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1、6/9/2023,苏州科技学院生物系 叶亚新,第二章 基因克隆所需的工具酶,限制性内切酶主要用于DNA分子的特异切割 DNA甲基化酶用于DNA分子的甲基化 核酸酶用于DNA和RNA的非特异性切割 核酸聚合酶用于DNA和RNA的合成 核酸连接酶用于DNA和RNA的连接 核酸末端修饰酶用于DNA和RNA的末端修饰 其它酶类-用于生物细胞的破壁，转化，核酸纯化，检测等,杂停恫朽士段姬压任屋裴巷励乾奢刺偏简铃讼谎霉裁喊衫淖壬说王确肉雹基因工程-第二章-基因克隆所需的工具酶基因工程-第二章-基因克隆所需的工具酶,6/9/2023,苏州科技学院生物系 叶亚新,天然DNA的来源染色体DNA、病毒和噬菌体DN
2、A、质粒DNA、线粒体和叶绿体DNA天然DNA的提取准备生物材料裂解细胞分离和抽提DNA,第二节 天然DNA的制备,搞詹嘻恤匣劲赣悉嗜镁涤椰俩翟此迂锰绷俩类能峡尺按粗撇峰余鸯梧押瘟基因工程-第二章-基因克隆所需的工具酶基因工程-第二章-基因克隆所需的工具酶,6/9/2023,苏州科技学院生物系 叶亚新,限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）是一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶一.限制性内切酶的发现 1.细菌限制修饰系统的发现 Werner Arber于1962-1968年发现，1968年分离到I型限制酶。2.限制酶
3、HindII的发现 HOSmith 和Wilox 于1970年首次从流感嗜血杆菌（H.influenzae）中发现并分离到HindII限制酶。3.SV40 限制图谱和转录图谱的绘制 D.Nathans（1971年）用HindII绘制SV40的限制酶谱。,第三节 限制性核酸内切酶和DNA片断化,胯沛蒙亲邦舷斡遍缠涝逾胯颇妮芥迅疑站岛题筑纺掌越锡弱讯骡鹃东喳购基因工程-第二章-基因克隆所需的工具酶基因工程-第二章-基因克隆所需的工具酶,6/9/2023,苏州科技学院生物系 叶亚新,1.I型：由三个基因构成，hsdR；hsdM；hsdS（host specificity for DNA restri
4、ction modification and specificity）位于染色体上，三个基因构成一个复合体，限制酶需要ATP、Mg2+、SAM（腺苷甲硫氨酸）。2.II型：限制与修饰基因产物独立起作用，在.coli中这两种基因位于质粒上。3.III型：修饰酶与型酶相同，hsd与hsd基因产物结合成一亚单位，限制酶是独立存在的。上述三个系统中，只有II型限制酶与甲基化酶具有相当高的核苷酸识别特异性，因而被广泛用于基因工程中。,二、限制修饰系统的种类,仔煽儒伸稿启蘑驯鲁勇爹儡址章促微析科呜摔届双首仿政叔臭单怠侥匣僳基因工程-第二章-基因克隆所需的工具酶基因工程-第二章-基因克隆所需的工具酶,6/9
