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1、第十三章 核酸的生物合成 本章主要讨论DNA的生物合成即DNA的半保留复制；RNA生物合成即DNA到RNA的转录。现加上下一章蛋白质的生物合成内容(即翻译过程)，就构成了分子遗传学中心法则。,第一节 DNA的复制与修复研究DNA复制的目的就是要了解三个问题。第一、子代DNA为什么能够直接地获得新DNA的遗传信息?第二、复制是怎样进行的第三、生物体是怎样对DNA复制进行调控的?一、DNA的半保留复制(P321 图19-1 P321 图19-1)在DNA复制过程中，每个子代分子的一条链来自亲代DNA，另一条则是新合成的，这种复制方式称为半保留复制。实验证明见课本。生物意义：DNA的半保留复制机制可
2、以说明DNA在代谢上的稳定性。,（一）、反应所需的条件及反应的特点：(1)原料(或底物)：四种5三磷酸脱氧核苷(dNTP)，缺一不可。(2)模板及辅助因子：DNA模板、Mg2+(或Mn2+)或DNA二条链(一条链为模板，一条链为引物)(3)引物链：具有自由3-OH的RNA或DNA片段(约10个核苷酸)(4)反应：由引物末端3-OH与进入的5三磷酸脱氧核苷的磷酸残基化合，生成酯键(35磷酸二酯键，并脱下焦磷酸)(5)方向：DNA 链由53方向延长(6)能量：来自与之间的高能磷酸键裂解(7)四种dNTP参加反应的先后顺序，由DNA模板决定，受碱基配对支配；而不受四种dNTP相对浓度的影响。(8)产
3、物DNA的性质与模板相同。这说明DNA聚合酶是一种模板指导的酶。,二、参加复制过程的主要酶及作用DNA是由脱氧核糖核苷酸聚合而成，参加聚合反应的酶包括多种DNA聚合酶以及DNA连接酶。,（一）大肠杆菌中DNA聚合酶：(含Zn2+)（DDDP）,(1)DNA聚合物(又称Kornberg酶)的特殊作用：(是一个多功能酶)去除引物及填补间隙作用：在DNA复制过程中，可将引物RNA水解下来，并催化合成DNA片段以填补间隙。DNA聚合酶作用：催化DNA链由53方向延长。校正错误作用：它可将DNA链的末端接上的错误核苷酸水解下来，然后再催化接上一个正确的核苷酸。即由3端水解DNA链，具有35核酸外切酶的作
4、用。修复损坏及变异作用：即由5端水解DNA链，具有53核酸外切酶作用。(详见后面介绍)由3端使DNA链发生焦磷酸解。催化无机焦磷酸盐与脱氧核糖核苷三磷酸之间的焦磷酸基交换。,(2)DNA聚合酶特殊作用：目前尚不大清楚，可能在DNA修复中起作用。(3)DNA聚合酶的特殊作用：主要参与绝大多数新的DNA的合成。,DNA聚合酶 M.W.109Kdal 单一多肽链，聚合1000个核苷酸/分/分子DNA聚合酶 M.W.120Kdal 单一多肽链，聚合2000个核苷酸/分/分子DNA聚合酶 M.W.180Kdal 单一多肽链，聚合50000个核苷酸/分/分子,(二)DNA连接酶及作用：DNA聚合酶能催化D
5、NA片段及链的延长合成，但不能将DNA断片连接起来，这种连接反应是由DNA连接酶来催化的。DNA连接酶不单是DNA复制所必需的，而且也是在DNA损伤修复及基因重组中不可缺少的酶。,连接双股DNA中的一股存在的缺口，不能连接单股DNA。,(三)拓扑异构酶：,生物体内DNA分子通常处于负超螺旋状态.,拓扑异构酶的作用,拓扑异构酶的作用,拓扑异构酶的作用是使DNA的超螺旋的圈数增加或者减少。此作用需要ATP分解提供能量。,(四)DNA解螺旋酶及单链结合蛋白(SSB)：,(五)引发酶(引物合成酶)又称特定的RNA聚合酶,根据DNA的顺序合成RNA引物，本质上是 RNA聚合酶,RNA引物（约10个核苷酸
