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1、第二章中药制剂分析中供试品的制备,学习目标,掌握样品预处理的步骤以及每一步骤常用的方法结合化学成分理化性质、分析目的和制剂背景等因素合理设计供试品制备的步骤和方法,第一节 样品预处理原则和常用预处理方法,一、样品预处理的原则 消除干扰因素 尽可能完整保留待测组分，避免待测组分在预处理过程中丢失 防止污染 使被测组分浓缩 便于成批处理试样，提高分析结果的准确度和精密度,HOW,在设计或执行某一个预处理步骤时需要考虑的问题：理化性质；化学组成；干扰物类型；样品组分处理过程中稳定性；样品在收集、储存和预处理过程中容器的污染；适合分析仪器的样品的最终使用的溶剂；预处理过程尽量简单，有尽可能高地精密度和
2、准确度；预处理的最后一步应使被测组分富集。,二、常用预处理方法,（一）分离纯化技术,（二）浓缩技术,（三）衍生化与标记技术,（四）消解技术,第二节 取样,取样？从整批成品中抽出一部分具有代表性的供试样品供检验、分析、留样观察之用。要求：科学性、真实性和代表性原则：均匀、合理,一、抽样,概念 从整批药品中抽取一部分具有代表性的样品的过程。原则,一、抽样,包装件,批,常用术语,抽样批,抽样单元,单元样品,最终样品,均质性药品,非均质性药品,正常,最小包装,异常,一、抽样,（二）抽样的一般步骤 检查药品所处环境 确定抽样单元数、抽样单元及抽样量 检查抽样单元的外观情况 用适当方法拆开抽样单元的包装，
3、观察内容物的情况；用适宜取样工具抽取单元样品，进而制作最终样品，分 为三份，并做好标记；已抽取的包装上，贴上已被抽样的标记 抽样记录和凭证,随机抽样法,偶遇抽样法,针对性抽样,确定抽样单元,一、抽样,一、抽样,（四）、抽样量 中药制剂的抽样量一般为3倍全检量，贵重药品为2倍全检量。制剂抽样至少应有3个最小包装。所抽样品装入清洁、干燥、具磨口塞的容器或密封的塑料袋中，并注明品名、批号、数量、取样日期及取样人。,最终抽取的供检验用样品量原则上应至少为一次全检量的3倍。,五、取样 Sampling,取样方法,样品量不大的粉末状、小块状及小颗粒状样品,取样量,粉状制剂（散剂、颗粒剂）一般取样100g，
4、可从包装的上、中、下三层及周围间隔相等部位取样若干，将所得样品混匀，按四分法从中取出所需供试量。液体制剂（口服液、药酒、糖浆、酊剂等）一般取样200mL。同时须注意均匀取样固体中成药（丸剂、片剂）成品取样一般为100g，压片后取样200片。丸剂一般取10丸。,取样量,胶囊剂 称取不少于20个胶囊，倾出其中的药料，称定空胶囊的重量，由总重中减去，即为胶囊内药料的重量。依标示量及供试量称取部分药料供分析。注射液 灌注、熔封，灭菌前后应经过两次分析。灌封前将注射液混合均匀，如 液体取样方法取样，再按标示量及供试量分别取部分进行检验；经灭菌后的注射液须按原来的方法进行分析检验。已封好的安瓿，取样量一般
5、为200支。,二、样品的粉碎,粉碎目的：一、保证所取样品均匀而有代表性，提高测定结果的精密度和准确度；二、使样品中的被测组分能更快地完全提取出来。粉碎的设备：粉碎机、各种食品料理机 铜冲、研钵,三、样品预处理前的取样量,根据制剂的物理形态，决定取样的形式 以含量测定为例，取样原则如下：固体样品 半固体浸膏剂和煎膏剂 液体样品 气体类中药制剂,第三节 样品的提取,二、分析目的与样品提取,供鉴别用样品提取 定性 方法：超声、回流供杂质检查用样品提取 视检查的内容而定，对于无机杂质检查，常用到消化法供含量测定用样品提取 方法设计要考虑到准确确定最终供试品溶液的体积提取完后用容量瓶来定容最终提取液,第
