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1、第十三章 临床即时检验仪器与技术,郑峻松,目 录,第一节 即时检验的技术原理与特点第二节 常用即时检验仪器第三节 即时检验仪器的应用第四节 即时检验存在的问题,重点提示,1.即时检验的定义和主要特点是什么？有哪些临床应用？2.即时检验的主要技术大致可分为哪几类？3.POCT血糖测定仪的检测原理和基本结构是什么？。4.POCT血气分析仪的检测原理和基本结构是什么？5.POCT免疫分析仪的检测原理和基本结构是什么？6.简述微流控芯片技术在POCT仪器中的应用。,第一节 即时检验的技术原理与特点,一、POCT的概念,POCT是指在实验室外，靠近检测对象，采用便携式、可移动的微型检测仪器和试剂，快速及
2、时报告检测结果，并能对检测结果及时反馈和干预的体外检验系统。美国国家临床生化科学院（National Academy of Clinical Biochemistry，ACB）将POCT的概念定义为：“在接近患者治疗处，由未接受临床检验学科训练的临床人员或者患者（自我检测）进行的临床检验，是在传统、核心或中心实验室以外进行的一切检验。”空间上，在患者现场进行的检验，即“床旁检验”；时间上，在患者发病的时刻进行的检验，即“即时检验”。,一、POCT的概念,POCT曾有过许多意思相近的表述，如患者近旁检测、床旁检测、另处检验、分散化检测、家庭检测、患者自我检测、医生诊所检测等。POCT的核心特点包
3、括三个要素：从时间上讲是快速检测，缩短了从样本釆集、检测到结果报告的总的检测周期（turnaround time，TAT）；从空间来讲没有固定的检验场所，可以在病患和被测对象身边进行检测；检测的实施和操作可以是非检验技术专业人员，甚至是被检测对象本人。,二、POCT的分类与特点,（一）POCT仪器的分类1.根据用途分类 血糖检测仪、电解质分析仪、血液分析仪、血气分析仪、凝血测定仪、心肌损伤标志物检测仪、药物应用监测仪、酶联免疫检测仪、放射免疫分析仪、甲状腺激素检测仪等。2.根据仪器大小和和外观分类 便携型、桌面型、手提式、手提式一次性使用型等。3.根据所用装置特点分类 卡片式装置、单一或多垫试
4、剂条、微制造装置、生物传感器装置、其他多孔材料等装置。,二、POCT的分类与特点,（二）POCT的特点1.仪器小型化 2.操作简单化 3.报告即时化 4.检测质量,5.产品应经权威机构质量认证 6.检测费用应合理 7.生物安全,三、POCT的技术原理,（一）干化学检测技术将反应试剂经特殊工艺固定在特殊的纸片上，与样本反应后产生不同的颜色变化，根据颜色不同与深浅，对检测样品进行定性或定量分析。多层涂膜技术是从感光胶片技术移植而来，将多种反应试剂一次涂布在片基上，或采用多层涂膜技术制成干片，用仪器检测可以准确定量。,三、POCT的技术原理,（二）免疫学检测技术1.免疫金标记技术 由氯金酸（HAuC
5、l4）在还原剂作用下，聚合成特定大小的金颗粒，并由静电作用成为一种稳定的胶体状态，称为胶体金。胶体金颗粒具有高电子密度的特性，与样本结合后，可见红色或粉红色斑点。由胶体金标记单克隆抗体，配合小型检测仪可做半定量和定量测定。免疫金标记方法包括斑点免疫渗滤法和免疫层析法，二者均被广泛应用于快速检测蛋白质类和多肽类抗原。是POCT中应用最广泛的方法学之一。2.免疫荧光技术,三、POCT的技术原理,（三）电化学检测技术电化学检测是测量物质的电信号变化，对具有氧化还原性质的化合物可采用电化学检测。电化学检测器包括极谱、库仑、安培和电导检测器等，前三种统称为伏安检测器，用于具有氧化还原性质的化合物的检测，
