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1、1,白血病/淋巴瘤免疫分型苏州大学附属第一医院 江苏省血液研究所卫生部 血栓与止血重点实验室朱明清2010年8 月 杭州,2,流式细胞术的基本概念,流式细胞术（Flow Cytometry,简称FCM）是一种可以快速、准确、客观，并且同时检测单个微粒（通常是细胞）的多项特性的技术，同时可以对特定群体加以分选研究对象为生物颗粒，如各种细胞、微生物及人工合成微球等研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征，并加以定量,3,散射光信号和荧光信号,前向角散射光（FSC,Forward Scatter）入射激光的前向散射光信号细胞相对大小及其表面积侧向角散射光（SSC,Side Scatter）入射激光90
2、角的散射光信号细胞粒度及细胞内相对复杂性荧光素与特异抗体结合，荧光抗体与细胞抗原结合越多，产生的荧光信号越强。,4,CD45/SS示意图,5,实验对照的设计,空白对照：ALL阴性对照：常用同型抗体对照 单色分析：设同型抗体对照 多色分析：同型对照，单阳性对照（用于仪器校正）阳性对照：检测阴性时,6,空白对照和阴性对照的比较：,7,需要用多少的标志来确证感兴趣的细胞群?它们在细胞上的分布是不是很近?它们是否在不同的细胞上表达不同?他们表达强还是弱?,抗原表达,CD3,CD4,8,抗原分布,表面,胞浆,核内是共同检测还是分别检测?,CD3,4,8,tetramer+Cytokines,CD3,4,
3、8,tetramer+DNA,Cytokines+DNA,CD3,4,8,tetramer+Cytokines+DNA,9,设门,08-03307,10,设门,全部 细胞,门内细胞,08-03307,11,12,13,血液肿瘤分类进程,14,目前最完善的血液肿瘤免疫分型文献,15,白血病免疫分型的理论基础,白血病/淋巴瘤免疫分型采用的抗原标志是表达于正常造血细胞不同分化发育阶段的分化抗原。虽然是恶性肿瘤细胞，但仍能表达正常血细胞所具有的抗原，因而仍可依据其抗原的表达谱对白血病/淋巴瘤进行免疫分型。为了正确分析白血病/淋巴瘤细胞，必须对正常造血细胞分化抗原的表达模式有充分的了解。只有熟悉正常细胞
4、的抗原表达模式，才能辨认白血病/淋巴瘤细胞的存在。,16,细胞类型鉴定,Borowitz et al(1993)AJCP 100:534-40.Steltzer et al(1993)Ann NY Acad Sci 667:265-280,17,CD45/SS示意图,正常骨髓细胞 血液肿瘤细胞老化粒细胞、噬酸细胞 早幼成熟粒细胞 M3、CML单核细胞 M4、M5 LGL淋巴细胞 CLL、ALL、CLD正常前体细胞 M0、M1、M2、嗜碱性粒细胞 M4、M5、ALL成熟红细胞、血小板 M6、M7、MM细胞碎片 Pre-B-ALL 非血液来源细胞,18,B淋巴细胞分化与抗原表达关系图,Wood a
5、nd Borowitz(2006)Henrys Laboratory Medicine,19,T淋巴细胞分化与抗原表达关系图,Wood and Borowitz(2006)Henrys Laboratory Medicine,20,粒细胞分化与抗原表达关系图,Wood and Borowitz(2006)Henrys Laboratory Medicine,21,单核细胞分化与抗原表达关系图,Wood and Borowitz(2006)Henrys Laboratory Medicine,22,非肿瘤T淋巴细胞表型,23,非肿瘤B淋巴细胞表型,24,非肿瘤粒细胞、单核细胞表型,25,非肿瘤粒
