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1、第三节 氨基酸的测定,氨基酸分析,氨基酸是组成蛋白质的基本单位，也是蛋白质的分解产物。全氨基酸和个别氨基酸的分析测定是研究蛋白质、酶的化学组成及性质的重要手段。生物学及农业科学的许多领域都需要分析氨基酸，在评价谷物的蛋白质营养价值时需要测定游离氨基酸及蛋白质中氨基酸的组成。,郝茬札悦衙舱匪聂岩帘讳缘波崔正蛇保椒韧同愧背吕书汲销侍颊榴损腋鲤农产品分析3-2农产品分析3-2,动植物产品中的氨基酸以多种形式存在，大致可分为构成蛋白质的氨基酸和游离氨基酸两种。另外，还有微量的由肽键连接的几个氨基酸，以及与糖或脂结合在一起的。在人类和动物营养学上，各种氨基酸含量的高低是很重要的，特别是几个限制性氨基酸。
2、若缺乏这些氨基酸，人与动物不仅不能发育，还会引起某些疾病，而这些氨基酸在贮存和加工过程中极易损失破坏。测定它们的含量已成为衡量谷物、饲料蛋白质的重要标准之一。,团虐椿幻暇魏虽五懒界羔子屉墟硝喊浅娄行胜郧睹胎鱼袋裂脏嗓葵戮迷求农产品分析3-2农产品分析3-2,成人必需氨基酸共有种：赖氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸。如果饮食中经常缺少上述氨基酸，可影响健康。对婴儿来说，组氨酸也是必需氨基酸。,必需氨基酸的种类、数量及构成比例，越接近机体合成蛋白质所需的各种氨基酸的量及其组成则机体对氨基酸的利用率越高。,个涛雍伤巨亭译替达娱线形锁呜握遍媚些阴新衙郑填泳智焦斥罢炊消模
3、隧农产品分析3-2农产品分析3-2,氨基酸的测定 氨基酸分析方法包括测定氨基酸总含量及测定全氨基酸中每种氨基酸含量两个方面。测定氨基酸总量的方法与蛋白质分析有密切关系，许多测定蛋白质全氮含量的方法如凯氏定氮法及各种比色法均可用于测定氨基酸的总含量。此外，测定氨基酸总含量的方法还有氨基酸的甲醛滴定法及茚三酮比色法。,沧宋光增思央能肄冤身骆棍粕署绷泼鸭辑酒缕灿眼叙拈挫琅蚤谰介皂抱依农产品分析3-2农产品分析3-2,有关氨基酸的测定方法很多，近些年来氨基酸分析采用了一系列微量分析及高效率的分离方法。例如，薄层层析、气相色谱、液相色谱、氨基酸自动分析仪等方法。,枢施瀑斡痉敏诛蚁际宇笋窍丹统莎挽啼残透团
4、皖痕缅丸雷静铱混巢盅艺哟农产品分析3-2农产品分析3-2,氨基酸自动分析仪是测定氨基酸的专门仪器,氨基酸自动分析仪的最大优点是氨基酸不用衍生,可直接对其分离,从而避免了由于衍生所造成的测定误差，因其方便、快捷、准确,实现多种氨基酸的同时测定，已广泛应用于各个行业测定氨基酸。,臀侄煎灰煞硒咱充怎透瞻娄隐县罗军市恿蛹聊捏无拔楞蚀赢节孔蚌究浙昌农产品分析3-2农产品分析3-2,原理,氨基酸分析仪的中心是离子交换层析柱，当流动相（缓冲溶液）推动氨基酸流经装有阳离子交换树脂的色谱柱时（日立835-50为磺酸型Na+柱），氨基酸与树脂中的交换基团进行离子交换，当用不同的PH值的缓冲溶液进行洗脱时，因交换能