6、电导检测器主要用于离子检测。脉冲式安培检测器最为常用。,三、POCT的技术原理,（三）电化学检测技术在两电极之间施加一恒定电位，当电活性组分经过电极表面时发生氧化还原反应（电极反应），电量（Q）的大小符合法拉第定律：Q=nFN。因此，反应的电流（I）为：I=nFdN/dt n为每摩尔物质在氧化还原过程中转移的电子数；F为法拉第常数；N为物质的摩尔数；t为时间。当流动相的流速一定时，dN/dt与组分在流动相中的浓度有关。电化学检测的优点表现在：灵敏度高；应用范围广。电化学检测的主要不足在于：干扰较多；电极寿命有限，对温度和流速的变化比较敏感。,三、POCT的技术原理,（四）生物传感器检测技术能感
7、应（或响应）生物和化学量，利用离子选择电极、底物特异性电极、电导传感器、酶传感器等特定的生物检测器进行分析检测，并按一定的规律将其转换成可用信号输出的器件或装置。该技术组合了酶化学、免疫化学、电化学与计算机技术等，可以对生物体液中的分析物进行超微量的分析，例如电解质K+、Cl-、Na+、Ca2+、Mg2+以及葡萄糖、pH、PCO2、PO2血气分析等。,三、POCT的技术原理,（五）微流控芯片技术微流控芯片技术是把生物、化学、医学分析过程的样品制备、反应、分离、检测等操作单元集成到一块微米尺寸的芯片上，自动完成分析全过程。微流控芯片是微流控技术实现的主要平台，是当前微型全分析系统（miniatu
8、rized total analysis systems，MTAS）发展的热点领域，它的最终目标是把整个临床实验室的功能，包括采样、稀释、加试剂、反应、分离、检测等集成在微芯片上，实现微型全分析系统的芯片实验室。,第二节 常用即时检验仪器,一、血糖测定仪,（一）化学比色法POCT血糖测定仪1.工作原理 用反射光度技术测量血糖的原理是通过测定酶与血液葡萄糖反应产生有色产物的反射光的强度并将其转换为血液葡萄糖浓度。葡萄糖氧化酶光化学法测定血液葡萄糖浓度，是利用干化学试纸片上的葡萄糖氧化酶将血样中的葡萄糖氧化成葡萄酸内酯和过氧化氢，后者又在过氧化氢酶的作用下在干片上生成有颜色的氧化型色素，其颜色深浅
9、与葡萄糖浓度成正比。,一、血糖测定仪,主要有四层：分布层、试剂层、指示层和支持层,（一）化学比色法POCT血糖测定仪2.基本结构,一、血糖测定仪,（二）电化学方法POCT血糖测定仪1.工作原理 采用生物传感器原理将生物敏感元件（酶）同电化学换能器相结合，并借助现代电子技术将测得结果以直观数字形式输出。根据酶电极的响应电流与被测血样中的葡萄糖浓度成线性关系计算样本中的葡萄糖浓度。（1）葡萄糖氧化酶电极测量法：在一定的恒定电压下，当待测样品滴加在固定有葡萄糖氧化酶的电极测试区时，样品中的葡萄糖被氧化而消耗氧。由于氧消耗量与血糖浓度成正比，而酶电极的响应电流又与溶液中的氧含量成正比，因此，酶电极的响
10、应电流值即可反映样品中的血糖浓度。,一、血糖测定仪,（二）电化学方法POCT血糖测定仪1.工作原理（2）葡萄糖脱氢酶电极测量法：测定原理为酶电极的响应电流与待测样品中的葡萄糖浓度成线性关系，在电极两端施加一定的恒定电压，当待测血样滴加在电极测试区后，电极上固定的葡萄糖脱氢酶与血中的葡萄糖发生酶反应，血糖仪即显示葡萄糖浓度值。,一、血糖测定仪,（二）电化学方法POCT血糖测定仪2.基本结构 电化学血糖检测仪器的基本机构包括开关、显示屏、试纸插口、电池、密码牌插槽、样本测量室等。试纸条结构包括聚酯膜（顶膜和底膜）、加样区、试剂区、钯电极等。,一、血糖测定仪,（三）影响POCT血糖测定仪检测的因素1
11、.血糖仪与试纸条的匹配2.试纸条的使用与保存 3.采血与操作 4.消毒剂因素 5.仪器状态 6.其他环境因素患者因素,一、血糖测定仪,（四）血糖测定仪的质量控制每天进行患者样本测定前，应先用仪器厂商提供的质控品测定。当试纸条批号改变、新的试纸条包装打开、血糖测定仪更换电池或怀疑仪器损坏、试纸条变质时，都应重新进行质控品的测试。如果质控结果超出范围，则不能进行血糖样本测定。此时应找出失控原因并及时纠正，重新进行质控测定，直至获得正确结果。应做好质控及维护仪器的记录，记录内容应包括测试日期、时间、仪器的校准、试纸条批号及有效期、仪器编号及质控结果等。,一、血糖测定仪,（四）血糖测定仪的质量控制美国