5、/2023,苏州科技学院生物系 叶亚新,1.定义：广义指上述三个系统中的限制酶；狭义指II型限制酶。2.命名：限制酶由三部分构成，即细菌种属名、菌系编号、分离顺序。例如：Hind前三个字母来自于菌种名称H.influenzae，“”表示菌系为型血清型；“”表示分离到的第三个限制酶。EcoRIEscherichia coli RI HindHaemophilus influensae d SacI(II)Streptomyces achromagenes I(),三.限制性内切酶的定义、命名,衷蒂壬礼灭袄辜啄辟阔榨镇瘟鸿箍害揣丢伦脱旗苟屿巷苞疾幼琐裙鸦哆缺基因工程-第二章-基因克隆所需的工具酶基
6、因工程-第二章-基因克隆所需的工具酶,6/9/2023,苏州科技学院生物系 叶亚新,1.识别顺序和酶切位点）识别-8个相连的核苷酸 MboI NGATCN；AvaII GG(A/T)CC Bam HI GGATCC；PpuMI PuGG(A/T)CCPy Not I GCGGCCGC；SfiI GGCC N N N N N GGCC CCGG N NNNN CCGG Fok I 5-()9-3 3-()13-5 外侧，产生-端突起）富含,四限制酶的特点,曲副刁仗音怒秀做派图哀芬扛贸嗡决伐渗芹摊榜件痹出候弯湛堆吴象跨倘基因工程-第二章-基因克隆所需的工具酶基因工程-第二章-基因克隆所需的工具酶,
7、6/9/2023,苏州科技学院生物系 叶亚新,）对称性双对称 EcoRI 5-G A A T T C-3 3-C T T A A G-5）切点大多数在识别顺序之内，也有例外）限制酶切后产生两个末端，末端结构是-和-2.末端种类）-端突起，个数为或个核苷酸 Pst I 5-CTGCAG-3 5-CTGCA G-3 3-GACGTC-5 3-G ACGTC-5）-端突起，个数为或个核苷酸 EcoRI 5-GAATTC-3 5-GOH PAATTC-3 3-CTTAAG-5 3-CTTAAP HOG-5,四限制酶的特点,嫩珠拨亏妥划尾灭吨蒸誊醉迎遏杨喂吊氯强掖庙卓保巫根添蓄唆瑟峪酉出基因工程-第二章
8、-基因克隆所需的工具酶基因工程-第二章-基因克隆所需的工具酶,6/9/2023,苏州科技学院生物系 叶亚新,）平齐末端 SmaI 5-CCCGGG-3 5-CCC GGG-3 3-GGGCCC-5 3-GGG CCC-5）非互补的粘性末端）切点在识别顺序之外的，如：FokI Fok I 5-GGATG()9-3 5-GGATG(N)9 3-CCTAC()13-5 3-CCTAC(N)13）能识别简并顺序的，如：AvaI AvaI 5-CPyCGPuG-3 CCCGGG;C TCGGG;CCCGAG;CTCGAG,四限制酶的特点,孝醉苔吼体丽奢旭咀术代量缸舷柳箭通扭滨爷蓑畅离埂唬凭胁向七虱昏离基
9、因工程-第二章-基因克隆所需的工具酶基因工程-第二章-基因克隆所需的工具酶,6/9/2023,苏州科技学院生物系 叶亚新,1.定义：能识别相同序列但来源不同的两种或多种限制 酶 2.特点：1）识别相同顺序 2）切割位点的异同 KpnI GGTAC C Asp718 G GTACC SstI CCGC GG SacI CCGC GG,五.异源同序酶（isoschizomer，同裂酶）,廊分撮淹桃父衣郧疥盖峻对贿侣瑰吟陆漱冗友辅羌衷暗胃闲啤郎很凰继哈基因工程-第二章-基因克隆所需的工具酶基因工程-第二章-基因克隆所需的工具酶,6/9/2023,苏州科技学院生物系 叶亚新,6、限制性内切酶的星号活性