6、的RAN片段）是由引 发酶（引发体）来合成的，合成时不需要引物，其碱基与一般模板DNA配对，合成的方向是53。,三、DNA的半不连续复制,DNA解链后，DNA聚合酶即以分开了的两条多核苷酸链为模板进行复制。DNA两条链都能作为模板。以复制叉向前移动的方向为标准，走向为35的模板链上的DNA能以53方向连续合成，直到所需的长度，这条链能连续合成称为前导链，而另一条走向为53的模板链却不能连续合成，称为滞后链。1968年日本学者冈崎等提出了DNA的不连续复制模型，认为需先合成一些约为10002000个核苷酸(真核生物为100200个)DNA片段(称为冈崎片段)，其合成方向也是53，但与复制叉移动的
7、方向相反，这些片段合成后可在DNA连接酶作用下拼接起来，直到其长度与前导链相等。DNA这一复制过程称为半不连续合成(Semidis-continous)。,四、DNA复制的主要过程：（见P342 图19-17）,1、拓扑异构酶可引入负超螺旋而造成DNA双链断裂，以便于解螺旋酶的作用。2、解螺旋酶将双股螺旋解开，形成复制岔口(复制叉)。3、单链结合蛋白质(SSB)结合于每股链上，以维持两链处于分开状态。4、引物合成酶催化合成RNA引物。5、DNA聚合酶催化合成新的DNA的前导链及冈崎片断。6、DNA聚合酶切除引物，并合成DNA片段以填补空隙。7、DNA连接酶将冈崎片断拼接起来，以完成滞后链的合成
8、。,五、真核生物DNA的复制：复制条件、酶及因子 等均与原核生物相似。,特点,1、真核生物DNA复制的冈崎片断约为200bp，相当于一个核小体DNA的长度。（小于原核生物：10002000 bp）2、复制速度比原核生物慢，基因组较大，但真核生物染色体DNA上有许多复制起点，它们可以分段进行复制。细菌的DNA复制叉移动速度为5万bp/分；哺乳动物则为1千3千bp/分。3、真核生物一个复制起点一般发动一次复制过程，快速生长往往采用更多的复制起点。原核生物：一个起点可连续发动复制。4、真核生物在复制子上，由于其染色体是以核小体为结构单位组成，因此在其复制时涉及到亲代DNA链与组蛋白八聚体的解开和子代
9、DNA与组蛋白的重新组装。,六、DNA复制调控(了解)：1963年 Jacob等提出复制子模型（即一个复制单位）：（P 344）它的一个结构基因能产生一种蛋白质起始因子（initiator）,具有 感受细胞内信号、识别复制基因、促使复制开始等作用。复制子中存在正、负调节系统，调控机制很复杂。,七、DNA损伤及修复：（一）DNA损伤：指DNA分子的一级结构的任何异常改变，包括异常修饰和顺序改变。可分为自发的损伤和环境因子引起的损伤。1、物理损伤：V辐射、电离辐射。（放射性同位素粒子、x射线）可使DNA分子中出现：TT（二聚体）防碍复制、转录等。2、化学损伤：主要有亚硝酸、亚硝基胺、甲基化试剂、碱
10、基类似物等改变碱基配对顺序，影响DNA正常复制。,如：亚硝酸（HNO2）可使,A变成 I（脱NH3）,C变成 U（脱NH3）,(二)DNA修复：目前已知细胞内有四种修复系统：光复活；切除修复(复制前修复)；重组修复(复制后修复)；诱导修复和应急反应（SOS），后三种又称为暗修复。修复工作相继由四种酶催化，分为四步进行：（参见P348，图19-24右半部）切开（特异的核酸内切酶催化）：切开二聚体的5端一侧，切除（核酸外切酶催化）：切除含二聚体的片断。修复（DNA聚合酶催化）：在敞开的3-OH上逐个接上正确的脱氧核苷，形成与另一链有互补关系的短链。连接（DNA连接酶）：将新合成的正确片段3-OH与
