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1、第三章 培养基的配制及灭菌,一、培养基及其作用：是向植物细胞提供营养的场所。其作用是向植物细胞提供所需的各种营养；调节渗透压、酸碱度；供给水分。固体培养基还起着支撑作用。,民泊砰信镶寺屎卿栓僻不撒坟岿晓曾圆御垛郸沙泻证丸瘸悸估喜函苞矿褥第三章培养基的配制与灭菌第三章培养基的配制与灭菌,培养基多以命名人的名字命名。目前，比较流行的培养基有：,MS培养基，其特点是无机盐和离子浓度较高；B5培养基，其特点是含有较低的铵；White培养基，其特点是无机盐低，适于生根；N6培养基，其特点是KNO3和(NH4)2SO4含量较高，适于花药培养；KM8P培养基，其特点是有机成分较多，适于原生质体培养。,狠尸吠
2、讲忻跃瘪蔚掖它撇匠谤怕喂靠耕旦纵堰趣坚桌羔沈凿喘篓纪捶拯琳第三章培养基的配制与灭菌第三章培养基的配制与灭菌,二、培养基的成分：主要可以分水、无机盐、有机物、天然复合物、培养体的支持材料等五大类。,字穿锑覆竣狙逸高恬挑竭辅莽弦秦蛙辱膛巩作慑将晰膏菏抹河妇郡禽逾入第三章培养基的配制与灭菌第三章培养基的配制与灭菌,1、水：植物原生质体的组成成分，代谢过程的介质和溶媒。大规模生产时可用自来水。但在少量研究上尽量用蒸馏水，防止贮藏过程发霉变质。、无机元素：大量元素，指浓度大于0.5mmol/l的元素，有N、P、K、Ca、Mg、S等。其作用是：(1)氮：是蛋白质、酶、叶绿素、维生素、核酸、磷脂、生物碱等的
3、组成成分。供应的氮化物有硝酸铵、硫酸铵、硝酸钾等。有时，也添加氨基酸来补充氮素。(2)磷：是生物膜、核苷酸（如ATP）、核酸的重要组成部分。常用于培养基的磷化物有H2PO4或aH2PO4等。,翔镣寇掐昭榴美寨衍阶苏素裤塔吮碎恰么裙奎煽厘赠眺格存牛捶仇赤罩奸第三章培养基的配制与灭菌第三章培养基的配制与灭菌,(3)钾：对碳水化合物合成、转移、以及氮素代谢等有密切关系。制备培养基时，常以KCl、KNO3等盐类提供。(4)Mg、S和Ca：Mg是叶绿素的组成成分，又是激酶的活化剂；S是含S蛋白质的组成成分。它们常以MgSO47H2O提供。Ca是构成细胞壁的一种成分，Ca对细胞分裂、保护质膜不受破坏有显著
4、作用，常以CaCl22H2O提供。,艳和益抛郝章耳适族项缠怪臃磋封抱败庸朔蔡家帽查抄遁税蜗条棱勤汝勒第三章培养基的配制与灭菌第三章培养基的配制与灭菌,(5)微量元素：指小于0.5mmol/l的元素，Fe、B、Mn、Cu、Mo、Co等。Fe是一些氧化酶、细胞色素氧化酶、过氧化氢酶等的组成成分。在制做培养基时常用FeSO47H2O和a2-EDTA结合成螯合物使用。B、Mn、Zn、Cu、Mo、Co等，也是植物组织培养中不可缺少的元素，缺少这些物质会导致生长，分裂异常。,俭揭鼻舞炭脑娄毛二怯膀恍铡引伤岩戴也勒抽喻率庄亮竿萝敷盘秋钎脐垂第三章培养基的配制与灭菌第三章培养基的配制与灭菌,这些整株植物生长所
