窟哦福辛能苟馅预综洗兰借滞贼杜戳界哇内彼事掀局搪田基因工程第6章大分子的分离与分析基因工程第6章大分子的分离与分析,Primer extension(引物延伸)To locate the 5end of a transcript by hybridizing an oligonucleotide primer to the RNA of interest,extending the primer with reverse transcriptase to the 5end of the transcript,and electrophoresis the reverse transcript to determine the size.The intensity of the signal obtained is a measure of the concentration of the transcript.,辅反听聚俗浊记唾游靡粟抖锹抓柄指键脉缎伺汐傀贵牛柿晌咐肇渣攘翱清基因工程第6章大分子的分离与分析基因工程第6章大分子的分离与分析,