11、切去缺陷片断后而敞开的5-P，拼接起来。生物学意义：能使正常机体在内外环境因子高速度变化的条件下，保持遗传信息稳定和复制的准确性。,第二节 RNA的生物合成与加工现已肯定：细胞内所有RNA都是以DNA为模板在胞核中合成，其绝大部分进入胞液中，发挥其指导蛋白质合成的功能，只有小部分留在胞核中起结构及调节作用。RNA：分为三种：mRNA(信使RNA)、tRNA(转运RNA)、rRNA(核糖体RNA)。mRNA：将从DNA转录来的遗传信息传递给蛋白质，作为蛋白质合成的直接模板。一分子mRNA，可表达一个或一组基因。tRNA：将活化了的AA运送到核蛋白体供给合成蛋白质之用。rRNA：组成核蛋白体(核糖
12、体)，作为细胞内蛋白质合成场所，细胞内RNA的合成可由DNA指导的RNA聚合酶、RNA指导的RNA聚合酶、多核苷酸磷酸化酶等催化。但转录作用只有在DNA指导的RNA聚合酶的作用下才发生。,一、DNA指导的RNA聚合酶的作用：（DDRP）,（一）反应所需条件及反应特点：,1、原料(或底物)：四种5-三磷酸核苷(NTP)缺一不可。2、模板及因子：DNA模板、Mg2+或Mn2+，一般双链中只有一条链作为转录的模板链。3、反应进入的核苷酸的5-P与另一核苷酸的3-OH形成磷酸二酯键。4、反应方向：53。5、四种NTP参加的先后顺序：由DNA模板决定，受碱基配对支配，而不受四种NTP相对浓度影响。,（二
13、）与DNA聚合酶的不同之处,1、不需要引物；2、作用方式不同；DNA碱基顺序的转录是通过全保留方进行的。3、不具有核酸酶的活性(RNase或DNase的活性),(三)RNA聚合酶的种类和组成：,1、大肠杆菌的RNA聚合酶组成：全酶分子量约为46万；它包括两条链(2)、一条链()、一条链()、一分子因子（），其中因子的功能是识别模板上特殊起始点，使DDRP结合到DNA启动子上，故在转录开始后即被释放，剩余2部分称为核心酶，催化转录继续进行。,2、现真核细胞中有酶(A)、酶(B)、酶(C)都是金属酶。（含Zn2+、Mg2+、或.Mn2+）它们的结构分布部位及功能都不完全相同,酶分布于核仁中，催化合
14、成核仁的rRNA(18s、28s、5.8s)酶在核质中催化合成mRNA的前体及病毒RNA酶在核质中催化合成5sRNA及tRNA。除了上述细胞核RNA聚合酶外，还分离到线粒体RNA聚合酶和叶绿RNA体聚合酶。其功能详见P362。,二、转录的基本步骤：有四个步骤(有的称三个步骤)：见P361 图20-2,识别：对双链DNA特定部位的识别。起始：聚合作用即转录的开始。延长：RNA链的延长。终止：聚合作用停止。,（一）识别起始：,1：识别：原核细胞RNA聚合酶的因子能辨认DNA模板链上的起始位点。（该位点被叫作启动基因或启动子）。起始点约由611个核苷酸构成，且具有一定的排列顺序，RNA聚合酶与起始点
15、结合子前，DNA的两条链必须解开，具体是由于什么因子的作用尚不清楚。总之，识别可能是RNA聚合酶在一些辅助因素的协作下与DNAA链上起始点结合的步骤。,2：起始：头两个与DNA链上碱基配对的NTP依次进行聚合作用形成第一个磷酸二酯键。其中第一个核苷酸80%以上都是嘌呤，大多是GTP、（或ATP）。：DNA模板链走向：35 RNA的合成方向：53,（二）延长：,当RNA链合成开始后，因子就脱落下来，可与另一核心酶结合而被重新使用。为了能沿模板移动，全酶必须放松对DNA的结合，这些变化使得：此时RNA聚合酶构象改变：全酶核心酶+因子。参见P361。核心酶可沿DNA链滑行向前，利用NTP为原料，连续