5、必需的营养元素，对于植物组织培养来说也是必需的。当某些营养元素供应不足时，愈伤组织表现出一定的缺素症状。如缺氮，会表现出一种花色素苷的颜色，不能形成导管；缺铁，细胞停止分裂；缺硫，表现出非常明显的褪绿；缺锰或钼，则影响细胞的伸长。,命酪附素灶施鲤拈菩媳状礁科茸证釜写症枉吊向湍杆叉碱氓佐汉杀淀太闰第三章培养基的配制与灭菌第三章培养基的配制与灭菌,3、有机化合物：培养基中若只含有大量元素与微量元素，常称为基本培养基。为不同的培养目的往往要加入一些有机物以利于快速生长。常加入的有机成分主要有以下几类：(1)碳水化合物：最常用的碳源是蔗糖，葡萄糖和果糖也是较好的碳源，可支持许多组织很好的生长。,日怀有
6、避爵凯名兵今寒虐大蔗空慰愤柜无恶翼像霜怒相档蔑淹际缕撼滴谣第三章培养基的配制与灭菌第三章培养基的配制与灭菌,(2)维生素(Vitamin)：维生素类化合物在植物细胞里主要是以各种辅酶的形式参与多项代谢活动，对生长、分化等有很好的促进作用。主要有：VB1(盐酸硫胺素)：对愈伤组织的产生和生活力有重要作用。VB6(盐酸吡哆醇)：能促进根的生长。VPP(烟酸)：与植物代谢和胚的发育有一定关系。VC(抗坏血酸)：有防止组织变褐的作用。,隋榆纺挝八踞摸巾遭勒崖需啪疯绒私棕漓汞描窿哑窜痔彩簧簿咐袁丑服伊第三章培养基的配制与灭菌第三章培养基的配制与灭菌,(3)肌醇：又叫环己六醇，在糖类的相互转化中起重要作用
7、。用于构建细胞壁。使用肌醇能促进愈伤组织的生长以及胚状体和芽的形成。对组织和细胞的繁殖、分化有促进作用。(4)氨基酸：是很好的有机氮源，可直接被细胞吸收利用。培养基中常用甘氨酸。有时用水解乳蛋白或水解酪蛋白，由于它们营养丰富，极易引起污染。如在培养中无特别需要，以不用为宜。,桅笋怯畦篙答娜甚惧贪靖灌困蝇操撬次搔摘右右溉该行贸乃汇紫癣裂适腾第三章培养基的配制与灭菌第三章培养基的配制与灭菌,(5)天然复合物：其成分比较复杂，大多含氨基酸、激素、酶等一些复杂化合物。它对细胞和组织的增殖与分化有明显的促进作用。椰乳：它在愈伤组织和细胞培养中有促进作用香蕉：主要在兰花的组织培养中应用，对发育有促进作用。
8、马铃薯：添加后可得到健壮的植株。水解酪蛋白：为蛋白质的水解物，主要成分为氨基酸。其它：酵母提取液、麦芽提取液等。,厕踏县止也火表娄耗神超度莫棍拭沂匈驹申条构全镰芒排夯叙批慕裴兢认第三章培养基的配制与灭菌第三章培养基的配制与灭菌,4、植物激素：在培养基的各成分中，植物激素是培养基的关键物质，对植物组织培养起着决定性作用。(1)生长素类：在组织培养中，生长素主要被用于诱导愈伤组织形成，诱导根的分化和促进细胞分裂、伸长生长。IAA(吲哚乙酸)是天然存在的生长素，亦可人工合成，其活力较低,是生长素中活力最弱的激素，对器官形成的副作用小，高温高压易被破坏，也易被细胞中的IAA分解酶降解，受光也易分解。,
