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1、中药复方药效研究新思路 从银翘散展开来说,银翘散源于清代医家吴鞠通所著5温病条辨6卷 一,是治疗风温、温热以及某些杂病属于邪在卫分、上焦,治当辛凉清解者的代表方剂。现代用于治疗 流行性感冒、急性扁桃体炎、咽峡疱疹、麻疹、流行性 腮腺炎等病毒感染性疾病,为中医临床广泛应用、疗效确切的中药复方之一。,小组成员:宋宇翔 靳贵林 席亚丽 牛亭惠 马小兵,方剂【方名】银翘散【别名】银翘解毒散【出处】温病条辨卷一。【分类】解表剂-辛凉解表【组成】连翘一两（30克）银花一两（30克）苦桔梗六钱（18克）薄荷六钱（18克）竹叶四钱（12克）生甘草五钱（15克）荆芥穗四钱（12克）淡豆豉五钱（15克）牛蒡子六钱
2、（18克）【用法】上杵为散，每服六钱（18克），鲜苇根汤煎，香气大出，即取服，勿过煮。肺药取轻清，过煮则味厚而人中焦矣。病重者，约二时一服，日三服，夜一服；轻者三时一服，日二服，夜一服-病不解者，作再服。（现代用法：加入芦根适量，水煎服，用量按原方比例酌情增减。）【方歌】银翘散治上焦疴，竹叶荆蒡豉薄荷；甘桔芦根凉解法，辛凉平剂用时多。【功用】辛凉透表，清热解毒。,银翘散的现代研究,材料与方法仪器：美国Waters高效液相色谱仪(515泵,2487检测器）,Millennium32色谱工作站);美国PE液相色谱/质谱联用仪(PE Serials 200型液相色谱仪,PE SciexAPI3000
3、型串连三级四极杆质谱仪);TU-1800型紫外分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)。,银翘散抗流感病毒有效部位(EFY)自制;乙腈为色谱纯,水为重蒸水,其他试剂均为分析纯。内标物香草醛为分析纯(含量99.19%);对照品绿原酸、甘草苷、甘草素-4c-O-芹糖(12)葡糖苷、异甘草素-4-O-芹糖(12)葡糖苷、异甘草素-2c-O-芹糖(12)葡糖苷、连翘酯苷、芦丁、4,5-二咖啡酰基奎宁酸、3、5-二咖啡酰基奎宁酸、3,4-二咖啡酰基奎宁酸、牛蒡子苷、醉鱼草苷、染料木素及异甘草素由银翘散抗流感病毒有效部位中分得。,色谱条件 色谱柱:YWG-C18(250mm-416 mmID,10mL)
4、;流动相:乙腈-3%醋酸水溶液梯度洗脱(0-5min,乙腈比例:5%10%;5-25min,乙腈比例:10%;25-55min,乙腈比例:10%30%;55-95min,乙腈比例:30%80%;95-100min,乙腈比例:80%);流速:110mL/min;柱温:25e;检测波长:280nm;进样量:10LL，理论塔板数以内标峰(S)计算,不低于5000。,质谱条件 离子源:ESI;所有实验均在负离子扫描方式下进行。在LC-MS条件下,第一级四极杆处于全扫描模式,扫描范围m/z10010-80010,而第三级四极杆处于RF-ONLY模式。在进行LC-MS/MS实验时,质谱仪可在子离子扫描、多
5、重反应监测和母离子扫描方式下工作。供试品溶液的制备精密称取内标物(香草醛)1115mg,以50%乙腈水溶液溶解,置于50mL量瓶,再以50%乙腈水溶液稀释至刻度,经0.145Lm滤膜滤过,备用。,精密称取EFY6416mg并以适量50%乙腈水溶液超声使之溶解,完全转移至10mL量瓶,以50%乙腈水溶液稀释至刻度,经0.145mL滤膜滤过,备用。精密吸取EFY溶液8mL,内标物溶液2mL,混合均匀,即得供试品溶液。金银花、连翘、牛蒡子、桔梗、薄荷、淡竹叶、甘草、荆芥及淡豆豉均按银翘散有效部位制备工艺方法,制备相应的药材供试溶液。阴性溶液的制备依据各单味药在银翘散组方中的配比,除去某单味药而制成相
6、应的阴性溶液。,特征指纹图谱建立 考察150minEFY的色谱分离情况,记录100min色谱图,以色谱图中峰S(香草醛)为内标,令其保留时间为1,以峰19(牛蒡子苷)为参照,令其峰面积为1,其他各峰的保留时间和峰面积分别与内标峰的保留时间和参照峰的峰面积相比较,作为各峰的相对保留时间和相对峰面积。组分归属分析及主要色谱峰的指认依据各单味药在特征指纹图谱中色谱保留时间信息及其阴性样品的考察,从而实现在相同的实验条件下所得的色谱指纹图谱中单味药与复方目标物质的相对归属分析。,通过LC-MS/MS对主要色谱峰碎片离子的解析及添加对照品绿原酸、甘草苷、甘草素-4c-O-芹糖(12)葡糖苷、异甘草素-4
7、-O-芹糖(12)葡糖苷、异甘草素-2c-O-芹糖(12)葡糖苷、连翘酯苷、芦丁、4,5-二咖啡酰基奎宁酸、3,5-二咖啡酰基奎宁酸、3,4-二咖啡酰基奎宁酸、牛蒡子苷、醉鱼草苷、染料木素、异甘草素的考察,实现对主要色谱峰的指认。,讨论银翘散抗流感病毒有效部位所含化学成分相当复杂,本实验根据黄酮、木脂素、有机酸三大类主要成分的性质,反复优化选取最佳色谱条件,结果表明,确定乙腈-3%醋酸水溶液作为流动相。由于EFY中化学成分极为复杂,等度洗脱难以实现主要成分的分离,采用梯度洗脱可以兼顾强极性和弱极性成分的分析,得到的信息量较为丰富,成分峰形尖锐且分离度较好。,供试品溶液于200-400nm扫描,
8、发现EFY在230,280和320nm处均有较强吸收,比较EFY在上述3个波长下的HPLC图谱,确定280nm为测定检测波长。本文的色谱方法可在100min内展开上述成分,并使大部分色谱峰达到基线分离,由于流动相梯度变化较大,使得基线有些漂移。在此色谱条件下,测定银翘散抗流感病毒有效部位的HPLC图谱,并与各单味药样品色谱图比较,发现它们有很强的相关性。LC-MS/MS联用技术的引入,为中药复方复杂体系的物质基础研究提供了有效的手段。,实验研究发现,在所建立的特征HPLC图谱中4号峰未得到归属,推测可能为煎煮条件下新产生的化合物,由于其在负离子扫描条件下,色谱峰离子丰度太小,未给出分子离子峰及碎片m/z值,目前尚难以确定来源,有待进一步研究。在丰度较大的色谱峰离子中发现4个来源于甘草的分子离子峰及碎片峰完全一致的成分,应为异构体,对于未确认的11号峰,m/z549为基峰,m/z255为次强峰,m/z417较弱,从结构上推测可能为甘草素的芹糖葡糖苷,糖链应连在7位。另外,包括异甘草素-2c-O-芹 糖(12)葡糖苷、醉鱼草苷、染料木素在内的一些化合物,均为首次从各单药中发现,其原因可能就是在煎煮条件下,由于分子间相互作用而使其溶解度增大的结果。,谢谢大家,
