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1、微生物实验培训,内容一、微生物无菌操作技术；二、微生物分离、培养、菌落计数三、显微镜直接计数四、微生物中常用的几种染色技术,一、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 培养基配制 消毒灭菌 土样稀释 平板划线 涂布平板 菌落计数二、染色技术 芽孢染色、革兰氏染色三、显微镜直接计数,一、培养基六要素：碳源、氮源、能源、无机盐、生长因子、水根据实验需要选用、设计最适合微生物生长的培养基。加富性的选择培养基（投其所好），固体培养基1、选择培养基配方：,水：1000ml,第一专题 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数,培养基的氮源为尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。缺乏脲酶的微生物由于不
2、能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。,怎样证明此培养基具有选择性呢？,以尿素为唯一氮源的培养基,胨牛肉膏蛋白培养基,是,分离尿素细菌,判断该培养基有无选择性,只生长尿素细菌,生长多种微生物,2、牛肉膏蛋白胨琼脂培养基配方,（用于分离和培养细菌，是一种天然培养基）配方如下：牛肉膏 3g 蛋白胨 10g 氯化钠 5g 琼脂 20g 自来水 1000mL pH 7.47.6,3、步骤：称量：按照配方正确称取各种原料放于搪瓷杯中。溶化：在搪瓷杯中加入所需水量，玻棒搅匀，加热溶解。调pH值：用 NaOH或HCl调pH，用pH试纸对照。加琼脂溶化
3、：加热过程中要不断搅拌，可适当补水。分装：注意不要污染棉塞。包扎成捆，挂上标签,注明何种培养基。灭菌备用：培养基灭菌后必须在370C下恒温培养24h，确定无菌生长，方可使用。,二、消毒灭菌消毒：使用理化因素方法杀死物体表面绝大多数微生物的方法。灭菌：采用强烈的理化方法杀死物体内外所有微生物的方法。干热灭菌法：电热烘箱作为干热灭菌器高压蒸汽灭菌1.构造：（1）锅体：一般以2KW电热管作内热源，直接浸在锅内水中，通电后产生蒸汽。另附有支架，以承受内锅体。（2）内锅：由铝楹嵌接而成，用于承放待灭物品。底附有活动的栅格板，以防回流冷凝水将物品弄湿。其边上还有一用于插排气管的槽。（3）锅盖：上有木把手、
4、安全阀、放气阀、压力表（4）其它：橡皮垫圈、旋钮等,高压蒸汽灭菌法其步骤如下：1.灭菌器内加入一定量的水，将包扎好的物品放入其中。2.接通电源，进行加热3.排除高压锅内的冷空气，可将排气阀打开，待排出大气后关闭排气阀；或关闭排气阀，待压力上升到0.5kg/cm2时再打开排气阀，待压力回复到0时再关闭排气阀。,4.当压力达1.05kg/cm2时，此时灭菌器内的温度为1210C，维持30min。对热不稳定的培养基如含有葡萄糖、氨基酸等物时，应适当降低压力，延长时间。5.灭菌时间一到，切断电源，待压力降至零时，才能打开排气阀，然后打开灭菌器盖，取出物品。,间歇灭菌法：待灭菌的物品放在灭菌器或蒸笼里，
5、每天蒸煮1次，每次煮沸1h，连续3d重复进行。在每两次蒸煮之间，将物品（指培养基）放在370C恒温条件下培养过夜，这样可以使每次蒸煮后未杀死残留的芽孢萌发成营养体，以便下次蒸煮时杀灭。过滤除菌法：不能用加热灭菌的液体物质（如维生素、血清），一般可用细菌过滤器进行除菌。,紫外线灭菌法：一般30W灯管，9m3空间，距地面2m每次打开紫外线照射0.5h，就使室内空气灭菌。若照射紫外线时先喷洒石炭酸等化学消毒剂，可增强灭菌效果。紫外线虽有较强的杀菌力，但穿透力弱，即使一薄层玻璃或水层就能将大部分紫外线滤除，因此只适用于空气及表面杀菌。,前面配制的牛肉膏蛋白胨、尿素选择性培养基包扎、灭菌。每组包扎平板2
6、包，5个/包；包扎1ml吸管5根；1瓶加玻珠无菌水45ml；9ml无菌水试管6根；,三、分离与菌落计数1、稀释涂布平板法（1）倒平板在无菌培养皿底部注明分离菌名、稀释度、组别、班级。（2）制备土壤稀释液（3）涂布（4）培养（5）挑菌落,如果得到了2个或2个以上菌落数目在30300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确，需要重新实验。,2、平板菌落计数同一稀释度重复平板不能少于3个，重复平板数多使统计数据更准确。同时10-6,10-7每个稀释度计算出的每克土样中所含菌落形成的单位数也不应相差太大。,计算公式：,每克样品中的
7、菌株数=（CV）M,平板划线法,接种方法：常用的有斜面接种法、平板接种法、液体接种法、试管深层固体培养基的穿刺接种法。接种工具：常用的有接种针、接种环、接种钩、接种圈、接种铲或接种锄、玻璃涂棒等,第二专题 微生物的显微直接计数法,目的：了解血球计数板的构造、计数原理和计数方法，掌握显微镜下直接计数的技能。原理：测定微生物细胞数量的方法很多，通常采用的有显微直接计数法和平板计数法。显微计数法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液，如有杂菌或杂质，常不易分辨。菌体较大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球计数板，一般细菌则采用彼得罗夫霍泽（PetrofHausser）细菌计数板。,两种计数板的原理和部件相同，