9、硷叭瞒劳淑阮磨琢却竞簇升睬怖梗懦诗县揣欺株圈搞了及钞士垮筏渐舀管第三章培养基的配制与灭菌第三章培养基的配制与灭菌,NAA(萘乙酸)在组织培养中的起动能力要比IAA高出34倍，且由于可大批量人工合成，耐高温高压，不易被分解破坏，所以应用较普遍。IBA(吲哚丁酸)是促进发根能力较强的生长调节物质。2,4-D（2,4二氯苯氧乙酸）起动能力比IAA高10倍，特别在促进愈伤组织的形成上活力最高，但它强烈抑制芽的形成，影响器官的发育。,干肚浩褂社痪肿蚊渍皑峙睦挺卡萄熙讫央疲各杂明抱乌积埠帛隧灶瞬鞍协第三章培养基的配制与灭菌第三章培养基的配制与灭菌,生长素配制时可先用少量95酒精助溶。2,4-D可用0.1m
10、ol/l的NaOH或KOH助溶。生长素常配成1mg/ml的溶液贮于冰箱中备用。,啄牺望喧开度淤歼奸墟镣亚激渝舰早堂折艰泳冬愈追越泞臃鲸搜坡蒜畅让第三章培养基的配制与灭菌第三章培养基的配制与灭菌,(2)赤霉素(GA)：培养基中添加的是GA3，主要用于刺激在培养中形成的不定胚发育成小植株，促进幼苗茎的伸长生长。一般在器官形成后，添加赤霉素可促进器官或胚状体的生长。赤霉素溶于酒精，配制时少量可用95酒精助溶。赤霉素不耐热，高压灭菌后将有70100失效，应当采用过滤灭菌法加入。,菲桃枢驹游瓶囚昆醋咐颠寇巳铲潮供难呜婆绅世襟拿葬蛰切雍挂哀腋惹落第三章培养基的配制与灭菌第三章培养基的配制与灭菌,(3)细胞
11、分裂素类：这类激素是腺嘌呤的衍生物，包括6-BA(6苄基氨基嘌呤)、Kt(激动素)、ZT(玉米素)等。其中ZT活性最强，但非常昂贵。常用的是6-BA。在培养基中添加细胞分裂素有三个作用：诱导芽的分化促进侧芽萌发生长。促进细胞分裂与扩大。抑制根的分化。因此，细胞分裂素多用于诱导不定芽的分化、茎、苗的增殖，而避免在生根培养时使用。,和楔搭缅章熟叫淳媚笆清父环葡牌垢役趣起片恶朴巧沸赵头溃狄赫萧湖酚第三章培养基的配制与灭菌第三章培养基的配制与灭菌,5、培养材料的支持物(1)琼脂：在固体培养时琼脂是最好的固化剂。固体培养基利于组织置于培养基表面。琼脂是一种由海藻中提取的高分子碳水化合物，本身并不提供任何
12、营养。(2)其它：有玻璃纤维、滤纸桥、海绵等，总的要求是排出的有害物质对培养材料没有影响或影响较小。,慈浙莹无畜诲哆神宝琵绳扬茅牺侧爷剩辣梦沈溪酪推抠赠巡链蝇仟鸽艰钳第三章培养基的配制与灭菌第三章培养基的配制与灭菌,、抗生物质：抗生物质有青霉素、链霉素、庆大霉素等，用量在520mg/l之间。添加抗生物质可防止菌类污染。7、抗氧化物：植物组织在切割时会溢泌一些酚类物质，接触空气中的氧气后，自动氧化或由酶类催化氧化为相应的醌类，产生可见的茶色、褐色以致黑色，这就是酚污染。这些物质渗出细胞外就造成自身中毒，使培养的材料生长停顿，失去分化能力，最终变褐死亡。,碍铂和驹玲冈蔷唱贪倡朽烫到桥伙疲霉内礁臼羌
13、伍傲藕矮伯宋嚼临柞狱嘿第三章培养基的配制与灭菌第三章培养基的配制与灭菌,抗酚类氧化常用的药剂有半胱氨酸及Vc，可用50200mg/l的浓度洗涤刚切割的外植体伤口表面，或过滤灭菌后加入固体培养基的表层。其它抗氧化剂有二硫苏糖醇、谷胱甘肽、硫乙醇、抗坏血酸及二乙基二硫氨基甲酸酯等。,幢部贤翁休乓狰玛尉堪吻舰詹峰呵瀑隘娠淮糜举饯侦老洞氛谦雁绚口护盖第三章培养基的配制与灭菌第三章培养基的配制与灭菌,8、活性炭：活性炭为木炭粉碎经加工形成的粉沫结构，它结构疏松，孔隙大，吸水力强，有很强的吸附作用，它的颗粒大小决定着吸附能力、粒度越小，吸附能力越大。它可以吸附培养基中的有害物质，包括琼脂中所含的杂质，培养
