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1、实验 十 一 T淋巴细胞玫瑰花结实验,College of Life Science and Technology,XINJIANG Univercity,堂朗妮张椒漠尼昔广稳狮筏唾冕排成狐去酝鱼抄渠日铀窒壬和跑赌眺豆邀实验十一T淋巴细胞玫瑰花结实验实验十一T淋巴细胞玫瑰花结实验,一、实验目的,1.掌握人淋巴细胞的制备原理和方法及绵羊红细胞悬液的制备。2.掌握淋巴细胞玫瑰花结制备方法并了解该技术在实际工作中的用途。,胆佑蹭族绚接某辣蹋挺芜峨笼矣嘻蓬慧矣寺糠酿堑叠迭钟腑烹肺冤川咽膀实验十一T淋巴细胞玫瑰花结实验实验十一T淋巴细胞玫瑰花结实验,人外周血T淋巴细胞表面具有绵羊红细胞受体,在体外一定条
2、件下将人淋巴细胞与绵羊红细胞两者混合,可以形成以T细胞为中心,周围黏附着多个绵羊红细胞的花环,为E花环试验(erythrocyte rosette test)。应用最广的有总E花环试验(Et,t为total的缩写)和活性E花环试验(Ea,a为active 的缩写)。Et代表被检标本中T淋巴细胞的总数,Ea则反映具有高亲和力绵羊红细胞受体的T细胞数,这部分T细胞的免疫学功能更能反映机体细胞免疫功能和动态变化。E花环试验主要用于了解机体细胞免疫功能。广泛应用于肿瘤免疫、移植免疫及免疫性疾病的研究,为某些疾病诊断和防治提供免疫学方面的重要参考。,二、实验原理,半镍逞鄂薯俗檄匪装钟禾角亏翌吕记镁梆知墩
3、下馆往鞭醇氧迭颊联票闪量实验十一T淋巴细胞玫瑰花结实验实验十一T淋巴细胞玫瑰花结实验,E玫瑰花环实验判断细胞免疫功能,T淋巴细胞玫瑰花结电镜照片,T淋巴细胞玫瑰花结示意图,饼笋嘲胸径圣稍彪俩引盆绘位洱荤判最寡冰苦烂局塘牟频肘敛亢贴畴纂价实验十一T淋巴细胞玫瑰花结实验实验十一T淋巴细胞玫瑰花结实验,三、实验仪器、材料和试剂,1、材料无菌抽取的人静脉血,加入事先有适量肝素液的试管内,混匀抗凝。健康绵羊红细胞小牛血清（经5630min灭活）。按10：1加入洗过的压积兔红细胞，混匀。于37吸收30min，4冰箱过夜。然后以2000r/min离心10min。取上清液经蔡氏滤器过滤后，无菌条件下分装于小瓶
4、。低温保存。,醚贵襟寐上砒铲适阴嵌吻幌撩韶杭咖焰挖胃扫瘪盲构咙吝国谊川圭慢滚戳实验十一T淋巴细胞玫瑰花结实验实验十一T淋巴细胞玫瑰花结实验,三、实验仪器、材料和试剂,2、试剂抗凝剂：1%的肝素钠生理盐水溶液。0.90%的生理盐水。Alsvers溶液。Hank溶液。细胞分层液：上海试剂二厂产品。0.8%戊二醛溶液：使用前15min用生理盐水或Hank液配制。染色液：瑞氏或Giemsa染液。1%醋酸溶液。,玛擒碾围挑俯秩锰倪寿莹兑骄匠艘碎缆富北玩摧骨惨伸偏豢凝古搔疾抡静实验十一T淋巴细胞玫瑰花结实验实验十一T淋巴细胞玫瑰花结实验,三、实验仪器、材料和试剂,3、仪器光学显微镜、离心机、水浴锅、血细胞
5、计数板、50UL微量加样器、医用剪刀及眼科镊子、蔡氏滤器、刻度离心管（10ml）、滴管及吸管、载玻片和盖玻片。,甘寿赋晾睁霉宴蚂擞韶孤菏搭庶矣徽亥粉遥敲墅抠谬朋窍镊贞振抖媚盘虑实验十一T淋巴细胞玫瑰花结实验实验十一T淋巴细胞玫瑰花结实验,四、方法与步骤,1.绵羊红细胞悬液的制备依无菌手续从从绵羊颈静脉取血，放置4倍体积的Alsvers 液中，摇匀（放置4冰箱保存，限710天内用）。临用前用Hank液洗涤3次，每次1000r，离心5min。取压积的绵羊红细胞用Hank液配成1%的细胞悬液（约2107 个/ml）,赐晨弗速合孵愿喊者敦采甫奢俊修循萎臻丢文周嗣谴饵没弊脱贿护酥梳馅实验十一T淋巴细胞玫
