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1、山西生物应用职业技术学院,山西生物应用职业技术学院 山西生物应用职业技术学院,山西生物应用职业技术学院 山西生物应用职业技术学院,山西生物应用职业技术学院 山西生物应用职业技术学院,山西生物应用职业技术学院,中药化学实用技术,学习情景二,中药中黄酮(Flavonoid)类化学成分的提取分离技术,学习情境二 中药中黄酮类化学成份的提取分离技术,熟练进行黄芩、葛根、银杏叶中黄酮的提取分离操作；能进行补骨脂、槐花中黄酮的提取分离操作。,教学内容,黄芩中黄酮化合物的提取分离技术,黄芩中黄酮化合物的提取分离及检识,学习提示,黄酮的理化性质及检识,黄酮类化学成分的提取分离,黄酮的结构与分类,主要的天然黄酮
2、类化合物分为以下几类（见下页）,芹菜素(5，7，4三羟基黄酮),木犀草素(5，7，34-四羟基黄酮),杨梅素(3，5，7，345-六羟基黄酮),橙皮苷,葛根素(C-苷),山山柰酚(3，5，7，4-四羟基黄酮),杜鹃素,R=H 大豆素=glc 大豆苷,芸香糖,常见黄酮类化合物结构式,黄酮苷,碱性,物理性状,溶解性,还原反应,酸碱性,显色反应,游离黄酮,金属盐类试剂的络合反应,硼酸显色反应,酸性,二 黄酮类化合物的理化性质及检识,多呈黄色，且颜色与分子中的交叉共轭体系(发色团)及助色团有关,黄酮苷均有旋光性，且多为左旋。游离的二氢黄酮、二氢黄酮醇、二氢异黄酮和黄烷醇等具有旋光性。其余的游离黄酮则无
3、旋光性,在紫外灯光下普遍具有荧光,交叉共轭体系的存在:能形成交叉共轭体系的黄酮类化合物，常有明显的黄色，并且共轭程度大小、共轭链的长短决定了颜色的深浅。黄酮本身其色原酮部分并无颜色，但当2位引入苯基后，即形成交叉共轭体系，且能通过电子的转移和重排使共轭链连续地延长，而呈现出颜色。,助色团对颜色的影响：助色团（-OH、-OCH3等）能使颜色加深，但主要指助色团处于7或4位时，由于能形成p-共轭，可促使电子的转移和重排而形成交叉共轭体系，从而使颜色明显加深，但-OH、-OCH3引入其他位置时，对颜色的影响较小。,有颜色 交叉共轭体系 无颜色,2.溶解性,游离黄酮 一般难溶或不溶于水，易溶于甲醇、乙
4、醇、氯仿、乙醚等有机溶剂及稀碱液中。花色苷元（花青素）类以离子形式存在，水溶度较大。黄酮类甙元分子中羟基数越多，水中的溶解度越大。,黄酮苷 游离黄酮的羟基被糖苷化后，水溶性增加，脂溶性降低，一般易溶于热水、甲醇、乙醇、吡啶及稀碱溶液中，而难溶于苯、乙醚、氯仿、石油醚等有机溶剂中。,游离黄酮 水 甲醇乙醇 乙酸乙酯 氯仿 乙醚 稀碱水-+（酚羟基)溶解性取决于 分子的立体结构 取代基团的性质、数目、连接位置 引入羟基，数目多，7、4-位，水溶度较大 羟基甲基化（-OCH3）,水溶度降低 R=H 平面型分子 非平面型分子 黄酮 二氢类（C-环半椅式结构）黄酮醇 异黄酮（羰基与B-环立体障碍）查耳酮