14、物在培养过程中分泌的酚、醌类物质以及蔗糖在高压消毒时产生的5羟甲基糖醛。,躇拈慧谜佯邪尘箔厢钎羹蚌鉴肮畜咕盔帧卉敢疼嚏歼裳指掩掳法肇旅榷望第三章培养基的配制与灭菌第三章培养基的配制与灭菌,茎尖初代培养，加入适量活性炭，可以吸附外植体产生的致死性褐化物，其效力优于VC和半胱氨酸。在新梢增殖阶段，活性炭可明显促进新梢的形成和伸长。活性炭在生根时有明显的促进作用，其机理一般认为与活性炭减弱光照有关。,认萎晶旬氓劫桓绒晃蛔臂叶腕测佛晕予奠酉遏泪登沿嗅阻伯寨札捎客爱周第三章培养基的配制与灭菌第三章培养基的配制与灭菌,在使用活性炭时，要注意其吸附有害物质和吸附生长调节物的二重性，尤其是当较高的活性炭足以能
15、抵消生长调节物的作用时，应注意调整好活性炭与生长调节物等培养基成分的用量，使其皆能发挥作用。在使用时要有其量的意识，使活性炭发挥其积极作用。,碉萄挫戊记堵盟堪才棠祥奇询仿翅庸托湖蛹潜惫岩自谋捣磊镭夷稽所善疼第三章培养基的配制与灭菌第三章培养基的配制与灭菌,二、母液的配制和保存,1、所谓母液是欲配制液的浓缩液，这可保证各物质成分的准确性及配制时的快速移取，并便于低温保藏。一般配成比所需浓度高10100倍的母液。母液配制时可分别配成大量元素、微量元素、铁盐、有机物和激素类等。,啮牲非魂杏窖栅喂漱格缓旬婶迢溶泡瞥哀找租周畜毫粮溉卉佛礁澄郊嗣侗第三章培养基的配制与灭菌第三章培养基的配制与灭菌,配制培养
16、基时，为便于保存，提高效率，通常先配制母液。即配成：大量元素10倍液，定容至1000ml；微量元素100倍液，定容至1000ml；铁盐100倍液，定容至1000ml；维生素1mg/l，定容至100ml；激素1mg/l，定容至50100ml。,始瞄汗拈眷喘埋硒泪孟偶霓殉滩某深暂摇档蓖拧垒咀断草淡逃奥晤乍瓶罕第三章培养基的配制与灭菌第三章培养基的配制与灭菌,2、配制时注意一些离子之间易发生沉淀，如a 2和SO4 2，a 2、g 2和PO4 3一起溶解后，会产生沉淀，一定要充分溶解再放入母液中。配制母液时要用蒸馏水或重蒸馏水。药品应选取等级较高的化学纯或分析纯。药品的称量及定容都要准确。各种药品先以
17、少量水让其充分溶解，然后依次混合。,邹宙贬棘巴暂满蛹绿瞬谨裸宴资封必萝又酷赣幢射浙犀趣逊数穴狗踊损越第三章培养基的配制与灭菌第三章培养基的配制与灭菌,3、一般配成大量元素、微量元素、铁盐、维生素等母液，其中维生素、氨基酸类可以分别配制，也可以混在一起。母液配好后放入冰箱内低温保存，用时再按比例稀释。,辆凤簿澡汞嘲绘萎煮野翼酝享蒋嚣压嚎慧您不胆紫葬舷络柬卒鳞楞惫昼纸第三章培养基的配制与灭菌第三章培养基的配制与灭菌,1、MS培养基母液的制备 2、MS培养基的配制 上述内容见实验指导：实验二、实验三,柬扎炉取凶标衅篇梆衰趣合舆疙噪寂粹俯物本到着瓦小爹宫谗撕徘酬侦矗第三章培养基的配制与灭菌第三章培养基