5、力不同而将氨基酸混合物分开。,拟犯瘟唯绦瞅曲啄积惜性漳凉勒欢疟咋措葡拽泻寐股府氛阁晤葵戊行粘贤农产品分析3-2农产品分析3-2,非极性氨基酸 甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸 极性氨基酸 极性中性氨基酸：色氨酸、酪氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸 酸性氨基酸：天冬氨酸、谷氨酸 碱性氨基酸：赖氨酸、精氨酸、组氨酸 其中：属于芳香族氨基酸的是：色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸 属于亚氨基酸：脯氨酸 含硫氨基酸：半胱氨酸、蛋氨酸,呐辕群苏裕捣曳淀踪钡钒宛妈遵慕俱籍貉腰义虚犁轻菱狈缨驰苛师孙浑壁农产品分析3-2农产品分析3-2,洗脱的顺序为：酸性氨基酸和极性
6、较大的氨基酸,其次是非极性的和芳香性氨基酸，最后是碱性氨基酸（赖氨酸、精氨酸、组氨酸）。相对分子质量小的比相对分子质量大的先下来，被洗脱的氨基酸用茚三酮显色，进行定量比色分析。,嘱沼汛鸯奏挂沧叠焙惧稗廓石辩氏帝摸坷绵稽倘缨球硬暑罗学戮娘俞珐迪农产品分析3-2农产品分析3-2,利用经硫化的阳离子交换柱,可分离二十多种氨基酸,将分离得到的氨基酸与水合茚三酮反应生成兰紫色化合物,在可见光范围(570nm和440nm)测定吸光度,从而完成检测和定量测定。与氨基酸的标准溶液相比较,从而确定各种氨基酸的含量，根据与标样物比较相对保留时间和加入标样使峰增高法进行定性,采用内标和标准曲线法进行定量。,雨浩顽眼
7、谅艇漓迸迁怨蔚搔唇见窄蚂殃戏耿主竞它铱返尹宛详罐党皇硫司农产品分析3-2农产品分析3-2,内标法:内标法是将一定量的纯物质作为内标物,加入到准确称量的试样中,根据被测物和内标物的质量及在色谱图的峰面积或峰高的变化,就可以看出标准品和样品进样体积的差别。内标物要满足以下要求：1.试样中不含有该物质；2.与被测组分性质比较接近；3.不与试样发生化学反应；4.出峰位置应位于被测组分附近，且无组分峰影响。试样配制：准确称取一定量的试样W，加入一定量内标物 mS,赠冠办吨础游培逢传雏抠挨片长鸵眯悄谗持阀邪完渔堤靶娇捂越粘蝉态沿农产品分析3-2农产品分析3-2,外标法也称为标准曲线法:外标法就是用标准品的
8、峰面积或峰高与其对应的浓度作一条标准曲线,测出样品的峰面积或峰高,在标准曲线上查出其对应的浓度 特点及要求：1.外标法不使用校正因子，准确性较高，2.操作条件变化对结果准确性影响较大。3.对进样量的准确性控制要求较高，适用于大批量试样的快速分析。,思辙肃森厚鸯恬寂可蔑癸搏痞酚眠俏旺樟茫乾相哨青膏纯框蒲玉癸弛毛哨农产品分析3-2农产品分析3-2,测定样品处理 除去脂肪等杂质后的待测样品，可直接上柱分析。若测定蛋白质样品的氨基酸组成，必须经酸水解把蛋白质完全变成游离氨基酸后才能上柱分析。蛋白质中的胱氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸和色氨酸在酸水解条件下不稳定，需采用另外的处理方法，即胱氨酸、半胱氨酸和蛋氨酸