5、 分子间排列不紧密，（交叉共轭）水分子易于进入 水溶度小 水溶度大,R=H 二氢黄酮,R=OH 二氢黄酮醇,水 甲醇乙醇 乙酸乙酯 氯仿 乙醚 稀碱+-+,黄酮类化合物溶解性（极性）规律:三糖苷 双糖苷 单糖苷 苷元3-O-糖苷 7-O-糖苷（平面性分子）花色素(平面性分子,离子型)非平面性分子 平面性分子,黄酮苷(亲水性),3.酸碱性,3.酸碱性,碱性:因母核中-吡喃酮环上的1位氧原子有未共用电子对，故表现出微弱的碱性。可溶于浓硫酸、浓盐酸等强无机酸生成 盐，该盐极不稳定，加水后即分解。,还原反应,4.显色反应,反应类型 鉴别特征 鉴别意义 备注盐酸-镁粉 黄酮、二氢黄酮、红紫红 黄酮类特征
6、性 假阳性 反应 黄酮醇、二氢黄酮醇 红紫红 鉴别反应（花色素）（最常用）查耳酮、橙酮（-）儿茶素类、异黄酮（-）,四氢硼钠 二氢黄酮、二氢黄酮醇 红紫红 二氢黄酮类特有 还原反应 其它黄酮类（-）,钠汞齐反应 黄酮、二氢黄酮 红 异黄酮、二氢异黄酮 红 黄酮醇类 黄淡红色 二氢黄酮醇类 棕黄色,金属盐类试剂的络合反应,反应类型 鉴别特征及鉴别意义 备 注,锆盐 枸橼酸 锆盐-枸橼酸 3-OH或5-二OH 黄色 黄色不褪 PPC 黄色褪去,氨性氯化锶(SrCl2)邻二酚羟基 绿、棕乃至黑色 三氯化铁(FeCl3)酚羟基 紫、蓝、绿,三氯化铝 3-OH，4-C=O 黄色（AlCl3）5-OH，4
7、-C=O 鲜黄色荧光 PPCTLC 邻二酚羟基（4或7，4黄酮醇，天蓝色荧光）,硼酸显色反应,硼酸 5-羟基，4-羰基黄酮 黄色，绿色荧光（草酸液）,（H3BO3）6-羟基，4-羰基查耳酮 黄色，无荧光（枸橼酸）,三 黄酮的提取与分离,黄酮的提取与分离,提取,分离,pH梯度萃取法,溶剂萃取法,柱色谱法,HPLC色谱法,溶剂提取法,检识,理化检识,色谱检识,（一）提取方法溶剂法,溶剂法 关键 溶剂的选择 选择依据 黄酮类成分的存在状态（游离、苷）及溶解性,溶剂的溶解性能 提取方法（煎煮法、渗漉法、回流法等）的选择,溶剂 提取原理 游离黄酮 黄酮苷 备 注,乙醇 溶解范围广+（甲醇）苷、苷元均可溶
8、（9095%）(60%）甲醇毒性大,沸水 多糖苷易于水+成本低、安全,水溶性杂质多,碱性水或 稀氢氧化钠溶出能力强,碱性乙醇 酚羟基的酸性+石灰水除杂质效果好,HPLC色谱,（二）分离,分离依据：成分(黄酮与杂质、苷与苷元、苷元与苷元)之间的极性（分配系数K）差异。,分离依据：游离黄酮类化合物的酸性差异。,pH梯度萃取法,溶剂萃取法,柱色谱法,常用聚酰胺和硅胶色谱。（1）聚酰胺柱色谱（首选法）洗脱顺序（含水溶剂：乙醇-水等）苷元相同：叁糖苷双糖苷单糖苷苷元（酚羟基比例）母核上羟基越多，洗脱越慢（酚羟基数量）酚羟基数量相同：邻羟基的对（间）羟基的（酚羟基的位置）芳香核、共轭双键越多，洗脱越慢（酚
9、羟基所处母核的共轭程度）不同苷元：异黄酮二氢黄酮醇黄酮黄酮醇 母核共轭程度较后两者小，后者比前者多一个羟基。（2）硅胶柱色谱 洗脱顺序：羟基越多，极性越大，越后洗出（不分醇羟基、酚羟基）,适用于各种黄酮类化合物的分离。原理：反相柱色谱（黄酮类化合物极性大）固定相：ODS流动相：水-乙晴不同比例。,任务一 黄芩中黄酮类化合物的提取分离技术,学习目标,一,三,任务导入,必备知识,五,四,六,相关知识链接及拓展,课堂互动,目标测试,一 学习目标,2,掌握黄芩中黄酮类化合物的提取、分离及鉴定技术。熟悉黄芩中黄酮类化合物的结构及性质。了解黄芩中黄酮类化合物的存在及生物活性。,知识要求,熟练进行黄芩中黄酮