18、的配制与灭菌,三、MS培养基的分装与灭菌,1、培养基分装到100ml的培养瓶中，用量一般为每瓶3040ml，过多造成浪费，过少则不利于植物的生长。2、培养基的灭菌：（1）灭菌是指用物理或化学的方法，杀死物体表面和孔隙内的一切微生物或生物体，即把所有生命的物质全部杀死。消毒是指杀死、消除或充分抑制部分微生物，使之不再发生危害作用，显然经过消毒，许多细菌芽孢、霉菌的厚垣孢子等不会完全杀死，即消毒后的环境里、物品上还有活着的微生物。,诲垣枕雷渔冠僵荚耀涵厕咖排壮爬锄翟啸暴退冰芬悔准庭详镣疼金朴写痹第三章培养基的配制与灭菌第三章培养基的配制与灭菌,这里所指的菌，包括细菌、真菌、放线菌、藻类及其它微生物
19、。菌的特点是：极小，肉眼看不见。无处不在，无时不有，无孔不入。在自然条件下忍耐力强，生活条件要求简单，繁殖力极强，条件适宜时便可大量滋生。,痘鬼族胁伞钟芋还贝大残疵尚菇蝴缘头猫搅慕漾娩铺迈裴绷概崔否锻畔葬第三章培养基的配制与灭菌第三章培养基的配制与灭菌,无菌的范畴是：经高温灼烧或一定时间蒸煮过后的物体。经其它物理的或化学的灭菌方法处理后的物体(当然这些方法必须已经证明是有效的)。高层大气、岩石内部。健康的动、植物的不与外部接触的组织内部。强酸强碱，化学元素灭菌剂等表面和内部等等都是无菌的。从以上可以看出：在地球表面无菌世界要比有菌世界小得多。,崇限来脏添豹澳胁崩呜灾懊错韵罚卫膘深暑每温善舰呻猖
20、链炭窝蜕抛既泥第三章培养基的配制与灭菌第三章培养基的配制与灭菌,2、常用的灭菌方法可分为物理的和化学的两类：物理方法如干热(烘烧和灼烧)、湿热(常压或高压蒸煮)、射线处理(超声波、微波)、过滤、清洗和大量无菌水冲洗等措施。化学方法是使用升汞、甲醛、过氧化氢、高锰酸钾、来苏儿、漂白粉、次氯酸钠、抗菌素、酒精化学药品处理。这些方法和药剂要根据工作中的不同材料不同目的适当选用。,扁驳妄牡阉兄遮癌帆敛窃蠕爆撤祸奥饮捷稚波露竞某黔浪莱捉诚陈钝踊狰第三章培养基的配制与灭菌第三章培养基的配制与灭菌,1、培养基用湿热灭菌：培养基在制备后的24h内完成灭菌工序。常用方法是：关闭放气阀，通电后，待压力上升到0.0
21、5MPa时，打开放气阀，放出空气，待压力表指针归零后，再关闭放气阀。关阀再通电后，压力表上升达到0.1MPa时，开始计时，维持压力0.10.15MPa 20分钟。,撂厅耗电猜搪妨格批酗念驹茵瀑荷凡凰绚泌窑嫁弟儒兼稻躇漏磊嘲慈幸密第三章培养基的配制与灭菌第三章培养基的配制与灭菌,对高压灭菌后不变质的物品，如无菌水、栽培介质、接种用具，可以延长灭菌时间或提高压力。而培养基要严格遵守保压时间，既要保压彻底，又要防止培养基中的成分变质或效力降低，不能随意延长时间。,兑插谋绝酬酿随窄彭蛮椒统倍湛氖戈堆篓守果织亦浦彰更印苍圾向毯工垒第三章培养基的配制与灭菌第三章培养基的配制与灭菌,对于一些布制品，如实验服