6、细胞、单核细胞表型,26,白血病免疫分型,根据白血病细胞表达的系列相关抗原，确定其系列来源。如：淋系T/B、粒单系、红系、巨核系等。根据白血病细胞表达的系列分化其相关抗原进一步分型。如：早前B，前B，普通B,27,EGIL，1998年白血病积分系统,分值 B系 T系 髓系 2 CD79a CD3 MPO(cyt)CD22 TCR/(cyt)IgM TCR/1 CD19 CD2 CD117 CD20 CD5 CD13 CD10 CD8 CD33 CD10 CD650.5 TdT TdT CD14 CD24 CD7 CD15 CD1a CD64*当髓系和一个淋系积分均2分时，则诊断为急性混合细胞型
7、白血病。,28,急性白血病的四大免疫类型,单表型急性白血病表达某一个系列抗原为主的急性白血病双表型/双克隆急性白血病未分化型急性白血病,29,初治急白分型,Acute Leukemia Blasts Present 20%,红系和巨核系的鉴定需要另外增加二线抗体。如:CD71、GPA、CD41、CD61,30,AML-M1,31,AML-M1,32,AML-M2,33,AML-M2,34,AML-M3,35,AML-M4,36,AML-M4,37,AML-M5,38,AML-M6,39,初治急淋分型,CommonThymocyte,MatureThymocyte,CD2+CD5+Dual CD
8、4+/CD8+sCD3-,CD2+CD5+CD4+or CD8+sCD3+,CD2-/+CD5-/+sCD3-CD4-CD8-,TdT+CD10-clg-sig-,Pre-B,CD10+cig+TdT+sig-,B,sig+CD10+/-clg+/-TdT-,Common,TdT+CD10+clg-sig-,EarlyThymocyte,Early B-Precursor,40,B细胞系ALL的免疫分型 亚型 CD19 CD20 HLA-DR CD10 CyIg SmIg FAB分型早前B-ALL+L1,L2 前 B-ALL+/+L1普通B-ALL+/+L1,L2成熟B-ALL+/+L3,41
9、,B-ALL,42,Pre-BALL,43,Common-B-ALL,44,T细胞系ALL的免疫分型 亚型 CD7 CD1a CD2 TdT FAB分型早前T-ALL+L1,L2胸腺皮质T-ALL+L1,L2 T-ALL+L1,L2,45,T-ALL,46,T-ALL,47,HAL（T/M双克隆）,48,49,白血病免疫分型的价值,确定ALL的细胞类型（B细胞或T细胞）和 ALL的分化阶段。鉴定AML的特征。对形态学上未分化的急性白血病有助于鉴定细胞类型。诊断一些少见类型的白血病。如：M6、M7、M0等。,50,诊断双表型/混合细胞型急性白血病。鉴别诊断ALL伴有髓系抗原表达（My+）或AML
10、伴有淋系抗原表达（Ly+）。鉴别急性白血病与其他造血系统和非造血系统恶性肿瘤。根据一些特殊的免疫表型特征诊断与某核型异常相关的亚型。如：M3/t(15;17);M2/t(8;21);M4Eo/inv(16)等。,51,淋巴瘤免疫分型,非何杰金淋巴瘤(non-Hodgkins lymphoma)是淋巴系统的一类具有组织和生物学异质性的恶性克隆性疾病。世界卫生组织（WHO）结合形态学、免疫表型、基因分型、正常细胞组成及临床行为，新修订了欧美淋巴瘤分类系统（REAL分类）对淋巴系统肿瘤的分类。这种分类方法在观察者的组内及组间的重复率为85-95%。WHO淋巴瘤分类是建立在疾病病理形态、免疫表型、遗传
11、学特征、临床特点的综合资料基础上：病理形态是分类的基础，大多数淋巴瘤仅靠病理形态就能做出明确诊断；免疫表型和遗传学特征是确定每一淋巴瘤的重要指标，是达成共识的客观依据，有助于提高诊断的可重复性，具有鉴别诊断和预后判断的辅助作用，但在淋巴瘤诊断中并非必不可少；临床特点，特别是肿瘤原发部位，如节内或节外（皮肤、中枢神经、胃肠、纵膈、鼻腔），是确定某些淋巴瘤的重要指标。虽然定义淋巴瘤是综合考虑的结果，但在具体确定一种淋巴瘤时其侧重点有所不同。,52,淋巴瘤病理分类的演进形态学（Kiel分期）形态学加临床特点(IWF)形态学、免疫表型、遗传特点和临床特点(REAL WHO分类）,53,WHO认为，淋巴