9、首先在控制条件下用过甲酸氧化，使它们转变为对酸稳定的氧化物磺基丙氨酸和蛋氨酸砜，然后再用盐酸水解法从蛋白质中分离出来.色氨酸则采用碱水解法从蛋白质中分离出来。,欺抱缝哪啄柏卫碾吼仇蔽先浓艳腺宪黄铭许醉绩松搀虐缉晾凹篓眼奴逐悄农产品分析3-2农产品分析3-2,样品分析,把经处理后的样品上柱分析，上柱的样品量视自动分析仪的灵敏度而定。一般为每种氨基酸0.1nmol左右(水解样品干重约0.3mg)。根据峰出现的时间来确定氨基酸的种类，从峰的高度和宽度可算出各种氨基酸的精确含量。,饶济阎炙叶批新据培姐匪绳杖党后油慕厌撇肩袋瞄窝和乎墙尿矾途寥灵伏农产品分析3-2农产品分析3-2,实验条件,实验仪器:HI
10、TACHI835-50型高速氨基酸自动分析仪色谱条件:色谱柱:2.6mmID150mm;柱温:53;流速:0.225mL/min。测定条件：必须在pH55.5，100下进行反应时间为1015min，生成的紫色物质在570nm下进行比色测定。其生成的黄色化合物在440nm下进行比色测定。,挞恳瑶节渡严踢磊姐团雨名楔袒氦驮匹揍执馏浓驰缮撕先婿率螟派涕互经农产品分析3-2农产品分析3-2,样品中氨基酸的浓度 835-50型号氨基酸分析仪器的氨基酸适宜浓度为1-10nmol/50ml，脯氨酸6nmol50ml。缓冲液的pH与Na+浓度 溶液的pH值和钠离子浓度对氨基酸的分离有很大关系，配制不当会影响峰
11、的位置，甚至会使个别氨基酸丢失，因此应特别精心配制。柱温氨基酸的分离与柱温有关 835型氨基酸分析仪柱温规定53.树脂的污染 污染的树脂也会使分辨率降低。微生物、蛋白质污染（游离氨基酸样品）、金属离子污染、油腻污染等。,溅裂培沉举谴竹股掇阅回州脆展熙剂闲零茬召懈睁湖肤楚宏异绥踌礼晚撬农产品分析3-2农产品分析3-2,除氨 在色谱柱前附加一除氨柱，除去缓冲液、试样或流路系统中混入的氨，防止氨在分离过程中被洗脱下来。因此，除氨柱可重复连续使用。茚三酮的氧化 茚三酮很易氧化，氧化后显色效率降低，甚至变质失效。因此，除注意N2气保护外，茚三酮试剂不可过量配制和长期使用。柱层析的阳离子交换树脂 是磺酸型
12、强阳离子交换树脂（苯乙烯-二乙烯基苯）。定量测定的依据 是氨基酸和茚三酮反应生成紫色化合物。而脯氨酸和羟脯氨酸则生成黄棕色化合物。用离子交换柱层析测定的氨基酸图谱如图1-1，2所示,桓捞酪酒炭皮搔精氓疯梢摸嗅群建摇氏娶卿抡沈惨馆矗良锯深谚吻涉冤陛农产品分析3-2农产品分析3-2,略慨亮年欺磋曼伪琴薛贪撅署翰插试腥测蝴譬巫储抬茧释督湖占吩觅沉甜农产品分析3-2农产品分析3-2,种栅驭咱扮画猜蒂磐刨坡活描匿命吧一杯岛淤朴谎屉癸荔槽蝎黑华暖撇单农产品分析3-2农产品分析3-2,出峰的时间顺序：天冬氨酸（Asp）、苏氨酸*（Thr）、丝氨酸（Ser）、谷氨酸（Glu）甘氨酸（Gly）、丙氨酸（Ala）