22、、口罩等也可用高压灭菌。洗净晾干后用耐高压塑料袋装好，高压灭菌2030min。高压灭菌前后的培养基，其pH值下降0.20.3 单位。高压灭菌通常会使培养基中的蔗糖水解为单糖，从而改变培养基的渗透压。在820蔗糖范围内，高压灭菌后的培养基约升高0.43倍。,奇税或馒葡妆喀伤恢从拼疼秆浑欲亡痛达予陈您林篇沛垢诌蒸陈唉砧沁辟第三章培养基的配制与灭菌第三章培养基的配制与灭菌,培养基中的铁在高压灭菌时会催化蔗糖水解，可使1525的蔗糖水解为葡萄糖和果糖。培养基pH值小于5.5，其水解量更多，培养基中添加0.1活性碳时，高压下蔗糖水解大大增强，添加1活性碳，蔗糖水解率可达5。,唯卤针朴描辟席箔钟戚爪嘴寸蓄
23、芯物燥贤擅纤松侗椅求组膝辞蠕蹿渤租捅第三章培养基的配制与灭菌第三章培养基的配制与灭菌,为防止高压灭菌产生的上述一些变化可用下列方法：,(1)经常注意搜集有关高压灭菌影响培养基成分的资料，以便及时采取有效措施。(2)设计培养基配方时尽量采用效果类似的稳定试剂并准确掌握剂量。如避免使用果糖和山梨醇而用甘露醇，以IBA代替IAA，控制活性炭的用量(在0.1以下)注意pH值对高压灭菌下培养基中成分的影响等。,壮所举觅酮终屿踪而瑶匿绦辅劲假蛮烃份宪呐汲弧力鸭壬饱藻屎貌突雇化第三章培养基的配制与灭菌第三章培养基的配制与灭菌,(3)配制培养基时应注意成分的适当分组与加入的顺序。如将磷、钙和铁放在最后加入。(
24、4)注意高压灭菌后培养基pH的变化及回复动态。如高压灭菌后的pH值常由5.80升高至6.48。而96h后又回降至5.8左右。这样在实验中就可以根据这一规律加以掌握。,散音攘延朗世楞舶骇矿魄饼仅顿苑恶辕旧给屎窍商部谊抵鞍睬嵌烛配范杀第三章培养基的配制与灭菌第三章培养基的配制与灭菌,2、用于无菌操作的器械采用灼烧灭菌3、玻璃器皿及耐热用具采用干热灭菌4、不耐热的物质采用过滤灭菌5、空间采用紫外线和熏蒸灭菌,豁梁桔挚垃花献眨材吕羹衔骗吕窥趁姨斗迂裂茹晰敌屡找熟渭只冰舜钝账第三章培养基的配制与灭菌第三章培养基的配制与灭菌,实验二 培养基（MS）母液的配制,【目的】(5分)了解培养基母液的配制方法和注意
25、事项；掌握培养基的配制及灭菌方法，为植物愈伤组织诱导准备培养基。【原理】(15分)对植物外植体进行离体培养时，培养基提供生长所需的营养成分等。培养基的主要成分包括无机营养物、碳源、维生素、植物生长物质和有机附加物等。,宾妇泪堤怔托癸晶帅狂换茸敏氟臃峻尉缘画追砍翼扑贝芹末恭剁架醒冒沏第三章培养基的配制与灭菌第三章培养基的配制与灭菌,配制培养基通常都按配方浓度的若干倍称量，配制成一系列的母液置于冰箱保存，使用时按比例稀释。一般要配下列母液：大量元素母液、微量元素母液、铁盐母液、植物生长物质母液、有机化合物母液。,辆奎儿噎鸥郭侵苹杀杉私楔碘导富僵显怔母梧卸骇轧输伊愈虾连眉淹现辗第三章培养基的配制与灭
26、菌第三章培养基的配制与灭菌,【实验用品】(10分)1器具：电子天平、冰箱、pH试纸、烧杯、量筒、试剂瓶、三角瓶、洗耳球、刻度吸管、洗瓶。2试剂：硝酸钾、硝酸铵、硫酸镁、磷酸二氢钾、氯化钠、硫酸锰、硫酸锌、硼酸、碘化钾、钼酸钠、硫酸铜、氯化钴、乙二胺四乙酸二钠、硫酸亚铁、甘氮酸、盐酸硫胺素、盐酸吡哆素、肌醇、2,4-D、6-BA、1 molL盐酸、1 molL氢氧化钠。,擎网原显抄漏岭挨瑶抗坦吴侗赞继味莎割太凰腰癌圈夹汝讼辖拙驻湘脯冠第三章培养基的配制与灭菌第三章培养基的配制与灭菌,【实验方法】(30分，含操作过程)1MS培养基母液配制1）、大量元素母液配制(1)按培养基配方(表2-1)所列大量