16、合成RNA，不断延长RNA链，延伸时所合成的多核苷酸链并不全保留在模板上，对一条RNA合成链而言，在任何时候只有一个连接点，该点沿DNA链移动，连续转录出相同的RNA产物。当核心酶滑向前时，已被转录的DNA前段分开的部分链又重新并合，形成双螺旋，这一开一合逐步不断进行，直到转录过程结束。,（三）终止,在DNA分子上有终止转录的特殊信号（终止子），这些信号一些可被RNA聚合酶自身识别，另一些则需因子帮助(终止辅助因子，又称终止因子)。,不依赖于的终止子(简单终止子)：现已弄清许多DNA分子的终止区域，发现在终止点之前有一双重对称的G与C丰富区，紧接着还有一A和T多的排列顺序。因此在些区域内转录的
17、RNA能自身互补(GC)而形成发夹形结构，AT丰富区有一连串的AAAA，故新生RNA链终止末端带有多个U残基(UUUU),很可能在这些结构中一个或多个即是终止信号。,依赖于的终止子：在某些终止点有种特殊蛋白质蛋白(rho protein)，其分子量为5.5万，能辩认终止信号，并与酶结合，以阻止核心酶再向前滑动，于是转录作用停止，并释放出产物RNA、因子、RNA聚合酶。在依赖因子的终止点处，RNA聚合酶只是在此暂停，但不终止，需的帮助，才能停止转录。,（1）E.Coli中存在两类终止子：不依赖于的终止子(简单终止子)。依赖于的终止子。,（2）因子具有两种活性：a、终止转录；b、依赖于RNA的核苷
18、三磷酸酶(NTPase)。因此提出了一个终止转录模型。,三、转录的不对称性：在转录过程中作为模板的DNA大多为双链的，实验证明，不管任何一个基因(DNA片断)，其DNA双股链中都只有一股被转录，即所谓的不对称转录。究竟DNA双链的哪一条上带有被转录的信息呢?目前认为没有一定的约束和规定,四、一些名词：,(一)启动子（promoter）和转录因子；(二)终止子(terminator)和终止因子；(三)操纵子(operon)详见P367转录过程的调节控制,五、RNA的转录后加工(RNA的成熟)：P369,(一)RNA前体的加工处理(修饰作用)主要包括：,1、剪切：5或3端的切除2、链的裂解：3、特
19、殊结构的形成：如mRNA 5帽子的形成。4、碱基或糖的修饰：如甲基化。5、拼接：切除内含子，拼接外显子。,(二)tTNA前体的加工：,1、切除：用核酸内切酶、核酸外切酶切除5端和3端的附加序列。2、碱基修饰：特异的修饰酶催化。,3、加上3-CCAOH结构，它对于接受氨酰基的活性是必要的，该反应是由tRNA核苷酰转移酶催化进行，由CTP和ATP供给胞苷酸和腺苷酸。成熟tRNA分子较小(MW2.4万3.1万)，沉降系数4s，具有二个功能部位(3-CCAOH即AA臂；反密码环)。tRNA种类多(50多种)，而体内AA只有20种，故可有几种tRNA转运同一种AA称为同功受体tRNA，如转运苯丙氨酸的二
20、种tRNA可用tRNAphe表示。,（三）rRNA的前体加工：,占细胞内RNA总量的80%，由于rRNA和prot 结合存在，核蛋白体在功能上须反复使用，所以代谢比较稳定。，rRNA包括28s、18s、5.8srRNA，在核仁中合成；5srRNA在核质中合成。转录后rRNA前体的加工过程主要包括：拼接、断裂、甲基化等反应rRNA的功能主要是：组成核蛋白体，为prot合成的“装配机”。,（四）mRNA,占细胞总量最少，真核生物的mRNA前体是核不均一RNA（HnRNA），须经复杂的加工过程才能变成成熟mRNA，进入细胞质胞液中 作为蛋白质合成模板。,hnRNA其加工过程包括:,1.5端“帽子”结构的形成；5“-帽子”非翻译顺序 起始顺序(多AUG)密码区”尾巴”。2 多聚A尾巴”的形成；3.链内核苷甲基化；4.除去内含子，拼接外显子。,