10、类化合物的提取、分离及鉴定操作。学会黄芩中黄酮类化合物的色谱鉴定技术。,学习目的,任务导入：,黄芩为唇形科植物黄芩（Scutellaria baicalensis Georgi）的干燥根。从其中分离出的黄酮类化合物有黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷、汉黄芩素、木蝴蝶素等20多种。其中黄芩苷（4.0%5.2%）是主要有效成分，有抗菌消炎、降低转氨酶等作用。黄芩苷元的磷酸酯钠盐可用于治疗过敏、哮喘等疾病。,黄芩中黄芩苷的提取工艺流程：黄芩苷分子中有羧基，酸性较强，在植物体内多与镁离子成盐，且黄芩苷的镁盐水溶性较大，故可用水为溶剂提取。水提取液酸化后，该镁盐又转化为有游离羧基的黄芩苷，因其难溶于酸水而沉淀析
11、出。黄芩苷的提取分离流程如下：,（二）黄芩中黄酮类成分的提取分离,（一）黄芩中黄酮类主要有效成分及结构,三 必备知识,黄芩苷（baicalin）黄芩素（baicalein）汉黄芩苷（wogonoside）汉黄芩素（wogonin）,（一）黄芩中黄酮类主要效成分及结构,黄芩中黄芩苷为主要有效成分，黄芩苷为淡黄色针晶，熔点223，几乎不溶于水，难溶于甲醇、乙醇、丙酮，可溶于热乙酸，易溶于碱性溶液。黄芩苷经水解能生成苷元黄芩素，黄芩素分子中具有邻三酚羟基，易被氧化为醌类衍生物而显绿色。这是黄芩在放置过程中或处理不当时易变绿的原因。,（二）黄芩中黄酮类化合物的提取分离,黄芩中黄酮类化合物的分离 方法一
12、：,方法二：,（二）黄芩中黄酮类化合物的提取分离,四 知识链接及拓展,苷（glycosides）又称糖苷、甙或配糖体，是糖及其衍生物的端基碳原子与另一非糖物质（称为苷元或配基）连接而成的化合物。苷糖与苷元连接的化学键称为苷键，形成苷键的原子称为苷键原子。苷类在中药中分布很广泛，且具有多方面的生物活性，是一类重要的中药化学成分。,按照苷键原子进行分类,硫苷,红景天苷（醇苷）,苦杏仁苷（氰苷）,山慈姑苷（酯苷）,天麻苷（酚苷）,萝卜苷,巴豆苷 虫草苷,芦荟苷,四 知识链接及拓展,结晶与重结晶的基本原理 结晶与重结晶法是利用混合物中各成分在不同温度溶剂中溶解度的不同来达到分离的方法。结晶溶剂的选择
13、合适的溶剂就是在冷时对所要的成分溶解度小，而热时溶解度又较大的溶剂。溶剂的沸点亦不易太高。一般常用甲醇、丙酮、氯仿、乙醇、乙酸乙酯等。结晶溶剂又常会用到混合溶剂。,结晶的操作技术（一）结晶分离技术的一般操作过程1将需结晶物质置于锥形瓶中，加入较需要量略少的溶剂，于水浴上加热至微沸；2将热溶液趁热抽滤，以除去不溶的杂质；3将滤液冷却，使结晶析出；4滤出结晶，必要时用适宜的溶剂洗涤结晶。（二）结晶条件的控制1趁热过滤得到的滤液应长时间静置，逐渐冷却，避免温度骤降使析晶过快带出杂质。2若滤液久置无结晶析出，可采取的方法有：松动瓶塞；加入少量晶种；玻璃棒摩擦；加有机可溶性盐类盐析。,五 课 堂 互 动
14、,1聚酰胺柱色谱用于分离黄酮类化合物（苷、苷元）的原理、方法及洗脱规律。2简述黄酮类化合物的酸性规律及在黄酮苷元分离中的应用。3何谓交叉共轭体系，它与黄酮类化合物颜色的关系如何？,任务二 葛根中黄酮类化合物的提取分离技术,学习目标,一,三,任务导入,必备知识,五,四,六,相关知识链接及拓展,课堂互动,目标测试,一 学习目标,2,掌握葛根大豆苷元的提取、分离及鉴定技术。熟悉葛根中黄酮类化合物的结构及性质。氧化铝柱色谱的原理及操作。了解葛根中黄酮类化合物的存在及生物活性。,知识要求,熟练进行葛根中黄酮类化合物的提取、分离及鉴定操作。学会葛根中黄酮类化合物的色谱鉴定技术。,学习目的,任务导入：,葛根