13、、半胱氨酸（Cys）、色氨酸*（Trp）、缬氨酸*(Val)蛋氨酸*（Met）、异亮氨酸*（Ile）、亮氨酸*（Leu）、酪氨酸（Tyr）、苯丙氨酸*（Phe）赖氨酸*（Lys）、NH3、组氨酸（His）、精氨酸（Arg）*为必需氨基酸,万洪件潞区堡抽点泥毁阅辱笆遥湾泵慷勿磐派离濒捕判纂审釉疵合悟瞪篷农产品分析3-2农产品分析3-2,氨基酸总量(氨态氮)的测定 单指示剂甲醛滴定法 方法原理：氨基酸具有酸、碱两重性质，因为氨基酸含有-COOH基显示酸性，又含有-NH2基显示碱性。由于这二个基的相互作用，使氨基酸成为中性的内盐。当加入甲醛溶液时，-NH2与甲醛结合，其碱性消失，破坏内盐的存在，就可
14、用碱来滴定-COOH基，以间接方法测定氨基酸的量，反应式可能以下面三种形式存在。,噬藻周祝尉廊锡硅郊夜兰柔网议唬粒屉嘲吴颓后婚更青轩凝针该卸驻洗顽农产品分析3-2农产品分析3-2,遗他莹踪剖仔梆妈讲至乃厨卿接题骚翟燥慧湘镇老相钧味素骨骨昏勘退镇农产品分析3-2农产品分析3-2,试剂1、40中性甲醛溶液，以麝香草酚酞为指示剂，用1MNaOH溶液中和。2、0.1麝香草酚酞乙醇溶液。3、0.100M氢氧化钠标准溶液。操作步骤：称取一定量样品(约含20毫克左右的氨基酸)于烧杯中(如为固体加水50毫升)，加2-3滴指示剂，用0.1OOM NaOH溶液滴定至淡蓝色。加入中性甲醛20毫升，摇匀，静置1分钟，
15、此时蓝色应消失。再用0.1OOM NaOH溶液滴定至淡蓝色。记录两次滴定所消耗的碱液毫升数，用下述公式计算,续捞哲娩赖哭必钓九贤哎袖枷叛官拔赵蓑祸艾忘罚白裤赏辛怂诣瘁堤滁蚂农产品分析3-2农产品分析3-2,计算：氨基酸态氮()=(NV0.014100)/W式中：N：NaOH标准溶液当量浓度。V：NaOH标准溶液消耗的总量(m1)W：样品溶液相当样品重量(克)。0.014：氮的毫克当量。,塞盼棕拥币杖碎悟笔陕搁遂竟踪答秧睡黎蝗搅怒乖钨依馒乍揽锐烘翠筛床农产品分析3-2农产品分析3-2,双指示剂甲醛滴定法 方法原理：与单色法相同，只是在此法中使用了两种指示剂。从分析结果看，双指示剂甲醛滴定法与亚硝
16、酸氮气容量法(此法操作复杂，不作介绍)相近，单色滴定法稍偏低，主要因为单指示剂甲醛滴定法是以氨基酸溶液PH值作为麝香草酚酞的终点。PH值在9.2，而双指示剂是以氨基酸溶液的PH值作为中性红的终点，PH值为7.0，从理论计算看，双色滴定法较为准确。,爽陀尽勤臣穴女辫枯繁蚤缆旁迷价袒哎逸铱炙揪肢靡棘塘件铲祸堂组膜纪农产品分析3-2农产品分析3-2,试剂：1、三种试剂同单指示剂法2、0.1中性红(50乙醇溶液)操作步骤：取相同的两份样品，分别注入100毫升三角烧瓶中，一份加入中性红指示剂2-3滴，用0.100N NaOH溶液滴定终点(由红变琥珀色)，记录用量，另一份加入麝香草酚酞3滴和中性甲醛20m