12、细胞性白血病和淋巴瘤为同一种疾病：传统上淋巴瘤和白血病是两种不同的疾病，现在从形态、免疫和遗传学来看，淋巴瘤和白血病是同一疾病的不同时相（瘤体期或弥散期/循环期），将它们分开纯粹是人为的。淋巴瘤的临床行为决定了临床工作中的治疗策略，WHO分类系统更多的采用与生物学特点相关的淋巴瘤诊断和分类方法，基于淋巴瘤的免疫和分子生物学特点的治疗方法也不断涌现，这些在将来会大大提高针对淋巴瘤的不同特点进行的治疗。,54,淋巴瘤免疫分型意义,淋巴瘤免疫分型可以区分反应性与瘤性细胞：活检、细针穿刺与体液标本均可；确定肿瘤细胞的系列：T、B、组织细胞、髓系、非造血系。分类中根据免疫表型和DNA含量，可确定低、中、
13、高度恶性程度。区别不同类型肿瘤细胞：伯基特细胞，淋巴母细胞，滤泡型细胞（小细胞混合和/或大细胞），小淋巴细胞，套细胞，弥散小细胞或大细胞，免疫母细胞。确定淋巴瘤的分期：检测有否血液、骨髓和体液的累及。疾病监测：微小残留病的监测，判断疗效（血液、骨髓、细针穿刺标本），确定瘤细胞表型变化，监测Retuximab(抗CD20)治疗前后的CD20定量变化，自体干细胞移植中干细胞收获时的瘤细胞检测等等.,55,淋系肿瘤WHO分类,56,淋巴瘤诊断的必查项目,根据淋巴结或骨髓活检进行诊断,至少需要对一个肿瘤组织的石蜡块的所有切片进行血液病理学检查.如果认为样本组织不能确诊,则需要重新活检。肿块细针穿刺（F
14、NA）不宜作为淋巴瘤初始诊断的依据。但是在某些情况下，FNA结合细胞形态学和流式细胞学检查也可以为诊断提供足够的信息，特别是在诊断CLL时。某些情况下还需要进行免疫组化、分子/细胞遗传学检查。,57,流式细胞术检测到的成熟淋巴细胞常见异常表型,淋巴细胞某一亚群的扩增 异常抗原表达高/低/缺失/异常共表达 细胞形态增大,58,淋巴细胞,正常淋巴细胞,淋巴细胞增殖性疾病（克隆扩增）,59,B 细胞可隆性的确定是通过检测证实所以B细胞仅表达一种轻链或重链:Light chains:“kappa”or“lambda”Heavy chains:IgG,IgA,IgM,60,B细胞的不同克隆性表达,Nor
15、mal:k 50;39,k 2;98+,k 3;93+,k 86;1,k 1;99,k 5;84+,k 99+;1,K99+;1,61,慢性淋巴细胞增殖性疾病（Chronic Lymphoproliferative Disease）,CLL来源于B细胞，具有免疫球蛋白重链或轻链基因重排，CLL细胞主要为较正常淋巴细胞稍大的小淋巴细胞。免疫分型主要为：SIgM、SIgD弱表达，B系抗原为CD19、CD20、CD23、CD79a与CD5共表达。而CD38,ZAP-70,Ki67等抗原的表达与CLL预后有密切关系。CLL与其它某些淋巴瘤在形态学上相似，但在免疫表型上却各有特点。,62,慢淋和B淋巴瘤
16、分类,CLL and Non-Hodgkins Lymphoma,CD5-,CD10-,CD10+,Follicular Cell Or Burkitts Lymphoma,SLVL or Marginal Zone LymphomaorHairy Cell Leukemia,CD5+,B-CLLorMantle Cell Lymphoma,MCL：t(11;14)；NCCN要求对所有CLL患者检测t(11;14)或CCND1表达,63,ALL/CLL?,64,评估CLD的抗体,First:CD5,CD19,kappa,lamda CD3,CD20,CD23,CD10,CD45B-cell:C