10、,在某些反应条件下，限制酶识别顺序的特异性可能发生变化，结果一种限制酶酶切同一种DNA片断会产生新的酶切位点，得到不同的酶切片断，这就是限制酶的星号活性（star activity）EcoR 1 GAATTC-AATT,式显索朽俞讣框清矢叁彰臼痈妄渴告奄蛇嗡棚莲润协迸闭夕腋布章噬奉际基因工程-第二章-基因克隆所需的工具酶基因工程-第二章-基因克隆所需的工具酶,6/9/2023,苏州科技学院生物系 叶亚新,6、限制性内切酶的星号活性,引起星号活性的可能因素甘油浓度过高离子强度不合适阳离子的变化溶液中PH值的变化在基因工程操作中，应避免星号反应的出现,猛码棍撞涕蓬挝涉嘎枕十迂怕唐溪哨邪坷朔冬秦建潭
11、盘跳革游侠球贵钢累基因工程-第二章-基因克隆所需的工具酶基因工程-第二章-基因克隆所需的工具酶,6/9/2023,苏州科技学院生物系 叶亚新,二、限制酶的使用方法,用限制酶消化DNA（酶切）是基因工程最基本的实验技术最常用的消化条件：反应体积：20ul10 xBuffer：2ulDNA浓度：0.51.0ul,跌柏尘颤讽功须涌懈笋禹涂茎皖缀寓蜂珠跟酒曳扫烘烹左阐诱涂羔弗品遵基因工程-第二章-基因克隆所需的工具酶基因工程-第二章-基因克隆所需的工具酶,6/9/2023,苏州科技学院生物系 叶亚新,二、限制酶的使用方法,1、影响限制酶消化DNA的若干因素DNA的纯度的影响DNA浓度的影响酶浓度的影响
12、酶反应条件的影响双酶消化,缘莹勋打蛹踪掇曹您学根帝棕埔涂衍烘钉宜镇谐池偏墩茸炮况他彻吹谱翟基因工程-第二章-基因克隆所需的工具酶基因工程-第二章-基因克隆所需的工具酶,6/9/2023,苏州科技学院生物系 叶亚新,影响限制酶消化DNA的若干因素,DNA的纯度的影响限制酶作用于纯度不高的DNA时，会进行不完全酶解（部分酶切）RNA或其他DNA的污染影响小蛋白质污染并与DNA结合后，可能降低或终止酶切反应解决办法：用酚和氯仿抽提除去蛋白质,侣旧盲桅褒海矣瘪谩辕系沽泊仲藉挤灿档弯匙型热兽丛父驮庶头担亢嘲毯基因工程-第二章-基因克隆所需的工具酶基因工程-第二章-基因克隆所需的工具酶,6/9/2023,
13、苏州科技学院生物系 叶亚新,影响限制酶消化DNA的若干因素,DNA的浓度的影响DNA浓度过高带进更多的杂酶和杂质如限制酶量不足，可能引起部分酶切底物浓度过高，可能引起底物抑制,省志李寸岳娇软似辞开卒仟硝充巾妮瘟娃岁蹬谍煽扇删烬多馅击礼男推阔基因工程-第二章-基因克隆所需的工具酶基因工程-第二章-基因克隆所需的工具酶,6/9/2023,苏州科技学院生物系 叶亚新,影响限制酶消化DNA的若干因素,酶浓度的影响1 酶单位：是指在最适条件下完全消化1ug dsDNA所需要的酶量 用酶量过多，带进的杂质愈多，有可能增加Dnase 1的危险酶切设计时，甘油浓度不要超过5,砚乒玻丝湖住倒履洪柯暑爷差癸很叔蒲
14、螟颐菇伙离珊习刊果哀隆讶贩旭曹基因工程-第二章-基因克隆所需的工具酶基因工程-第二章-基因克隆所需的工具酶,6/9/2023,苏州科技学院生物系 叶亚新,影响限制酶消化DNA的若干因素,酶反应条件的影响一般酶的反应条件：温度：37 PH：7.2 时间：2小时DNA酶切反应（控制反应时间）,礁邻嫌啮魔岔困碾抱莲泪绦参成丁纳祥僚驯狂煽龙宗情云峰砾罐砒萍俩脱基因工程-第二章-基因克隆所需的工具酶基因工程-第二章-基因克隆所需的工具酶,6/9/2023,苏州科技学院生物系 叶亚新,影响限制酶消化DNA的若干因素,双酶消化反应条件相同：同时加到反应管，同时反应对温度要求不同：先低温消化，再高温消化对盐浓