8、只是细菌计数板较薄，可以使用油镜观察。而血球计数板较厚，不能使用油镜，计数板下部的细菌不易看清。血球计数板是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有4条槽而构成3个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个计数区，计数区的刻度有两种：一种是计数区分为16个大方格（大方格用三线隔开），而每个大方格又分成25个小方格；另一种是一个计数区分成25个大方格（大方格之间用双线分开），而每个大方格又分成16个小方格。但是不管计数区是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即计数区都由400个小方格组成。,图1 血球计数板,计数区边长为1mm，则计数区的面积为lmm2，每个小方格的面积为1/
9、400mm2。盖上盖玻片后，计数区的高度为0.1mm，所以每个计数区的体积为0.1mm3（10-4ml）。使用血球计数板计数时，先要测定每个小方格中微生物的数量，再换算成每毫升菌液（或每克样品）中微生物细胞的数量。实验步骤1镜检计数室：加样前，将血球计数板及盖玻片用擦镜纸或绸布擦干净后，先对计数板的计数室进行镜检，若有污物需要清洗，干燥后使用。,2视待测菌液浓度，加无菌水适当稀释，以每小格的菌数可数（以每中格10-20个酵母菌为宜）。3把盖玻片盖在计数板的刻度上，以玻棒（或滴管）沾取巳稀释的酵母茵悬液，从盖玻片的一端注入，使菌液沿两玻片间渗入（勿使菌液流到两边平台上，否则使盏玻片抬高），并用吸
10、水纸 吸干沟槽中流出的多余菌液。血球计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜进行计数,4计数方法：1625规格的计数板，需计数左上、右上、左下、右下4个中格（共100个小格）的酵母菌。25（中格）16（小格）规格的计数板，除计数左上、右上、左下、右下4个中格外还需加数中央的一个中格（共80个小格，5个中方格）的酵母菌。5.计算公式：五个中方格中总菌数为A，菌液稀释倍数为B，酵母菌细胞数/ml=A16l04B(1625规格的计数板)酵母菌细胞数ml=A25l04B(2516规格的计数板),5,5,计数原则：位于格线上的菌体一般只数上方和右边线上的。如遇酵母出芽，芽体
11、大小达到母细胞的一半时，即作两个菌体计数。使用完毕后，将血球计数板在水笼头上用水柱冲洗，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹风机吹干。镜检，观察每小格内是否有残留菌体或其他沉淀物。若不干净，则必须重复洗涤至干净为止。,芽孢染色,无菌操作微生物涂片掌握细菌的芽孢染色（枯草杆菌）熟炼显微镜使用,细菌的芽孢染色原理细菌的芽孢具有厚而致密的壁，透性低，不易着色，若用一般染色法只能使菌体着色而芽孢不着色（芽孢呈无色透明状）。芽孢染色法就是根据芽孢既难以染色而一旦染上色后又难以脱色这一特点而设计的。所有的芽孢染色法都基于同一个原则：除了用着色力强的染料外，还需要加热，以促进芽孢着色。当染芽孢时，菌体也会着
12、色，然后水洗，芽孢染上的颜色难以渗出，而菌体会脱色。然后用对比度强的染料对菌体复染，使菌体和芽孢呈现出不同的颜色，因而能更明显地衬托出芽孢，便于观察。,涂片,干燥,固定,芽孢染色的方法和步骤1.涂片、干燥、固定：待涂片晾干后在酒精灯火焰上通过23次。2.染色：加染色液：加5%孔雀绿水溶液于涂片处（染料以铺满涂片为度），然后将涂片放在铜板上（用镊子夹住载玻片），用酒精灯火焰加热至染液冒蒸汽时开始计算时间，约维持5-10min。加热过程中要随时添加染色液，切勿让标本干涸。（加热时温度不能太高）。水洗：待玻片冷却后，用水轻轻地冲洗，直至流出的水中无染色液为止。,复染：用蕃红液染色1-2min。3.水
13、洗、晾干或吸干。4.镜检：观察：芽孢（菌体）颜色、形状、着生位置、芽孢囊特征等。,革兰氏染色,革兰氏染色法 是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。革兰氏染色法是细菌学上最常用的鉴别染色法，因为通过此法染色，可将细菌鉴别为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-）两大类。,？,1,2,3,4,结晶紫碘液酒精复红,革兰氏染色的机理：主要由于两类细菌的细胞壁成分和结构不同。,制片初染（结晶紫1min）水洗媒染（碘液1min）水洗脱色（乙醇20-30s）水洗复染（番红2min）水洗干燥观察,革兰氏阳性杆菌,革兰氏阴性杆菌,实验结束后的处理将浸过油的镜头按下述方法擦拭干净：a.先用擦镜纸将油镜
14、头上的油擦去。b.用擦镜纸沾少许乙醚-乙醇混合液将镜头擦2-3次。c.再用干净的擦镜纸将镜头擦2-3次。注意擦镜头时向一个方向擦拭。将显微镜小心轻拿，按号放入显微镜柜中。观察后的染色玻片用废纸将香柏油擦干净，放入回收容器内。,注意：涂片不宜过厚，以免脱色不完全，造成假阳性。乙醇脱色时间要适宜。否则，脱色不足，阴性菌被误染为阳性菌；脱色过度，阳性菌被误染为阴性菌。菌龄：应选择活跃生长期的幼培养物作革兰氏染色。培养时间过长，或死亡及部分自溶，改变了细菌细胞壁的通透性，造成阳性菌的假阴性反应。火焰固定不宜过热媒染剂的作用：媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或吸附力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使之不易脱落。,谢谢，欢迎大家批评指正！,