6、四节 样品的净化,萃取法,直接萃取;离子对萃取,沉淀法,需加入沉淀试剂,色谱法,应用比较多,第四节 样品的净化,常见色谱法净化的原理和适用对象,第四节 样品的净化,固相萃取法,第四节 样品的净化,固相萃取的一般操作程序：,上 样,柱 的 活 化,清 洗,洗 脱,第四节 样品的净化,特点：无需柱填充物和使用溶剂解吸被测组分的前处理，能直接从样品中采集挥发和非挥发性的化合物，然后直接在，GC/MS,HPCE上分析，集采集、提取、浓缩、进样于一体。缺点：提取率低、重复性差。,固相微萃取技术（SPME）,第四节 样品的净化,提取方式：石英纤维直接插入试样中进行提取，适用于气体和液体中组分的分析；顶空提
7、取，适用于所有基质的试样中挥发性、半挥发性组分的分析。,固相微萃取技术（SPME）,第五节 样品的浓缩与衍生化,样品提取液的浓缩,二、样品的衍生化,衍生化反应需要满足的条件：1.对反应要求不苛刻，且能迅速定量进行；2.对某个样品只能生成一种衍生物，反应副产物（包括过量的衍生化试剂）不干扰待测组分的分离和检测；3.化学衍生化试剂方便易得，通用性好。,确保有检测器可以进行检测；改善分离效果,二、样品的衍生化,硅烷化酰化烷基化不对称衍生化,气相色谱法衍生化,提高成分的挥发性增加成分的稳定性生成非对映体,方法,二、样品的衍生化,紫外衍生化荧光衍生化非对映衍生化,HPLC法衍生化,1柱前衍生化2柱后衍生
8、化,衍生化方法,固体制剂预处理的特点,根据剂型特点和制备工艺，重点考虑如何排除赋形剂的干扰,第六节 不同剂型中药制剂供试品制备特点,糖 粉,硫酸钙,淀 粉,糊 精,一般为研细后，过一定数目的药筛，称量，选择适宜的溶剂将被测成分提取,第六节 不同剂型中药制剂供试品制备特点,片 剂,硅藻土具有吸附性，会导致回收率偏低测定成分如果含有酚羟基，需要特别处理，除掉含有的铁离子；硅藻土注意用量。,第六节 不同剂型中药制剂供试品制备特点,丸 剂,提取中可能黏度大，形成不溶性板结物，造成指标成分包裹或吸附现象,种类,糖,糊 精,第六节 不同剂型中药制剂供试品制备特点,颗粒剂,饮片颗粒剂,赋形剂,根据胶囊中内容
9、物状态不同，进行合理设计制备供试品溶液,种类,肠溶胶囊,第六节 不同剂型中药制剂供试品制备特点,胶囊剂,软胶囊,注意取样代表性，均匀取样很重要,特点,中药饮片粉末入药,第六节 不同剂型中药制剂供试品制备特点,散 剂,贵重药材,药 物,油溶性,水溶性,常见的除去基质干扰的方法,第六节 不同剂型中药制剂供试品制备特点,栓 剂,药 物,油溶性,水溶性,常见的除去基质干扰的方法,第六节 不同剂型中药制剂供试品制备特点,滴 丸,半固体制剂预处理的特点,根据剂型特点和制备工艺，重点考虑黏稠度的干扰,第六节 不同剂型中药制剂供试品制备特点,Step 3,水,黏度大,液液萃取或色谱分离,第六节 不同剂型中药制
10、剂供试品制备特点,液体制剂预处理特点,Step 3,前处理相对容易,澄明度好,蒸掉部分溶剂，注意被测成分的酸碱性,第六节 不同剂型中药制剂供试品制备特点,液体制剂预处理特点,注射液、注射用无菌粉末、注射用浓溶液,含测相对简单，薄层供试品制备比较难,第六节 不同剂型中药制剂供试品制备特点,液体制剂预处理特点,糖浆剂：黏度大，需分离、净化,萃取为主，考虑被测组分的酸碱性质,第六节 不同剂型中药制剂供试品制备特点,液体制剂预处理特点,软膏剂、膏药，贴膏剂,气雾剂、喷雾剂,第六节 不同剂型中药制剂供试品制备特点,外用制剂预处理特点,第六节 不同剂型中药制剂供试品制备特点,软膏剂,分析方法：,滤除基质法