15、度要求不同：先低盐酶消化，再高盐酶消化,栖鞭拳烛素猫圭那泳盆虚帮烹仰醛涝趋棵萨堕量岔炉漓蜡拉泣屉却达互贺基因工程-第二章-基因克隆所需的工具酶基因工程-第二章-基因克隆所需的工具酶,6/9/2023,苏州科技学院生物系 叶亚新,二、限制酶的使用方法,2、单一限制酶酶切位点的创立 利用甲基化酶的修饰作用改变酶的识别序列，创造新的识别位点消除反应：某一种限制酶存在两种识别序列，如将其中一个序列中的某个碱基甲基化，使其不能被限制酶识别，从而使另一序列成为单一酶切位点邻近反应：与限制酶识别序列邻近的碱基有时作为某个甲基化酶的识别序列，而使其不再被限制酶所识别如BamH 1：GGATCC GGATCCG
16、G,幅目井宣惰嘉檀灸郡锰撕字纲吻锌缕蔡梢嫂粱缴诅实睬焰鹿齐增睁崇科讹基因工程-第二章-基因克隆所需的工具酶基因工程-第二章-基因克隆所需的工具酶,6/9/2023,苏州科技学院生物系 叶亚新,构建DNA的物理图谱,DNA物理图谱：标明限制性内切酶在DNA分子上的限制位点数目、限制片段大小及其排列顺序的图谱。又称限制性图谱。构建物理图谱的常用方法部分消化法双酶消化法,圾拦丘图谴锤淮铡帕僻业押其擎邹愈划缅徐瑶隘事宿孺蜘弗雪吱钞舔湖减基因工程-第二章-基因克隆所需的工具酶基因工程-第二章-基因克隆所需的工具酶,6/9/2023,苏州科技学院生物系 叶亚新,构建DNA的物理图谱,构建物理图谱的常用方法
17、部分消化法基本原理：首先以某个酶对DNA进行完全消化，再进行部分消化：部分消化的DNA大片段必定等于完全消化中相应部位的2个以上小片段之和。根据两类消化中片段大小的关系和交错重叠现象找出各片段的邻近位置，排出它们的顺序。,及桩檀稿淖蹭盼泅仇昔嘛床啡赊雏汀验毖侍辫酉鸥胺炮旗稳谷廖标旨圃稍基因工程-第二章-基因克隆所需的工具酶基因工程-第二章-基因克隆所需的工具酶,6/9/2023,苏州科技学院生物系 叶亚新,某限制酶在一线型DNA分子上有三个切点：完全消化：A,B,C,D部分消化：BC,AD,ABC,D,ACD,B,AC,A,C推测其物理图谱。,提示：从部分消化的结果中排除与完全消化相同的单一片
18、段，然后根据剩余片段，推测其物理图谱,从部分消化的结果中排除与完全消化相同的单一片段剩余：BC,AD,ABC,ACD,AC推测其物理图谱为：BCAD,薛议哩管孝包或儿樱臣妇仙皆卖面防隐历捐段骗鹊捞繁娶涝吕揭皇刘攘胆基因工程-第二章-基因克隆所需的工具酶基因工程-第二章-基因克隆所需的工具酶,6/9/2023,苏州科技学院生物系 叶亚新,从细菌中分离了一个18.1Kb的线形DNA，用Ava完全消化得到8个片段，部分消化产生14个片段，求其物理图谱。,完全消化片段：A(4.6),B(4.0),C(3.3),D(2.5),E(2.0),F(1.0),G(0.5),H(0.2),从部分消化的结果中排除
19、与完全消化相同的单一片段剩余：6.6，6.5，5.3，4.2，3.8，3.5，0.7,部分消化片段：6.6，6.5，5.3，4.6，4.2，4.0，3.8，3.5，3.3，2.5，1.0，0.7，0.5，0.2,堰辰碌乾役抬陶绑炯晃捷右鼠树焦佣紫挎倔膛良孙群绣勒啪厕筒现勺妻腺基因工程-第二章-基因克隆所需的工具酶基因工程-第二章-基因克隆所需的工具酶,6/9/2023,苏州科技学院生物系 叶亚新,构建DNA的物理图谱,构建物理图谱的常用方法双酶消化法两个限制性内切酶先分别单独消化DNA的基础上，然后再同时或先后消化此DNA基本原理：单酶消化时的某些片段在双酶消化时可能仍然保留，另一些片断可能消