12、临床和实验室标准协会2001年发布的葡萄糖POCT的应用准则指出：POCT血糖测定仪的测定结果应统一以生化分析仪血浆葡萄糖浓度表示，要求POCT血糖测定仪测定值4.2mmol/L时，与大型自动化生化分析仪的测定结果之间的差异应20%；血糖测定仪测定值4.2mmol/L时，二者间的差异应0.83mmol/L。应根据实验室血糖测定法对该类产品进行定期校对。,二、血气分析仪,（一）基于电化学传感器电极的POCT血气分析仪1.工作原理 被测样本在吸样系统的抽吸下，进入样品室内的测量毛细管中。测量毛细管的管壁上有4个开孔，孔内分别是pH、pH参比、PO2和PCO2四支电极，其中pH和pH参比电极共同组成
13、对pH的测量系统。被测血样吸入测量毛细管后，管路系统停止抽吸，血液中pH、PCO2和PO2同时被四支电极所感测，电极将它们转换成各自的电信号，这些电信号经过放大模数转换后被送至计算机处理，处理后将测量值和计算值显示出来并打印出测量结果。,二、血气分析仪,（一）基于电化学传感器电极的POCT血气分析仪1.工作原理,二、血气分析仪,（一）基于电化学传感器电极的POCT血气分析仪2.基本结构 基于电化学传感器电极的血气分析仪主要是由电极系统、管路系统及电路系统三部分组成。,二、血气分析仪,（二）基于荧光传感器的POCT血气分析仪1.工作原理 荧光物质受某一适当颜色光能量的照射时，荧光物质中的电子被激
14、活，经极短时间电子又返回静息状态，这一过程中有时会散发出很少量的光能量，这一能量远小于激发光能量，并表现为不同颜色。因为激发光的能量是恒定的，通过一定浓度的分析液，光会产生很小的变化，通过计算荧光差值由已知浓度定标液可分析出未知液体浓度。光学电极检测技术正是根据这一原理发展而来。,二、血气分析仪,（二）基于荧光传感器的POCT血气分析仪2.基本结构 荧光传感器干式测试片主要由进样适配器/多个不同的传感器组成。注射器进样适配器可以直接从注射器中吸入样品，移开这个适配器可以直接从毛细管/血气专用采血针中吸入样品。当仪器插入干式测试片时会自动定标，然后可进行一次样品的测量。测量是在封闭情况下自动吸入
15、的样品，避免了外部加压造成细胞破裂对测量结果的正确性可能造成的影响。,二、血气分析仪,（二）基于荧光传感器的POCT血气分析仪2.基本结构,二、血气分析仪,（二）基于荧光传感器的POCT血气分析仪3.影响因素 试剂片：应按照不同仪器的使用要求储存试剂片。温度：定标液对温度敏感，使用前应放置在室温下平衡。样品的全自动吸入和封闭测量：外力加压注入样品会不同程度地造成细胞破裂及内部压力变化，对检测结果造成一定影响。4.质量控制 实时监测大气压；检测前应对标准气体或液体定标。,三、POCT免疫分析仪,（一）基于免疫金标记技术的POCT免疫分析仪1.基于免疫渗滤技术的POCT仪（1）工作原理：免疫渗滤技
16、术是利用微孔滤膜的可滤过性，以硝酸纤维素膜为载体，在包被了抗原或抗体的特殊渗滤装置上，使反应和洗涤以通过液体滤过膜的方式迅速完成。其中应用最为广泛的是斑点金免疫渗滤试验。斑点金免疫渗滤试验是在以硝酸纤维素膜为载体并包被了抗原或抗体的渗滤装置中，依次滴加样本、免疫金和洗涤液，因微孔滤膜贴置于吸水材料上，故溶液流经渗滤装置时与膜上的抗原或抗体快速结合并起到浓缩作用，达到快速检测目的。阳性反应在膜上呈现红色斑点。,三、POCT免疫分析仪,（一）基于免疫金标记技术的POCT免疫分析仪1.基于免疫渗滤技术的POCT仪（2）基本结构斑点金免疫渗滤试验的试剂盒由渗滤装置、胶体金标记抗体、封闭液和洗涤液组成。