11、,提取分离法,灼 烧 法,离 心 法,第一节 定量测定样品的处理,样品处理的作用充分释放被测成分,并制成便于分析测定的稳定试样除杂纯化，提高分析方法的重现性和准确度富集浓缩或衍生化，以测定低含量被测成分。衍生化不仅可提高检测器的灵敏度，还可以提高方法的选择性。使样品形式、溶剂符合测定要求,样品处理的基本过程,样品提取,样品粉碎,样品分离净化,注意：整个过程要定量操作（保证所取样品及测定成分全部转移至最终的测定液中）如：未通过筛孔的颗粒决不能丢弃；残留在容器壁上的无色成分需反复用溶剂洗脱转移等。,一.样品的粉碎,样品粉碎的目的：保证所取样品均匀且有代表性较快且完全地提取被测成分,粉碎设备：粉碎机
12、、研钵、食品处理机 高速匀浆机或玻璃匀浆器。,二.样品的提取,二.样品的提取,冷浸法适用：热不稳定的样品方法：称取一定量样品置于带塞容器内，加入适量溶剂（样品量的1050倍），称重，浸泡提取，浸泡时间1224小时。浸泡后再称重，补足溶剂。测定：部分测定法（等量法）全部测定法（总量测定法）优点：操作简单缺点：费时、费溶剂、不易提取完全,二.样品的提取,回流提取法 适用：热稳定性的成分方法：以单一溶剂或混合溶剂于水浴/电 热套加热回流提取优点：提取效率比冷浸法高，提取时间短缺点：提取杂质较多 不宜用于热不稳定或挥发性的成分,二.样品的提取,连续回流提取法（索氏提取）适用：热稳定性的成分方法：样品置
13、索氏提取器中，用遇热可以 挥发的溶剂进行反复提取优点：提取效率高，所需溶剂少 提取杂质少，操作简便 缺点：受热易分解的成分不宜使用,二.样品的提取,超声提取法 适用：热稳定性的成分方法：样品置适当容器中，加入提取溶剂，放入超声振荡器中提取。优点：提取效率高，提取速度快，操作简便注意：超声频率、提取时间、温度需考察,超临界流体提取法（SFE）,以超临界流体为提取溶剂的提取方法。超临界流体（SF）是指高于临界压力（PC）和临界温度（Tc）时形成的单一相态，它既不是液体，也不是气体，但兼具两者的特征。,临界点,SF的特征-SF能使提取效率和提取速度大大提高,SF的密度与液体相近，具有与液体相似的溶解
14、作用；SF的黏度与气体相近，具有与气体相似的扩散能力，具有良好的传质性能；SF的表面张力几乎为零，易于渗透进样品基质的空隙中，有利于与样品的充分接触,超临界流体提取法（SFE）适用：主要用于热不稳定成分或挥发性成分，也可热稳定性成分,主要用于非极性、弱极性化合物，也可极性化合物加入极性改性剂（甲醇、氯仿、苯），增加其溶解能力。方法：超临界流体萃取仪 优点：萃取效率高、速度快、准确度高、选择性较高、节省溶剂、易于自动化，可避免使用易燃，有毒的有机溶剂，并能与色谱和光谱等仪器联用。,中药制剂分析用样品的分离、纯化,萃取法,溶剂直接萃取离子对萃取,色谱法,沉淀法,应用比较多,需加入沉淀试剂,待测成分
15、具有挥发性，结构比较明确,蒸馏法,中药制剂分析用样品的分离、纯化,萃取法,溶剂直接萃取离子对萃取,色谱法,应用比较多,沉淀法,需加入沉淀试剂,待测成分具有挥发性，结构比较明确,蒸馏法,二.样品的分离净化,沉淀法：利用某些试剂与被测成分或杂质生成沉淀，分离沉淀或保留溶液的精制方法,复方益母草口服液中水苏碱的含量测定利用雷氏盐（硫氰酸铬铵）作沉淀剂，在酸性介质中可与大部分有机碱生成难溶于水的配合物与其它杂质分离。,二.样品的分离净化,蒸馏法：利用某些被测成分具有挥发性，采用蒸馏法，收集馏出液进行含量测定；或某些成分经蒸馏分解成挥发性成分，利用分解产物（要求结构明确）进行测定。最常用：水蒸气蒸馏法