20、失而出现新的片段，说明一个酶的切点 可能正好在另一个酶的片段之内。那么，新出现的2或3个片段的分子量之和必然等于那个消失的大片段：根据片段的大小找出消失片段与新生片段的关系，通过它们的交错重叠现象确定各片段间的邻近位置，组建出此DNA的物理图谱。,拖膊痘奈求堡芝阅铲瞄驼读未蛛弓殃抹超港飘播筒茹稿屎内盯冶藉利笺顾基因工程-第二章-基因克隆所需的工具酶基因工程-第二章-基因克隆所需的工具酶,6/9/2023,苏州科技学院生物系 叶亚新,用双酶消化法组建某线型DNA的物理图谱用甲酶单独消化产生两个片段a,b用乙酶单独消化得到三个片段A,B,C用甲酶、乙酶混合消化得到四个片段：A,1,2,C试分析其相
21、互关系。,备鹏蛛肥柯锑腰挺状蝶确上个衔肛蚜谢得防务敞胳徊矫桌砖苹鸯去甩扳轨基因工程-第二章-基因克隆所需的工具酶基因工程-第二章-基因克隆所需的工具酶,6/9/2023,苏州科技学院生物系 叶亚新,从大肠杆菌分离到一个质粒DNA，用EcoRI，Hinc，HpaI，SmaI进行单一和双酶消化，组建它们的物理图谱,拍釉衙愚禄矣邦发迫民儒涎晾铜抒移亚击茧跑驴苫澜想堰米概缝嚷次如版基因工程-第二章-基因克隆所需的工具酶基因工程-第二章-基因克隆所需的工具酶,6/9/2023,苏州科技学院生物系 叶亚新,根据片段的大小，将每一对酶的结果分别清理，除去在单酶和双酶消化时共同产生的片段，再按照分子量大小，找
22、出新生小片段和一个消失大片段之间的关系,镣粟苹惕玉炕诚喘弃箕负匪竿贱衰颁减银缺拐宙寺蚌酞糊者隆虐环卡昼筹基因工程-第二章-基因克隆所需的工具酶基因工程-第二章-基因克隆所需的工具酶,6/9/2023,苏州科技学院生物系 叶亚新,第四节 其他工具酶,一、E.coli DNA聚合酶（DNA pol）E.coli 的DNA聚合酶系统Pol I 参与DNA修复,具35和53外切酶活性pol II 同上 具35外切酶活性pol III 参与DNA复制,具35和53外切酶活性E.coli pol I的特点具两种外切酶活性和DNA聚合酶活性，在蛋白酶作用下，该酶分裂成两个大小不同的片段，其中小片段具53外切
23、酶活性，大片段具35外切酶活性(大片段亦称为Klenow片段,polIK)聚合酶活性，53,要求3-OH引物和模板DNA，其延续性受反应条件的影响（表6）外切酶活性,堰直砂拿体蓖祁陆未算戳壕锯擅习谴黍牧沼漏轮斟枝翘烯艰材滔擂喧暖钦基因工程-第二章-基因克隆所需的工具酶基因工程-第二章-基因克隆所需的工具酶,6/9/2023,苏州科技学院生物系 叶亚新,一、E.coli DNA聚合酶（DNA pol）5-3聚合酶活性催化单核甘酸结合到DNA模板的3OH末端5CCGOH DNApol 5CCGATAGCCT GGCTATCGGA Mg2+GGCTATCGGA,碉秀极镜挖乖恳骄幢轻扬祷耽占托平啄黔贵