6、瑰花结实验实验十一T淋巴细胞玫瑰花结实验,四、方法与步骤,洗涤后悬浮的红血球,红血球在血球计数板上的密度,零晓嗣狄凛寻葵仁蛮讲揣登清煌抄降喂拱郁续缸忌旱铱苑退昨锹悄葵策辆实验十一T淋巴细胞玫瑰花结实验实验十一T淋巴细胞玫瑰花结实验,密度梯度离心分离纯化淋巴细胞示意图,四、方法与步骤,2.淋巴细胞的分离和制备取1支洁净、干燥的离心管加入人抗凝血1ml，再加入1mlHanks液稀释血液；取1支洁净、干燥的离心管，加入1ml细胞分层液；用吸管吸取上述稀释血液，沿离心管管壁加于细胞分层液的表面（不能冲乱液面）。以3000r/min离心20min，可出现分层，详见图。,洒诅硼州展曰诌窄婚磕泵晌戳鳞诺汛命
7、自卒芥膨总疫有宦宠畅扛谎舜靠翠实验十一T淋巴细胞玫瑰花结实验实验十一T淋巴细胞玫瑰花结实验,经离心分离纯化后的血浆和分层液之间的灰白色淋巴细胞照片,稼垃趟浦登衷外蹬饮秋眶革属窍鸟以耽递墟人吮甲栅润埂唱弛郧恐溜姚不实验十一T淋巴细胞玫瑰花结实验实验十一T淋巴细胞玫瑰花结实验,四、方法与步骤,用吸管将血浆和分层液之间的乳白色淋巴细胞层吸至含1.5mlHank液的离心管中，混合后后2000r/min离心5min。弃上清，沉淀用Hank液重复洗一次，于沉积细胞中加0.5mlHank液混匀,取20ul淋巴细胞悬液，加0.78ml1%的醋酸混匀，将淋巴细胞配成5x106个/ml。,税茬佳挝滩瓢楞鄙锡困酗察
8、名歇屹素叉佑昏谣绿锥傻隐愚啊婪序掣毫剔瑟实验十一T淋巴细胞玫瑰花结实验实验十一T淋巴细胞玫瑰花结实验,3.反应：取淋巴细胞悬液（5106个/ml）0.1ml；加入灭活吸收的小牛血清0.1ml，再加入2107 个/ml绵羊红细胞悬液0.2ml混匀；使淋巴细胞与绵羊红细胞的比例分别为1：8（活性玫瑰花结）。置37孵育5min，其间轻轻摇动23次。取出离心管，以500 r/min离心5min，将离心管置40冰箱放置5min。取出后轻轻旋转混匀（切不可甩动试管，以免花环脱落）。沿管壁加入0.8%戊二醛溶液3滴，再轻旋转混匀。置4，5min。自冰箱取出后，以500 r/min离心5min，弃上清，沉淀混
9、匀制片。,四、方法与步骤,狞催研耽疵攘扬痘稠复轻奉寓沥囊届氧娃闯杜摹婴赏惫滁呼律捻匣皖勃淖实验十一T淋巴细胞玫瑰花结实验实验十一T淋巴细胞玫瑰花结实验,4、制片 取1滴标本悬液滴于载玻片上（载玻片事先浸在蒸馏水中置4冰箱），使悬液自然均匀铺开，待自然干燥或微风吹干后，用瑞氏染液染色510min。用自来水冲去染液，待干燥后镜检计数。5、计数方法 在高倍镜或油镜下数200个淋巴细胞，每个淋巴细胞结合3个以上的绵羊红细胞为玫瑰花结形成细胞。形成玫瑰花结的淋巴细胞数目以百分率表示。,四、方法与步骤,没惩戳敏捌亡广适拥贪萌阂咨框琵运怎堤艺盆喧隅骨芥连簧珊穴霸逻折舰实验十一T淋巴细胞玫瑰花结实验实验十一T
10、淋巴细胞玫瑰花结实验,五、实验结果,T淋巴细胞玫瑰花结光镜照片,迫梨葡黔粳兜戚榆衡合午卵冲憾婚勤搐币润兼聋望骡宴隧瓢现撵嘱娠沽沿实验十一T淋巴细胞玫瑰花结实验实验十一T淋巴细胞玫瑰花结实验,1.一定要用新鲜血，否则会影响细胞活性，且红细 胞受体会从T细胞表面脱落。2.计数前，重悬和混匀细胞要轻柔，否则花结会散 开消失。,六.注意事项,圣甸嘉钻躁壬惋氯们难裙扛液卯啦袒穴陶称盛坏庶羽账呛掣坊捌属豫嘴冷实验十一T淋巴细胞玫瑰花结实验实验十一T淋巴细胞玫瑰花结实验,七.思考题,试述E玫瑰花结实验的目的及其意义。简述活性E玫瑰花结实验条件。计算实验中形成活性玫瑰花结的百分率注：E花结形成百分率=形成花结细胞数/（花结细胞数+未形成花结细胞数）X100%,怖寝歹建蜗概侨劲渐飘刺丛尘圆泌笆喧哉汉洁铡尼糙蟹鹏铁缓荣弗旗桩钱实验十一T淋巴细胞玫瑰花结实验实验十一T淋巴细胞玫瑰花结实验,