17、D22,FMC7,CD11c,CD103 CD38,CD25,CD79b,heavychain(约12-15Ab)T-cell:CD4,CD7,CD8,CD2,CD56 CD16,TCR/，TCR/特殊用途:CD30,bcl-2,TdT CD1a,CD34,CD71Total:约12-16个b,65,B-CLL与类似淋巴瘤的免疫表型,Antigen B-CLL HCL Mantle Cell Lymphoma SLVL Follocular LymphomaSIg+/-+CD5+CD19+CD20+CD22+/-+CD23+CD79b+/-+FMC-7+CD10+CD103+CD25+_+/-
18、CD11c+/-+/-Antigen：抗原；SIg：膜免疫球蛋白；B-CLL：B慢淋；HCL：毛细胞型白血病；Mantle Cell Lymphoma：套状淋巴瘤：SLVL：绒毛样脾淋巴瘤：Follocular Lymphoma：滤泡型淋巴瘤,66,滤泡中心B细胞,淋巴瘤,增殖,67,慢性B淋巴细胞白血病（B-CLL）积分系统,B-CLL：3-5分；非B-CLL：0-2分,68,ALL/CLL？-MZL,69,CLL,70,CLL,71,MCL,72,HCL,73,HCL,74,FL,75,FL,76,DLBCL,77,DLBCL,78,CLL and Non-Hodgkins Lymphom
19、a,NK LGL,CD2+CD3+,T-Cell Lineage,CD38+CD2-,CD19-,Plasma CellLeukemia/Myeloma,B-Cell Lineage,CD19+Clonal Ig,CD16+and/or CD56+CD2+,CD3-,CD4+,T-Cell CLLT-Cell LymphomaT-PLL,ATLL(Adult T-CellLeukemia),T-Cell LGLL,CD8+,CD7-,Sezary Syndrome,慢淋和T淋巴瘤分类,79,T-CLL与类似淋巴瘤的免疫表型,Antigen T-CLL ATLL T-PLL T-LGL(CD3+
20、)NK-LGL(CD3-)TdT CD1 CD2+CD3+CD5+CD7+/-+/-+s+CD16+/-+CD56+/-+CD57+CD4+CD8+/-+/-CD4-CD8+/-+/-CD4+CD8-+CD25+/-+s+/-+/-NRHLADR+/-+/-+,80,81,T-PLL,82,T-PLL,83,T细胞克隆（TCR V分析）,84,单克隆T细胞,85,86,87,88,NK-淋巴瘤,89,NK-淋巴瘤免疫表型,90,NK-淋巴瘤/白血病,91,T-NHL,92,DI=1.7,LGL,93,94,BL-DNA,DLBCL-DNA,95,多发性骨髓瘤（MM）,多发性骨髓瘤是浆细胞异常增
21、生性疾病。正常浆细胞为CD38+/CD45dim/-，使用 CD38/CD45双标记检测外周血和骨髓标本，可以准确划定浆细胞群。通常使用CD38和CD45，结合轻链检查，对多发性骨髓瘤细胞进行分析。另外，正常浆细胞的表面标记为CD19+/CD56-，而多发性骨髓瘤细胞通常为CD19-/CD56+。CD138目前认为是浆细胞最特异的指标。这样，使用流式细胞仪对外周血或骨髓标本进行多参数分析，并计算异常浆细胞含量，对于多发性骨髓瘤的诊断和治疗评估具有重要意义。,96,MM,97,98,99,100,流式免疫分型报告内容,101,流式免疫表型诊断血液肿瘤的劣势,1、纤维化、硬化的骨髓可能没有足够的细胞分析。2、细胞太多聚集或成团也可能没有足够的分析细胞。3、硬化的组织也很难得到足够的分析细胞。4、组织结构关系、形态关系丢失。5、比例太低的单克隆B细胞很难检测到。,102,流式免疫表型诊断血液肿瘤的劣势,6、没有异常免疫表型的T细胞淋巴瘤也可能很难检测。7、异常的T细胞免疫表型不一定提示T细胞肿瘤，也可能是感染引起的单核细胞增多症、反应性皮肤病、炎症性疾病。8、取材不好或样品保存不当，可能导致假阴性的结果。9、HL的肿瘤细胞水平低，所以免疫表型检测或诊断HL不可靠。10、治疗或复发可能引起肿瘤细胞表面抗原改变。,103,谢谢!,