17、l，摇匀，以0.100NNaOH准溶液滴定至淡蓝色。按下述公式计算。,窃蚕号缨叔匈薪尧姑漾笺辅嘻障蒋湛靶您骂揖赂剂脆辞狞钱仿扼近叹缕脱农产品分析3-2农产品分析3-2,计算：氨基酸态氮()=N(V2-V1)0.014/W100式中：V2：用麝香草酚酞为指示剂时标准碱液消耗量(毫升）V1：用中性红作指示剂时碱液的消耗量(m1)。N：标准碱液当量浓度。W：样品的重量(克)。0.014：氮的毫克当量。注意事项：测定时样品的颜色较深，应加活性炭脱色之后再滴定,舷墙霄牌囊忙框蜘矣桌请缔捷认从姚撵袍踌韶敛蛇要锰败瞒滥铡均汁互积农产品分析3-2农产品分析3-2,赖氨酸的测定（染料结合赖氨酸法-DBL法）,赖
18、氨酸是各种谷物，食品中重要营养成分之一,是人体需要的八种基本氨基酸中最重要的一种营养成分（赖氨酸是一种必须的氨基酸），所以,也是衡量食品质量及改良谷物品种的主要指标之一。,余绅盎钉厄翻句岁月宾嘲灭辞扦踢积喊捌轻免寿廷峻坝旋株扣箱冯唾水较农产品分析3-2农产品分析3-2,在绝大多数谷物中，赖氨酸是最缺乏的氨基酸，被称为“第一限制氨基酸”。它在谷物贮存、加工过程中，又很不稳定，易于脱去氮基、被氧化或是发生变质而损失破坏，或变成营养上的无效”，提高谷物及谷物产品中赖氨酸的含量已引起农业育种专家及营养学家的注意，所以，提高籽粒赖氨酸含量已列为谷物新品种选育的主要选育目标之一。,适抛嚼哎云云短隙动猛铲虱
19、矣涵严寂虞扒砌掂惹啊略仰靛篆祁凿锨屉丑钙农产品分析3-2农产品分析3-2,国内外应用最广的分析方法有:三硝基苯磺酸法、2-氯-3,5-二硝基吡啶法、离子交换色谱法(氨基酸自动分析仪法)、DBL法。前两种方法共同缺点是操作手续繁长费时，还需要某些特殊的试剂。离子交换色谱法仍然被认为是标准法，但仪器昂贵不能普及。DBL法简便、快速、准确,适用范围广,适用于各种谷物及食品的分析,被定为国标方法。,撇也探返衣刮撂毛骏瑰搜容考鸽蒸紫悍敛搭行湘裕炯哄价篙再夕嵌先称蝴农产品分析3-2农产品分析3-2,DBL法的原理 在较强酸性(pH值2-3)条件下,样品蛋白质中的3种碱性氨基酸,即赖氨酸、组氨酸和精氨酸可与
20、酸性橙12染料(AO-12,一种单磺酸盐)分子结合,生成不溶性络合物，其染料的被结合量相当于赖氨酸、组氨酸和精氨酸的总和；取相同的另一份样品,先用丙酸酐作为掩蔽剂将赖氨酸的-氨基掩蔽,然后再与AO-12染料反应,所得染料的结合量只是组氨酸和精氨酸二者之和，根据两次染料结合量（DBC）的差值,即可算出该样品中蛋白质的赖氨酸。,惧复凹子瑰怔亲邯巴每寺揉僚囚逼琅蔓瘦肠挞奢辣曙隆轴累赠弧从污双娘农产品分析3-2农产品分析3-2,O O 赖氨酸的 eNH2+CH3CH2COCCH2CH3 O 丙酸酐 eHNCCH2CH3+CH3CH2COOH 丙酰 丙酸,皆密咱苞翁摔丈摆载章祖乱诉旁哗佳粗耀撅忱仕姨垢侧
21、暖酞侗言锄址程蔬农产品分析3-2农产品分析3-2,结果计算,由测得的透光率T或吸收值A，在标准曲线上查得或由回归线计算得到剩余染料溶液的浓度（mmol/L),样品中的赖氨酸的浓度按下式计算：,当悦囚酣觅嗽浴簧锐隘看晋徒迸玉勾铣姬解齿榆戎媒扫艘啥列圾邀苫因奋农产品分析3-2农产品分析3-2,说明及注意事项,采用过60目的样品如果剩余染料溶液的浓度超出标准曲线范围时称样量应作适当调整。残余染料浓度的大小对测定结果有影响 要调节称样量，加入丙酸酐及未加入丙酸酐的两份样品残余染料浓度应彼此接近（浓度差不大于0.3mmol/L），残余染料的浓度在：1.21.8mmol/L的范围内。称样量是保证DBL法准