15、为豆科植物野葛(Pueraria lobata(Willd.)Ohwi)或甘葛藤(Pueraria thomsonii Benth.)的干燥根，甘葛藤习称“粉葛”。具有解肌退热，生津，透疹，升阳止泻的作用。用于治疗外感发热头痛、高血压颈项强痛、冠心病心绞痛、早期突发性耳聋、强直性脊柱炎、泄泻等病症。现代医学研究表明：葛根中的异黄酮类化合物葛根素对高血压、高血脂、高血糖和心脑血管疾病有一定疗效。,葛根中大豆苷元、葛根素等的提取工艺流程：,流程说明：用70的乙醇回流提取葛根粗粉，使黄酮类化合物溶于乙醇液，然后采用铅盐沉淀法除去醇提液中的杂质，得到纯化的葛根总黄酮类化合物。总黄酮再通过氧化铝柱色谱进
16、行分离。最终得到各种异黄酮。,（二）葛根中黄酮类成分的提取分离,（一）葛根中黄酮类主要有效成分及结构,三 必备知识,（一）葛根中黄酮类主要效成分及结构,葛根中主要含异黄酮类化合物，如葛根素（C-苷）、大豆素、大豆苷等。大豆苷为无色针晶，熔点239240，易溶于乙醇、热水。大豆素为无色针晶，265升华，320分解，易溶于乙醇。葛根素为白色针状结晶，熔点187（分解），易溶于乙醇。,（二）葛根中黄酮类化合物的提取分离,葛根中黄酮类化合物的分离 方法一：,（二）葛根中黄酮类化合物的提取分离,方法二：,四 课 堂 互 动,1葛根素、大豆苷都是葡萄糖苷，试从结构上分析二者不同在哪里？2试分析大豆素、大豆
17、苷、葛根素在氧化铝色谱柱先后被洗脱出的原因。,任务三 银杏叶中黄酮类化合物的提取分离技术,学习目标,一,三,任务导入,必备知识,五,四,六,相关知识链接及拓展,课堂互动,目标测试,一 学习目标,2,掌握银杏叶中黄酮类成分的提取、分离及鉴定技术。熟悉银杏叶中黄酮类化合物的结构及性质。了解银杏叶中黄酮类化合物的存在及生物活性。,知识要求,熟练进行银杏叶中黄酮类化合物的提取、分离及鉴定操作。学会银杏叶中黄酮类化合物的色谱鉴定技术。,学习目的,任务导入：,银杏叶为银杏科植物银杏Ginkgo biloba L.的干燥叶。具有敛肺平喘、活血化瘀、止痛的作用。用于治疗肺虚咳喘、冠心病、心绞痛、高血脂症等。,
18、银杏中总黄酮的提取工艺流程：,流程说明：用70的乙醇提取银杏叶粗粉，使黄酮类化合物溶于醇液。提取液浓缩后加水，可沉淀水不溶性杂质，滤液上大孔吸附树脂，除去水溶性杂质。,（二）银杏中黄酮类成分的提取分离,（一）银杏中黄酮类主要有效成分及结构,三 必备知识,（一）银杏中黄酮类主要效成分及结构,银杏叶成分很复杂，以黄酮类化合物为主。主要有黄酮类化合物、二萜内酯衍生物，此外还含多糖类。银杏叶中黄酮类化合物既有单黄酮如山奈素、槲皮素、异鼠李素及其苷，亦有双黄酮类如银杏双黄酮（银杏素）、去甲银杏双黄酮、金松双黄酮、穗花杉双黄酮等以及儿茶素类。,（二）银杏中黄酮类化合物的提取分离,银杏中黄酮类化合物的提取还