17、渗滤装置由塑料小盒、吸水垫料和点加了抗原或抗体的硝酸纤维素膜片三部分组成。,（3）影响因素：特异性抗体（一抗）或抗原、待检样本和金标抗体的用量事先都必须应用方阵法确定最适用量。盒底充填的垫料吸水性要强，否则影响结果。,三、POCT免疫分析仪,（一）基于免疫金标记技术的POCT免疫分析仪2.基于免疫层析技术的POCT仪（1）工作原理：,三、POCT免疫分析仪,（一）基于免疫金标记技术的POCT免疫分析仪2.基于免疫层析技术的POCT仪（2）基本结构：金标定量免疫分析仪通常包括：反射型光纤传感器、光探测器、单片微电脑、输入输出接口、模数转换器、扫描控制电路、光电转换电路、背景补偿电路、显示器和内置
18、打印机等。（3）影响因素：测量环境的光照、温度和湿度等物理条件均会对检测结果产生干扰；由于操作导致测试区反应颜色不均匀，可使检测结果偏高。,三、POCT免疫分析仪,（一）基于免疫金标记技术的POCT免疫分析仪3.质量控制（1）胶体金质量对快速试验的质量至关重要。（2）硝酸纤维素膜是胶体金免疫层析反应的载体，其孔径的大小、质量的好坏和层析膜的化学处理优劣都会影响包被抗原或抗体的吸附量，从而影响检测结果。（3）免疫胶体金快速检测是通过标记的胶体金而显示反应条带，判读主观性很大，有时会存在难以判定的情况（如色带模糊时）。因此，针对胶体免疫层析试验的影响因素，建立完善的质量控制体系，包括试剂灵敏度与稳
19、定性、临界值的确定、层析条间的重复性、室内质量控制以及人员培训等，对保证检验质量至关重要。,三、POCT免疫分析仪,（二）基于免疫荧光技术的POCT免疫分析仪1.检测原理 由微孔层析和免疫荧光技术相结合的技术平台（免疫荧光层析技术）。样品加入加样孔后，过滤掉血细胞和其他颗粒成分，反应区域含有荧光素标记的抗体或抗原和待测物质结合，产生反应而显色。仪器的测定系统对荧光信号进行测量，并对特异的待测物进行定量分析，结合仪器中反应密码芯片中的标准曲线计算出样品中待测物的浓度。2.基本结构 由荧光检测器和检测板组成。,三、POCT免疫分析仪,（二）基于免疫荧光技术的POCT免疫分析仪3.影响因素 所有影响
20、荧光发生和检测的因素都有可能导致免疫荧光技术检测结果发生偏差；仪器的工作环境应保持干燥、清洁、平坦，并避免阳光直射和电磁辐射。4.质量控制 仪器通过自带芯片中包含的定标曲线、每批次试剂的信息（批号、有效期和条形码信息等）和内置质控数据，完成定标和内置质控。,四、微流控芯片技术相关的POCT分析仪,（一）微流控芯片的分类与原理1.主动式微流控芯片 主要以MEMS超微加工的微泵、微阀、微管道、微电极、微储液器、微检测元件等超微结构组成，通过控制微电流、微分压差等方式主动改变微流体的流动方向、流动速度、传质传热等，实现对样本的分离和分析。2.被动式微流控芯片 主要依托液体本身的重力和重力转化的压力，
21、或材料的表面性能，连同毛细管作用（虹吸作用）为动力，配以化学涂层或物理结构建立时间窗的设计，减缓或加速微流体流动，从而达到反应平衡。,四、微流控芯片技术相关的POCT分析仪,（一）微流控芯片的分类与原理当样本通过纳米荧光探针反应池，样品中抗原抗体发生反应，使待测物带有荧光标记。当样本到达检测卡中一个蛇形S-channel流路控制室，完成孵育并达到反应平衡。,当样品的液流通过检测区，捕获抗体捕获抗原形成“三明治”样结构的双抗体夹心复合物，并保留在检测区。检测区中的荧光信号与样本中抗原/抗体的浓度成比例关系。,四、微流控芯片技术相关的POCT分析仪,（二）微流控芯片的技术特点1.微流控反应器的作用