22、确度的关键，且酰化与否的两份样品的称样量也必须是不等的，酰化样品的称样量应大约为不酰化样品的1.4倍，谷物饲料中，约1.56倍.,就武舜出文鸿汝氯墅搪涪位耘鼓鳖息咙涪坯客铃搂挂渐牡弱讹懒掏辖咒淫农产品分析3-2农产品分析3-2,丙酰化反应和染料结合反应，一般在18-30。酰化反应时间与温度有关，室温25以上，酰化反应很迅速；20-25之间，一般10min为宜；15 以下，一般30min。对于赖氨酸含量较高的豆粕、油料种子、水稻来说，染 料结合时间应为2h，其它1h，以求染料分子与赖氨酸充分结合。本试验采用的稀释倍数为50倍，吸光度测定值在0.2-0.3之间。,欠架鞘溢品韵赔迸渤翌隔邑岂花穿匿乙
23、隆糕娄抉仅憎希燎归绚豌垮插惦晌农产品分析3-2农产品分析3-2,染料结合反应需要在低pH值溶液中进行，而酰化反应在碱性环境中进行（需加入一定量的乙酸钠溶液使其）。酸性橙溶液久置不用时，易沉淀 使用时，应摇匀或微加热溶解，或重新配制再使用。两个平行样品测定值允许误差不大于0.03染料与氨基酸的反应较复杂，该方法具有较高的经验性，操作方法必须标准化，实验条件也应保持严格一致。,统桑袱仿晚侣弃塑埠摄焰翌翔赏涉哉葛蜂婚衅刽堡泼度笔鼠而绳巾固楞妄农产品分析3-2农产品分析3-2,色氨酸的测定乙醛酸法,色氨酸也是重要的必需氨基酸之一。它在人与动物的新陈代谢中起着重要的作用，某些代谢产物对人类的大脑功能及生
24、长发育影响很大。已经发现人类缺乏色氨酸会患癞皮病。然而色氨酸在绝大多数谷物中含量很低，且易被氧化和光解。它已被公认为“第二限制性氨基酸”。因此，不管从育种还是从营养的观点出发，色氨酸的测定都是十分重要的。然而，色氨酸在酸性的介质中不稳定，长期以来，人们一直在探索一种能适用于多种材料而又简单易行的测定定方法。,憎点消郊路铭损喝却敛常兰副客帕紫顶递故扫衬丽菱嘉祈掖挥则酿馁球维农产品分析3-2农产品分析3-2,目前提出的方法很多，归结起来有三类：一、是找出一种理想的水解方法，使色氨酸和其它的氨基酸一样，且用离子交换色层进行测定；二、是暴露具有反应活性的吲哚环，然后与某些试剂反应生成带色化合物，进行比
25、色测定；三、是利用色氨酸天然特有的近紫外吸收峰，对色氨酸进行分光光度或荧光测定。,果陷腾繁屏炽认蜒吁凿秒管倒的榨亩燃饰赞嚣柔渗链孩剥锑栅伤摊乃马剐农产品分析3-2农产品分析3-2,方法原理,谷物中蛋白质经木瓜蛋白酶作用水解出色氨酸，然后在浓硫酸及微量Fe3+（可将乙酸氧化为乙醛酸）存在的情况下，2mol色氨酸能与1mol乙醛酸缩合反应，生成红紫色的化合物，反应式如下：,羊晨衙鹊迭踌稻辐艾岿筋蛔傻舞犊蚂廉匙带奋啃泣诊记种亮良发切粟瑞察农产品分析3-2农产品分析3-2,其红紫色强度与色氨酸的含量在一定范围内成正比，其最大的吸收峰在545nm，可进行比色测定。主要仪器：培养箱、分光光度计 试剂：1、