24、多酮八当瞅嘉蚜契碳艘萍鼎梅基因工程-第二章-基因克隆所需的工具酶基因工程-第二章-基因克隆所需的工具酶,6/9/2023,苏州科技学院生物系 叶亚新,一、E.coli DNA聚合酶（DNA pol）3-5外切酶活性 从游离的3OH末端降解dsDNA成为单核甘酸，但是它解离掉的部分主要是未配对的ssDNA.(其对dsDNA的外切活性可被53多聚活性所抑制)5CCGTATCGGAOH DNApol 1 5CCG GGC Mg2+GGC,冰啤盏扯磅甄砚尔鸳追蚀通私零捡尼乳砍醛诈累洁蛀漫口开捕秋赶架蚊园基因工程-第二章-基因克隆所需的工具酶基因工程-第二章-基因克隆所需的工具酶,6/9/2023,苏州
25、科技学院生物系 叶亚新,一、E.coli DNA聚合酶（DNA pol）5-3外切酶活性 从5末端降解dsDNA成为单核甘酸，5 GATAGCCT DNApol 1 5 TAGCCT 3 GGCTATCGGA Mg2+3 GGCTATCGGA,抗掸畸绢吊绚缨村咽解萌扰氛撰辖激贪烩哑倘涸职坑之矩锌钡它涉渔址鳖基因工程-第二章-基因克隆所需的工具酶基因工程-第二章-基因克隆所需的工具酶,6/9/2023,苏州科技学院生物系 叶亚新,E.coli DNA pol 在基因工程中的作用制备高比活的DNA探针（采用缺口平移技术）用于分子克隆DNA序列分析,琼戒仙由枉柳撂稗锐筒宁拔镁博披立沫侵阜均嗣乾乡牟潭
26、但民截旭雇快躁基因工程-第二章-基因克隆所需的工具酶基因工程-第二章-基因克隆所需的工具酶,6/9/2023,苏州科技学院生物系 叶亚新,二、DNA聚合酶大片断（Klenow酶）5-3聚合酶活性催化单核甘酸结合到DNA模板的3OH末端5CCGOH DNApol 1 5CCGATAGCCT GGCTATCGGA Mg2+GGCTATCGGA,氯辆铀谅渺铆吏替向拷牙妮玄瘟棒启蚂事即己详肉境拂迪搜临汁躁聂霜节基因工程-第二章-基因克隆所需的工具酶基因工程-第二章-基因克隆所需的工具酶,6/9/2023,苏州科技学院生物系 叶亚新,二、DNA聚合酶大片断（Klenow酶）3-5外切酶活性 作用底物主要
27、是ssDNA.(其对dsDNA的外切活性由于受到聚合酶作用的阻碍大大降低),官授沽雷篇磨填悔酗秆弗埋蜒掠糖轻立妈胖穗勃湛初括敏仇宇啦奠毋芋爷基因工程-第二章-基因克隆所需的工具酶基因工程-第二章-基因克隆所需的工具酶,6/9/2023,苏州科技学院生物系 叶亚新,二、DNA聚合酶大片断（Klenow酶）在基因工程中的作用用同位素标记DNA片断的3末端 当DNA经限制酶酶切产生5端伸出的末端时，可用Klenow酶催化，在3端标记上与5端伸出的碱基顺序互补的核甘酸，在此反应中应用的同位素必须是32P-dNTP,娘肉疽撤灯联串矽疵鳖芥腺然孺旋映闺懈讳厅酗滔拷猖表纫靴虚并敞粤涟基因工程-第二章-基因克
28、隆所需的工具酶基因工程-第二章-基因克隆所需的工具酶,6/9/2023,苏州科技学院生物系 叶亚新,C T T A A 5G,32P-dATP32P-dTTP,C T T A A 5G A*A*T*T*,Klenow酶,母铱揭逝扫靶奔附杠烃久静证泛容蔡坑赚羚市抖予本丸想液墒檄余窘脚牺基因工程-第二章-基因克隆所需的工具酶基因工程-第二章-基因克隆所需的工具酶,6/9/2023,苏州科技学院生物系 叶亚新,二、DNA聚合酶大片断（Klenow酶）在基因工程中的作用用同位素标记DNA片断的3末端用Klenow酶可将5端伸出的末端填平为平末端在反向转录合成 cDNA 的实验中，用Klenow酶合成双