19、可采用以下方法：方法一丙酮提取法,（二）银杏中黄酮类化合物的提取分离,方法二乙醇提取法,四 课 堂 互 动,1分析银杏叶中黄酮类化学成分在提取工艺中通过何种方式除去水溶性杂质。,任务四 槐米中黄酮类化合物的提取分离技术,学习目标,一,三,任务导入,必备知识,五,四,六,相关知识链接及拓展,课堂互动,目标测试,一 学习目标,2,掌握槐米芸香苷的提取、分离及鉴定技术。熟悉槐米中黄酮类化合物的结构及性质。了解槐米中黄酮类化合物的提取分离新进展。,知识要求,熟练进行槐米中黄酮类化合物的提取、分离及鉴定操作。学会槐米中黄酮类化合物的色谱鉴定技术。,学习目的,任务导入：,槐米为豆科植物槐（Sophora
20、japonica L.）的花蕾。其主要有效成分为芸香苷（又称芦丁），有维生素P样作用，能保持和恢复毛细血管的正常弹性，临床上常作为治疗高血压的辅助药和毛细血管脆性所致出血的止血药。近代研究显示槐米中芸香苷的含量可高达23.5%，但花开放后含量可降低至13%。,槐米中芸香苷的提取工艺流程：芸香苷为淡黄色的粉末或细微针状结晶，常含3分子结晶水，加热至185以上熔融继而分解。在冷水中溶解度为1:10000，沸水中 1:200，冷乙醇中1:650，沸乙醇中1:60，可溶于乙醇、丙酮、乙酸乙酯、吡啶和碱性溶液中，不溶于石油醚、苯、氯仿及乙醚中。,流程说明：本流程利用芸香苷溶于碱水，酸化后又可析出的性质进
21、行提取。芸香苷分子中因含有邻二酚羟基，性质不太稳定，暴露在空气中能缓缓氧化变为暗褐色，在碱性条件下更容易被氧化分解。硼酸盐能与邻二酚羟基结合，达到保护的目的，故在碱性溶液中加热提取芸香苷时，往往加入少量硼砂。,（二）槐米中黄酮类成分的提取分离,（一）槐米中黄酮类主要有效成分及结构,三 必备知识,（一）槐米中黄酮类主要效成分及结构,槐米中主要有效成分为芸香苷，还含有少量皂苷、多糖、粘液质等。2005年版中国药典规定，于60干燥6小时，含芸香苷不得少于20%。当花蕾开放后芸香苷的含量大大降低。芸香苷是槐米中止血的有效成分，有Vp样作用，有助于保持和恢复毛细血管正常弹性，临床上用作高血压的辅助药及毛
22、细血管脆性引起出血的止血药。芸香苷又称芦丁，其苷元为槲皮素，它们的结构式如下：,槲皮素 黄色针状结晶（稀乙醇），含2分子结晶水，熔点为314（分解），溶于乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯、吡啶与冰醋酸等，不溶于水、苯、石油醚、乙醚与氯仿等。,芸香苷 浅黄色粉末或细针晶，常含三分子结晶水，熔点176178，在冷水中溶解度为1：8000，热水为1：200，冷乙醇为1：650，热乙醇为1：60，可溶于吡啶及碱性溶液，几乎不溶于苯、乙醚、氯仿及石油醚中。,（二）槐米中黄酮类化合物的提取分离,槐米中芸香苷的提取分离 方法一：,（二）槐米中黄酮类化合物的提取分离,方法二：,四 知识链接,碱溶酸沉法提取芸香苷注意
23、事项 芸香苷分子中因含有邻二酚羟基，性质不太稳定，暴露在空气中能缓缓氧化变为暗褐色，在碱性条件下更容易被氧化分解。硼酸盐能与邻二酚羟基结合，达到保护的目的，故在碱性溶液中加热提取芸香苷时，往往加入少量硼砂。用碱溶酸沉法提取纯化时，所用碱液浓度不宜过高，以免在强碱性和加热下，破坏黄酮母核；加酸酸化时，酸性也不宜太强，以免生成盐致使析出的黄酮类化合物又重新溶解，降低收得率。,五 课 堂 互 动,1依据芸香苷溶解度的性质，说明水提取精制之的原理。2用前面所学的知识，说明用“碱溶酸沉法”从槐米中提取芸香苷的原理及注意事项。,学 习 小 结,黄酮类化合物,提取分离,提取、分离,结构测定,理化性质,物理性