16、适用：挥发油，小分子生物碱 优化：蒸馏液中加入一定量无机盐（盐析作用），使挥发性成分更完全地蒸馏出来,二.样品的分离净化,液一液萃取法 直接萃取法：利用被测成分与干扰成分在有机溶剂（萃取剂）中的溶解度不同，通过多次萃取达到分离净化的目的。萃取次数：实验考察（回收率符合,多数3-4次）溶剂的选择：根据被测组分疏水性的相对强弱 选择极性适当的溶剂 水相pH的控制：弱酸性成分 pHPKa-2 弱碱性成分 pHPKa+2 盐析作用：水相用NaCl饱和，提高提取率。,二.样品的分离净化,2.离子对萃取法适用：高度离解的有机酸、有机碱 中药制剂分析主要用于生物碱（B）离子对试剂：常为酸性染料（In-）如：
17、溴百里酚蓝（BTB）和溴甲酚绿（BCG）注意：水相pH值的控制 离子对试剂的选择 有机溶剂的选择,二.样品的分离净化,色谱法1.经典微柱色谱（固相萃取、液固萃取）方法：被测成分保留于柱上，洗去杂质后，再洗脱被测成分进行测定。使杂质强烈保留于柱上，直接洗脱被测成分进行测定。适用于：总类成分的含量测定;进展：商品LSE柱作为GC、HPLC的预处理柱,二.样品的分离净化,LSE常用填料：硅胶、氧化铝等：传统吸附剂 极性吸附作用为主。硅胶：酸性吸附剂，适用于中性或酸性成分的层析，强烈保留碱性化合物洗脱顺序：极性小大氧化铝：弱碱性，分离一些碱性中草药成分，不宜用于醛、酮、酸、内酯等类型的化合物分离。中性
18、氧化铝、酸性氧化铝：适用于中性、酸性成分的分离。,二.样品的分离净化,应用实例 三氧化二铝可将黄酮类吸附在柱上，用于生物碱、苷类的测定。经过柱色谱分离后采用紫外法测定总生物碱含量。（戊己丸、香连丸、驻车丸）HPLC法测定八宝坤顺丸中芍药苷（中性氧化铝）,二.样品的分离净化,2.LSE常用填料-大孔树脂：分为极性（丙烯酰胺聚合物）和非极性型（苯乙烯和二乙烯苯的共聚物），D101最常用皂苷类和黄酮类 HPLC测定小儿热速清口服液中黄芩苷 注意：预处理；定量时回收率 使用前需要用有机溶剂除去杂质，有时还需用酸、碱清洗,二.样品的分离净化,3.LSE常用填料-聚酰胺：在极性溶剂中与溶质形成氢键而产生吸
19、附作用，常用于含酚、酸、醌类和含phOH的黄酮类药物样品液的净化分离。,正相色谱,二.样品的分离净化,3.LSE常用填料-聚酰胺：在弱（非）极性溶剂中，通过聚酰胺中的烷基作用为非极性固定相。用于萜类、生物碱、甾体的净化分离,反相色谱,二.样品的分离净化,4.LSE常用填料-硅藻土、纤维素：亲水型填料，分配作用 流动相：与水不混溶的有机溶剂 洗脱：亲脂性的成分5.LSE常用填料-离子交换树脂：萃取样品液中可离解化合物（弱酸、弱碱药物）除去样品中的离子，防止组分分解,二.样品的分离净化,6.LSE常用填料-凝胶：适合于生物大分子的分离。,分子越大，越先排出,测定中药制剂中的无机元素预处理-消化法目
20、的：破坏有机物，使无机物游离 常用的破坏方法：湿法消化，干法消化,湿法消化硝酸高氯酸法 适用于血，尿、组织等生物样品和动植物 药制剂的破坏 有机金属药物经破坏后，得到的无机金属离子一般呈高价态。本 法不能用于含氮杂环药物的破坏 凯氏烧瓶用（硅玻璃）直火加热,湿法消化,硝酸硫酸法适用于大多数有机物质的破坏，破坏得到的无机金属离子均为高价态不能用于含碱土金属有机药物的破坏 不适用于与硫酸形成不溶性硫酸盐的金属离子凯氏烧瓶用（硼玻璃）直火加热,湿法消化,硫酸硫酸盐法 常用于含砷或锑有机药物的破坏，破坏得到的无机金属离子多为低价态（三价砷或锑）。样品中加入浓硫酸作氧化剂，加入硫酸盐提高硫酸的沸点，增强