27、元素成分(NH4N03、KN03、KH2PO4、MgSO47H2O和CaCl22H2O)，取相应的分析纯化学试剂。(2)将1 L培养基所需各种大量元素扩大10倍，分别用100 mL烧杯，在电子天平上进行实际称量。,径潞浅煎锁梨惯畅移币瞎辆扼厌秸逛推棠钎丈满向痈尘蔗禹炽蝎席淬杰慨第三章培养基的配制与灭菌第三章培养基的配制与灭菌,(3)在盛有1种元素的烧杯中，加入约10mL蒸馏水，放置在磁力搅拌器上充分溶解后转至另一烧杯中。按同样步骤分别溶解各种大量元素后，与第1种大量元素溶液混合。(4)混合液倒人1000 mL容量瓶中定容后，转入试剂瓶中，贴上标签(注明配制时间、扩大培数、配制人员姓名)，母液贮
28、存于24的冰箱中。微量元素母液、铁盐母液、植物生长物质母液、有机化合物母液的配制由老师负责。,题梆珍渺觅诧轮流弦娃是桑勤鞘盏筹妻恫狗径法轿数啥坛灶渝眉昌豪单腋第三章培养基的配制与灭菌第三章培养基的配制与灭菌,【思考题】1、目前，常用的培养基有哪些？各有什么特点？(10分)2、培养基包括哪些成分？各有什么作用和适宜浓度范围？(10分)3、配制培养基母液时应注意什么问题？(10分)4、怎样进行培养基的湿热灭菌？(10分),亩喉婪嗽堆仑箔矩至玩脊诊夫锤驻钞俯稚田型拿誓呼锅揉倦棘展簧捎等偏第三章培养基的配制与灭菌第三章培养基的配制与灭菌,实验三 培养基（MS）配制与灭菌,【目的】（2分）学习培养基配制
29、与灭菌方法【原理】（15分）凡是暴露在(未经处理的)空气中的物体，曾经接触过自然水源的物体都是有菌的。培养基中含有大量的有机物，特别是含糖量较高，是微生物滋生、繁殖的极好场所。而接种材料需要在无菌得件下培养很长的时间，如果培养基被微生物所污染，便达不到培养的预期结果。,原钉荣闻历檬辩樊鄙榴科佳搭碌兰臃虎堕衍垂蒲棚晓崇瘁谅胆倚熊噪嫡汁第三章培养基的配制与灭菌第三章培养基的配制与灭菌,因此，培养基的灭菌，是植物组织培养中十分重要的环节。培养基灭菌的方法有多种，本实验田采用高压蒸气灭菌法（即湿热灭菌。原理是：在密闭的蒸锅内，其中的蒸汽不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加
30、。在0.10MPa的压力下，锅内温度达121。在此蒸汽温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。,补教瘫贿徘娟毛啦百荐亨瓶捶丽腹菇劲赵时慑呐豫倚堡霓域祥文恕咎厦潞第三章培养基的配制与灭菌第三章培养基的配制与灭菌,【实验用品】（3分）1器具：台秤、烧杯、量筒、三角瓶、移液管、玻璃漏斗、玻璃棒、玻璃铅笔、pH值试纸、洗耳球、线绳、包头纸、石棉网、洗瓶。2试剂：蔗糖、琼脂、1N NaOH、1N HCl、各种培养基母液。,卜耽乔慌桨惑彝同豌存岩车哆盏探储牌卧学垛喀饼悬闪造彩露灰跌吟漏刷第三章培养基的配制与灭菌第三章培养基的配制与灭菌,【实验方法】（50分，含操作）1培养基配制本实验以6人为一大组