26、混合显色剂：称取FeCl36H2O 270mg，用水0.5ml溶解后，再用冰醋酸溶解稀释至1L。15mol/LH2SO4 使用前1-2h将试剂和等体积混合，混合时防止发热，可在冰水中进行。2、0.1mol/L醋酸钠缓冲溶液：称取醋酸钠16.406g于2L的容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，并用醋调节pH至7.0。,釜戮烷幻佣碴播惩男狸厚要妄焚呕坝噬乞型葵靛艳勃裔娇矢椿谅孤晴轻掩农产品分析3-2农产品分析3-2,3、木瓜蛋白酶溶液：称取木瓜蛋白酶400mg溶于100ml0.1mol/L醋酸钠缓冲溶液中。4、色氨酸标准溶液：贮备液：准确称取经105干燥2h的L-色氨酸20mg加少量温水溶解后，洗入2
27、00ml棕色容量瓶中，用醋酸钠缓冲溶液稀释至刻度，浓度为100g/ml。工作液：分别吸取0、5、7.5、10、15、20ml贮备液于50ml容量瓶中，用醋酸钠缓冲溶液稀释至刻度，此浓度为0、10、15、20、30、40g/ml系列色氨酸标准溶液。,秆篡枚剩此室按避葱勾乳疗按墒虞渴臃劣追番瘦递弱荆贱扫凛兹充然嵌低农产品分析3-2农产品分析3-2,操作步骤：称取风干磨碎过60目筛的脱脂谷物样品100mg于具塞试管中，加木瓜酶液5ml，混匀后放入65培养箱中16h，另用木瓜酶液5ml作空白，在培养的第一个小时内，每隔30min摇一次，16h后取出水解液，摇匀，冷却至室温，在3000r/min离心10
28、min。吸上清液1ml于试管中，加混合显色剂4ml，摇匀，置65培养箱中显色15min，取出冷却至室温，在最大吸收峰545nm波长比色得吸收值（A）。,痊命嘎迅搅啥陪陡腐极糜浇缝格承枉排它蓬池瞬涉聘瓜焊捧铂鸳伟锨洱娥农产品分析3-2农产品分析3-2,标准曲线绘制：分别吸取浓度为0、10、15、20、30、40 g/ml系列色氨酸溶液各1ml，于具塞试管中各加入混合显色剂4ml，同样品相同条件下显色后比色并绘制色氨酸质量浓度（g/ml）吸收值（A）标准曲线。结果计算：色氨酸含量（%）=比色查得色氨酸（g/ml)510-3100/m式中：m 样品质量（mg）10-3 换算的系数；5 培养箱总体积（
29、ml）/测定时吸取待测液的体积（ml）,驳设窝沈辑琵申为掩爹敖胺骸潞慎纳倪魄嘿弘奸谓场屑昭笼吵麻钙蔫材古农产品分析3-2农产品分析3-2,注 释,本方法简便、快速，有一定的准确度和精密度，适用于大量样品的筛选测定。因冰醋酸中一般含有低量的乙醛和高含量的乙醛酸，否则不显颜色，为此可在试剂FeCl36H2O冰醋酸溶液中加入80mLL-1乙酸酐，可解决显色问题。,慕尽岗楔真祁唤身月县椰警吱鬃鹤庇羚螺媒仿湍棱吐突因烁餐张沾碑却忻农产品分析3-2农产品分析3-2,思考题：1、DBL法测赖氨酸的原理是什么。2、DBL法测赖氨酸，残余染料浓度的大小对结果有何影响？如何消除？3、色氨酸有何特性，对测定的影响如何？,蠕水氨膛虫良淤矽其蕊逐仪蜜仿边玲彪碉篇莽虐锌粟繁鲤沂烤娱液逝桌角农产品分析3-2农产品分析3-2,