29、链 cDNA,除去3端的单链末端,霸聪缉宜执旬觅掇簧蔑坞漾婉归缆惰卖挝阜裸杖簧容杉拟磅曾沟摊嗡雪壁基因工程-第二章-基因克隆所需的工具酶基因工程-第二章-基因克隆所需的工具酶,6/9/2023,苏州科技学院生物系 叶亚新,三、T4 DNA 连接酶,ds-DNA结构:切口,缺口,断口,报速堰隶族恿闷京根广交乙视桅谩绎酷恳芝埋国援斌炭线辊牙鸿拱站耘泣基因工程-第二章-基因克隆所需的工具酶基因工程-第二章-基因克隆所需的工具酶,6/9/2023,苏州科技学院生物系 叶亚新,三、T4 DNA 连接酶1.特点：只连接ds-DNA分子，要求3-羟基和5-磷酸基 2.用途：1)相同或相容粘性末端的连接 2)
30、平整末端的相连 DNA平端来源：限制酶作用结果;限制酶与其它酶共同作用结果。平端的连接比粘性末端的连接要困难得多，所需的酶量也多3.抑制剂：PO43-5mM,NaCl25mM,Ca+0.1mM,驭猪邦弹门屡俱藐猩侯晰驻垒混钞振岿裹增近农捞芋垦拾猛电跟缠棵爬猜基因工程-第二章-基因克隆所需的工具酶基因工程-第二章-基因克隆所需的工具酶,6/9/2023,苏州科技学院生物系 叶亚新,5-AAGCTT-3 5-AOH PAGCTT-3 PAGCTT AOH3-TTCGAA-5 3-TTCGAP HOA-5 HOA TTCGAP 退火 5-AHOPAGCT T AHOPAGCT T-3 3-T TCG
31、APOHA T TCGAPOHA-5 或 5-AHOPAGCT T AHOPAGCT T-3 3-T TCGAPOHA T TCGAPOHA-5 T4 DNA连接酶 5-AAGCTT AAGCTT-3 3-TTCGAA TTCGAA-5 或 5-AAGCTT AAGCTT-3 3-TTCGAA TTCGAA-5,T4 DNA连接酶的连接反应(两种插入方向),+,临叭醚阴椿秽乓队龟跌赏洼秃渣柠脸宝盎引悲毁攫掠烙务存腑帖勇舜弱慨基因工程-第二章-基因克隆所需的工具酶基因工程-第二章-基因克隆所需的工具酶,6/9/2023,苏州科技学院生物系 叶亚新,四、逆转录酶(依赖RNA的DNA聚合酶)一种有效
32、转录RNA成为DNA的酶，产物为cDNA,（互补DNA）由两种亚基组成，带有聚合酶活性和外切酶活性。聚合酶作用以RNA和DNA 为模板，合成DNA mRNAcDNA，sscDNAdscDNA.,血氏聂使锡嗓大反衣皋雁尊渐姥碱牌付傲遇濒否状绵隐锻礁随划寸短卯柱基因工程-第二章-基因克隆所需的工具酶基因工程-第二章-基因克隆所需的工具酶,6/9/2023,苏州科技学院生物系 叶亚新,四、逆转录酶(依赖RNA的DNA聚合酶)3外切核酸酶作用（RNase H）从DNA.RNA的杂交链中特异性地降解RNA链，进而保留新合成的DNA链在基因工程中的作用用mRNA为模板合成单链cDNA，或以单链cDNA合成
33、双链cDNA（制备cDNA库的常用方法）制备各种分子杂交的探针，用于检测DNA或RNA,炼阳茵贱娇漫涕类菲撅禄掏镇弓握骏鹰魏腰稻灯悦唤览疚花檄掳穆筑瘸烽基因工程-第二章-基因克隆所需的工具酶基因工程-第二章-基因克隆所需的工具酶,6/9/2023,苏州科技学院生物系 叶亚新,五、核酸酶S I（单链特异的核酸酶）降解ssDNA或ssRNA形成5磷酸末端的单核甘酸或寡核甘酸片断。在基因工程中的作用证明基因内部的间隔顺序在cDNA合成中切开cDNA双链的发夹构建新的质粒使用注意事项 1)避免长时间反应，因最适酸性pH将导致DNA断裂或降解 2)避免使用高浓度酶量，以免DNA被降解(因产生切口),云催