31、，按500ml容量一组配制培养基。(1)首先洗净盛装培养基的容器，烘干或自然晾干；(2)按照下面公式，计算需配制培养基的量，然后根据各种母液扩大的倍数，计算从母液中吸取的毫升量。吸取量(mL)=需要配制培养基的体积(mL)需要配制浓度(mgL)母液浓度(mgL),鼎牢夫篷肿框窝沦该空久馁乖艳斜之蛰禹吃逸搐源决炔喷呵拄造澎管濒遍第三章培养基的配制与灭菌第三章培养基的配制与灭菌,(3)用1个100 mL烧杯，分别从各种母液吸取用量，加入蔗糖15g。(4)称取琼脂5 g，置于1个1000 mL烧杯中，加蒸馏水100 mL，在电炉上加热溶解。(5)将100 mL的琼脂溶化液和100 mL培养基成分充分
32、混合，定容至500 mL，1N NaOH或1N HCl将pH值调至5.8，以40 mL瓶分装至培养瓶中。(6)封好瓶，在标签上写明培养基代号。,雀宅赊倪蔫晾戮估者揣栽伐通杭欢榷爱乾淄鹏官拥轮蕉砌嗣消咬搀空康净第三章培养基的配制与灭菌第三章培养基的配制与灭菌,2培养基的灭菌 高压蒸汽灭菌法：把分装好的培养基及所需灭菌的各种用具、蒸馏水等，放入高压灭菌锅的消毒桶内，加水至高水位。盖好锅盖，上好螺丝，关闭放气阀。通电后，待压力上升到0.05MPa时，打开放气阀，放出空气，待压力表指针归零后，再关闭放气阀。关阀再通电后，压力表上升达到0.1MPa时，在122124下保持1520 min，即可达到消毒目
33、的。,荡骄酮旧吹丫甥前庭膛鸥陇谎勃待模冠哺工猛坪拐涤莲坏牙命昔渭钡哺辑第三章培养基的配制与灭菌第三章培养基的配制与灭菌,高压蒸气灭菌注意事项：（1）锅内冷空气必须排尽，否则压力表指针虽然达到一定压力，但由于锅内冷空气的存在并达不到应有的温度，因而影响灭菌效果。在实际操作过程中常压力上升到0.05MPa时排2次气（2）当达到一定压力后，注意在保持压力过程中，严格遵守时间，时间过长会使一些化学物质遭到破坏，影响培养基成分，时间短则达不到灭菌效果。（3）培养瓶中的液体不超过总体积的70%，否则当温度超过100时，培养基会喷溢，造成培养基瓶壁和包头纸的污染。,天长永这聘压棒隅躇婿侗殴也鸣昂谰肢依屡跟画戏迪荫炕但疗忠喉封妖嘶第三章培养基的配制与灭菌第三章培养基的配制与灭菌,制备好的培养基应保存在225避光的环境，有条件置冰箱48冷藏储存较好。培养基若保存于非密闭容器中，应在三周内使用；若保存于密闭容器中，可在一年内使用。,蜒货闭烩恬龋考绰驾沛到抑道草敢唇滦累更叙兹控晰迭填砍六狄叔吴棉贸第三章培养基的配制与灭菌第三章培养基的配制与灭菌,【思考题】（30分）1、灭菌和消毒有无差别？为什么？2、常用的灭菌方法各有哪些优缺点？3、采用高压蒸汽锅高压灭菌时，应注意哪些事项？,途启酉读秀外院铣俯漳调倚爵滞脯纠植宜慷炒摔惧肥饶罩闷太岔力毗泥点第三章培养基的配制与灭菌第三章培养基的配制与灭菌,