24、状、溶解性、酸碱性、显色反应,结构类型,按不同的苷元与糖分类,应用实例,紫外、红外、核磁、质谱,黄芩、葛根、银杏叶、槐花,（一）学习内容,（二）学习方法与体会,进行本章的学习时应遵循“结构性质”的认知规律，通过分析黄酮类化合物的结构特点，总结出该类成分的理化性质，进而分析其提取分离。,六 目 标 检 测,一、判断题（）1.黄酮类化合物加ZrOCl2试剂产生黄色，加枸橼酸后黄色不褪，示3位无-OH。（）2.多数黄酮苷元具有旋光性，而黄酮苷则无。（）3.凡是黄类化合物都不能用氧化铝分离。（）4.区别黄酮和黄酮醇可用四氢硼钠反应。（）5.黄酮分子中引入7或4-羟基，促使电子位移重排，使颜色加深。（）
25、6.顾名思义，黄酮类化合物都是黄色的并具有酮基。（）7.一般常用聚酰胺色谱来分离黄酮类化合物。（）8.用葡聚糖凝胶柱色谱分离游离黄酮主要靠分子筛作用，并按分子量由大到小的顺序流出柱体。,六 目 标 检 测,二、A型题 1.聚酰胺对黄酮类化合物发生最强吸附作用时，应在_中。（A.甲酰胺 B.水 C.95乙醇 D.酸水）2.盐酸-镁粉反应为阳性的是_。（A.黄酮醇 B.异黄酮 C.查耳酮 D.橙酮）3.四氢硼钠反应为阳性的是_。（A.黄酮醇 B.异黄酮 C.二氢黄酮 D.橙酮）4.在黄酮类化合物甲醇溶液中加入甲醇钠诊断试剂，所得紫外光谱与其甲醇溶液紫外光谱比较，带红移了4060nm，且强度不变，这
26、说明结构中_。（A.有4-OH,无3-OH B.有4-OH和3-OH C.有4-OH D.无4-OH）5.紫外光谱中，用来判断黄酮类化合物7-OH的诊断试剂是_。（A.甲醇钠 B.醋酸钠 C.三氯化铝 D.醋酸钠/硼酸）,六 目 标 检 测,三、X型题 1.黄酮类化合物的分类主要依据其母核_。（A.三碳链是否成环 B.三碳链的氧化程度 C.B环的连接位置 D.是否连接糖链）2.具有旋光性的游离黄酮有_。（A.黄酮 B.异黄酮 C.黄烷醇 D.二氢黄酮）3.中药槐米的主要有效成分_。（A.芦丁 B.可用水进行重结晶 C.可用碱溶酸沉法提取 D.能发生Molish反应）4.分离黄酮类化合物常用的方
27、法有_。（A.，水蒸气蒸馏法 B.聚酰胺色谱法 C.硅胶色谱法 D.葡聚糖凝胶色谱法）5.5，7，3，4-四羟基二氢黄酮可发生下列反应中的_。（A.HClMg反应 B.四氢硼钠反应 C.氨性氯化锶反应 D.Molish反应）,六 目 标 检 测,三、X型题,6.芦丁可发生下列反应中的_。（A.盐酸-镁粉反应 B.四氢硼钠反应 C.氨性氯化锶反应 D.Molish反应）7.能溶于5Na2CO3 溶液的黄酮可能具有_。（A.3-OH B.5-OH C.7-OH D.4-OH）8.确定黄酮类化合物具有5-OH的方法有_。（A.锆盐-枸橼酸反应 B.硼酸反应 C.氢谱中5-0H的化学位移 D.紫外光谱法，加三氯化铝/盐酸）9.紫外光谱法中，用来判断黄酮（醇）有无邻二酚羟基的诊断试剂是_。（A.甲醇钠 B.醋酸钠 C.三氯化铝/盐酸 D.醋酸钠/硼酸）,六 目 标 检 测,四、用化学方法鉴别下列各组化合物,