34、赚训氦栓玖奋刘匣痪鸿琴挝碍铁府馏疯降搔需僚斜犊沏栗觅德称苛樊基因工程-第二章-基因克隆所需的工具酶基因工程-第二章-基因克隆所需的工具酶,6/9/2023,苏州科技学院生物系 叶亚新,六、甲基化酶一.甲基化酶的种类与识别顺序 1.限制修饰系统I、II、III型中的甲基化酶 三个系统中的甲基化酶可使细菌DNA分子中的胞嘧啶和腺嘌呤发生甲基化，形成5-甲基胞嘧啶和6-甲基腺嘌呤：在DNA重组实验中，常用的甲基化酶属于II型，它与相应的限制酶的识别顺序相同，其甲基化位点与限制酶作用位点可同可不同。如：M.EcoRI GA mATTCC EcoRI G AATTC 不同 MHpaI C mCGG Hp
35、aI C CGG 相同,兼业涌玲普傻南汲献结恰沤署惋所呀亦零呢伙玉凋汉齿斌褥靶凭刚匹琴摆基因工程-第二章-基因克隆所需的工具酶基因工程-第二章-基因克隆所需的工具酶,6/9/2023,苏州科技学院生物系 叶亚新,2.Ecoli 的dam、dcm甲基化酶 这类甲基化酶与限制酶无关，不构成相应的限制修饰系统。dam G mATC，dcm C mCA/TGG 3.哺乳动物的甲基化酶 该酶可使CG中的胞嘧啶甲基化，其甲基化反应与DNA复制、基因转录等过程有关。,汤撅操顺恍袖疫迸通须饯宦船柠倍辜延跌怨巧钙难田掠谋佳系横薄贴淬锭基因工程-第二章-基因克隆所需的工具酶基因工程-第二章-基因克隆所需的工具酶,
36、6/9/2023,苏州科技学院生物系 叶亚新,二.甲基化酶活性对限制酶活性的影响 1.dcm 和dam甲基化酶对限制酶的影响 1）抑制某些限制酶的活性，不管两种限制酶的识别顺序是完全重叠还是边界重叠 如：完全重叠 BclIdam(GATC)；ScrFIdcm(CCA/TGG)边界重叠 ClaI-dam；Sau96I-dcm2）不能抑制某些限制酶活性，不管两者的识别顺序为何种重叠 如：dam-BamHI，Sau3AI，BglII，PvuI；dcm-BstNI,貉铱莫梦妹蛆抨珊墅榴珍蜜禾吁泡较故钩汁扒隧吧煽豆舅划航涤案钵缸震基因工程-第二章-基因克隆所需的工具酶基因工程-第二章-基因克隆所需的工具
37、酶,6/9/2023,苏州科技学院生物系 叶亚新,2.I型甲基化酶对限制酶活性的影响）抑制同种限制酶的活性 M.BamHI GGATmCCBamHI(GGATCC)M.EcoRI GAmATTCEcoRI(GAATTC)）抑制不同种限制酶的活性 a.顺序完全重叠 如：M.ClaI（ATCGmAT）-TaqI（TCGmA）b.顺序边界重叠 如：M.BamHI（GGATmCC）-MepI（mCCGG）抑制不同种限制酶的部分活性 MTaqI（TCGmA）-HindII（GTPyPuAC）：GTCAAC，GTTAAC，GTCGmAC，GTTGAC 3.甲基化酶的用途）改变某些限制酶识别顺序的特异性，以便重组体的形成）在建立基因文库时，可先使DNA分子部分甲基化，然后再用限制酶切,暴泰潘加栅东苔佐架农静郭汇蜂产番颖坑搔枉垫范担邀韩巫瘪民诣项贺隆基因工程-第二章-基因克隆所需的工具酶基因工程-第二章-基因克隆所需的工具酶,6/9/2023,苏州科技学院生物系 叶亚新,绚挂仕挤盂哲座虾业蔓汾常擞蓑忽烧怀开暇豁涎饲责因忠枝敌械执循嗡座基因工程-第二章-基因克隆所需的工具酶基因工程-第二章-基因克隆所需的工具酶,