21、硫酸的氧化破坏能力，且防止硫酸的分解损失。聚四氟乙烯消化罐：烘箱加热。,其它湿法 硝酸硫酸高氯酸法 硫酸氧化剂法（过氧化氢法、高锰酸钾）破坏后，金属呈高价态,注意点：所用仪器一般为硅玻璃或硼玻璃制成的凯氏瓶所用试剂应为优级纯水应为去离子水或高纯水按相同条件进行空白试验校正操作在通风橱内进行,中药制剂中朱砂含量测定的消化,干法消化 将有机物灼烧灰化达到分解目的方法：供试品 灰分 将适量样品置于瓷坩锅、镍坩锅或铂坩埚中，常加无水Na2CO3或轻质MgO以助灰化。混匀后，先小火加热，使样品完全炭化，然后放入高温炉中灼烧，使其灰化完全即可。,适用：湿法不易破坏完全的有机物；某些不能用硫酸进行破坏的有机
22、药物。不适用：含易挥发性金属（如汞、砷等）有机药物的破坏,注意事项：（1）加热或灼烧时，应控制温度在420以下，防止金属化合物的挥发（2）一定要灰化完全（3）如果灰化不完全，可以加入硝酸-水（1：3）或稀盐酸-水（1：3）水浴上蒸干后，继续小火灰化,思考题,一、小刘欲鉴别芍药苷片中的芍药，其操作如下：取本品约2.5g,精密称定，加甲醇20mL,超声提取20min,滤过，滤液蒸干，残渣加水5mL溶解并转移至已预先净化的D-101大孔树脂住上（内径1.3cm,填充高度13cm）,控制流速0.5ml/min,待液面降至树脂表面时，分别用50ml水、50ml 10%乙醇，按2mL/min的流速洗脱，然
23、后，按1mL/min的流速用50%乙醇洗脱，收集50%乙醇洗脱液100mL,于100水浴蒸干。残渣用甲醇溶解并定量转移到25mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液，请对划线部分给予解释：,思考题,甲醇提取液为什么要蒸干后再以水溶解？大孔树脂在装柱前应如何预处理？为什么上样时流速要小？为什么要先用水和10%乙醇洗脱？,思考题,二、益母草流浸膏中盐酸水苏碱的鉴别，操作如下：取本品约5g.精密称定，加稀盐酸调节pH值至12，加在强酸性阳离子交换树脂柱（732Na-型，内径0.9cm,柱长12cm）上，以水洗至流出液近无色，弃去水液，再以2mol/L氨溶液40mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，残
24、渣加甲醇1mL使溶解，作为供试品溶液，请解释划线部分：,思考题,加盐酸调成酸性的目的是什么？为什么先用水洗再用氨水洗？,思考题,三、王同学欲鉴别强阳保肾丸中淫羊藿，其操作如下：取本品10丸，加硅藻土，研细，混匀，取约2.5g,精密称定，加甲醇20mL超声提取20min，滤过，滤液蒸干，残渣加水5mL溶解并转移至已预先净化的聚酰胺柱（内径1.3cm,填充高度13cm）上，控制流速0.5mL/min,待液面降至树脂表面时，分别用50mL水、50mL10%乙醇，按2mL/min的流速洗脱，然后以1mL/min的流速用70%乙醇洗脱，收集70%乙醇洗脱液100ml,于100水浴蒸干。残渣用甲醇溶解并定量转移到25mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液，请解释划线部分：,思考题,4.硅藻土的作用？5.甲醇提取液为什么要蒸干后再以水溶解？6.聚酰胺在装柱前应如何做预处理？7.为什么上样时流速要小？8.为什么要先用水和10%乙醇洗脱？,思考题,试比较冷浸法、直接回流法和连续回流法的主要优缺点。简述固体制剂预处理的特点。简述半固体制剂预处理的特点。简述液体制剂预处理的特点。,