22、有：控制液体的流动速度和体积；控制液体的流动或静止；控制参与反应的液体体积；使用微流体通道设计，精确控制反应速度；有废物通道设计，能控制流程结束时间。2.微流控S-channel流路能控制液流的速度和反应时间。3.微流控反应器使用的材料能保证反应体积和测定结果的稳定。,四、微流控芯片技术相关的POCT分析仪,（三）微流控芯片POCT的发展方向微流控芯片对使用便捷化的要求更高。降低微流控芯片POCT装置的制造成本，并向装置小型化的方向发展。开发更多“个性化”的检验手段是微流控芯片POCT研究的重要方向。某些微流控芯片POCT装置仍需要专业人员的操作，这使微流控芯片POCT的使用和推广受到限制。还
23、需要在操作的简便和智能化方面进行完善，使其能够更好地适合普通用户人员（包括患者）使用。,第三节 即时检验仪器的应用,一、心血管疾病中的应用,1.急性心肌梗死相关标志物检测 cTn、Myo、CK-MB一次检测结果的异常可以初步判断心肌损伤，使AMI患者得到及时救治。2.BNP 心力衰竭敏感和特异的指标，判断患者是否存在充血性心力衰竭，对于鉴别诊断心源性和肺源性引起的急性呼吸困难有很大的临床意义。3.D-二聚体与肌钙蛋白 既可辅助对AMI的诊断，又作为溶栓治疗时的观察指标。,二、血液相关疾病中的应用,1.血栓与止血 心脏手术进行时凝血功能的监测，肺部血栓和深层静脉血栓的诊断。POCT检测D-二聚体
24、主要利用免疫学方法，对于血栓病的及时诊断和溶栓治疗的疗效监测具有重要意义。肝素监测的POCT主要用于激活全血凝固时间（ACT）和活化部分凝血活酶时间（APTT）的检测，能有效缩短TAT，有助于凝血紊乱的快速诊断和快速有效的抗凝。2.血红蛋白定量和血细胞计数,三、感染性疾病诊断的应用,C反应蛋白，HBV、HCV、HIV、梅毒等病原体感染的快速检测；细菌性阴道病、衣原体感染、性病的诊断等，孕前TORCH-IgM五项指标的快速检测结核病耐药基因的筛查等。,四、糖尿病诊治的应用,糖尿病监测常用的有快速血糖、糖化血红蛋白与尿微量白蛋白等指标。POCT用于血糖的检测可以方便快捷地测定血糖水平，是临床和患者
25、居家时最常用的血糖水平监测手段。糖化血红蛋白反映12个月血中葡萄糖的平均水平，是诊断和治疗糖尿病过程中疗效监测的重要指标。,五、院外POCT的应用,1.院外救治 2.出入境检验检疫 3环境质量监测 4.家庭保健 5.社会安全与食品安全 如炭疽、鼠疫等病原菌的检测；爆炸物检测；食品三聚氰胺、农药残留、抗生素超量的检测等。,第四节 即时检验存在的问题,即时检验存在的问题,一、组织管理我国POCT的法律法规、行政管理和规章制度还不健全，虽然医疗卫生行政监管部门对POCT的管理做出了一些要求，但仍未制定行之有效的措施，目前POCT的使用实际上处于缺乏有效监管的状况。二、质量控制1.仪器的选择2.POC
26、T仪器使用场合分散3.部分POCT仪器精密度欠佳,即时检验存在的问题,三、检验费用虽然POCT检验能缩短TAT，使患者得到及时诊治，从而可能缩短病程、降低医疗费用的支出，但是由于POCT检测一般以单个试验为主，增加检测项目使得仪器和试剂的成本增加，检测费用偏高。四、结果报告某些POCT在检测过程中容易发生差错，如样本上没有患者信息、样本与患者不符、检测报告单形式和报告内容不规范等。,本章小结,即时检验是指在接近患者治疗处，由未接受临床检验专业训练的医护人员或者患者本人利用测试板条或便携式仪器快速分析患者样本并准确获取结果的检测分析技术。即时检验的常用技术有干化学技术、免疫学技术（包括免疫金标记技术和免疫荧光技术；前者又有斑点免疫渗滤技术和免疫层析技术）、电化学技术、生物传感器技术和微流控芯片技术等。未来的即时检验将向着自动化、小型化、非创伤性和检验项目多样化的方向发展。POCT的应用还存在一些问题，如检测结果与大型自动分析仪器存在差异，检测结果的精密度和准确度有待进一步提高，POCT的使用和管理等方面还有问题需要解决和规范等。,Thank you!,
