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1、乙型肝炎病毒cccDNA 检测方法与应用价值,第二军医大学长征医院缪晓辉2005.10,一、几个相关问题简介,什么是HBV cccDNA?,即共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA)。乙肝病毒感染宿主细胞后在细胞内复制并建立感染状态，病毒松弛环状DNA（rcDNA）进入细胞核，利用宿主DNA聚合酶和拓扑酶等“修复”形成的、结构完整的、超螺旋双链DNA分子。,乙型肝炎病毒基因组结构示意图,乙型肝炎病毒的复制过程,我们为什么要关注HBV cccDNA?,cccDNA存在于细胞核内，成为乙肝病毒的复制“池”目前尚没有可以进入细胞核内，并能够清除cccDNA
2、的药物，这也是现有抗病毒药物治疗效果不佳和治 疗后容易复发的原因之一 肝脏以外器官组织细胞可能存在cccDNA，成为肝脏 移植术后乙肝复发的来源 还没有稳定、可靠、敏感的cccDNA检测试剂盒问世,为什么没有cccDNA检测试剂盒问世?,研究和开发该检测技术的时间不长检测技术上的难度较大前期研究主要集中于细胞模型和动物肝脏 模，不能满足临床检验的需求现有技术灵敏度不高，检测低限104 copy/ml左右分研究机构和学者对检测技术的特异性认 识不足，存在缺陷,多种同源的乙肝病毒DNA分子并存(cccDNA、rcDNA、ssDNA、整合的HBV DNA），必须有 效地分离cccDNA和其他类型的病
3、毒DNA如何进一步解决特异性的问题？如何解决灵敏度不高的问题（细胞内cccDNA 含量的较低），血清中含量？如何简化检测步骤？,建立cccDNA检测技术必须克服的难点,分离cccDNA和rcDNA的分子基础,分离cccDNA和rcDNA的任何手段均基于上述差异,二、HBV cccDNA检测技术,1.选择性PCR(普通PCR、套式PCR、荧光PCR)2.侵入者探针法（Invader assaay）3.嵌合引物荧光PCR法,现有的几种cccDNA检测技术简介,现有的几种cccDNA检测技术简介,选择性PCR(普通PCR、套式PCR、荧光PCR)2.侵入者探针法（Invader assaay）3.嵌
4、合引物荧光PCR法,设计一对特殊引物：跨双缺口引物 正义引物P1：与负链互补结合，位于正 链缺口上游 反义引物P2：与正链互补结合，位于负 链缺口下游目的：rcDNA不被扩增,1.选择性PCR,选择性PCR：rcDNA不被扩增,选择性PCR：cccDNA能被扩增,PCR产物自身退火（self annealing）,“选择性”PCR：并非万无一失,国内外许多研究者忽略了这个问题，rcDNA被大量扩增，阳性结果不可靠，定量结果也不可靠 Hepatology Research 2003;15:234-243（PBMC）World J Gastroenterol 2004;10(1):82-85(血清
5、),Kock等：反应管中rcDNA含量不能超过105copy Hepatology 1996;23:405-413,我们的经验：血清HBV rcDNA超过108copy/ml，进行荧光PCR可能会出现检测结果假阳性,“选择性”PCR：并非万无一失,与定性法比较增加了一个荧光探针，探针位于扩增片段区（负链缺口下游），与cccDNA的负链互补。,选择性实时荧光定量PCR检测cccDNA,rcDNA不能被扩增无荧光信号,EcoR I,5,+,P1,P2,3200(1),5,3,1590,3,1820,P1,1820,1590,+,3200（1）,EcoR I,P2,cccDNA能被扩增检测到荧光信号
6、,选择性实时荧光定量PCR检测cccDNA,实时荧光定量PCR的原理,实时荧光定量PCR的原理,实时荧光定量PCR的原理,标准曲线方程YCtcopy 相关指数：R2=0.995 灵敏度至少可以达到103copy/ml,我们的结果：,选择性实时荧光定量PCR检测cccDNA,同样存在PCR产物自身退火引起的rcDNA 非特异性扩增的问题由于灵敏度较普通PCR高，假阳性率比普 通PCR更高,缺陷：,选择性实时荧光定量PCR检测cccDNA,选择性实时荧光定量PCR检测cccDNA,解决方案,特异性抽提分离cccDNA与其它形式的病毒DNA 采用沉淀法或质粒抽提试剂盒抽提法 酶切纯化cccDNA 采
7、用绿豆核酸酶或ATP依赖的plasmid-safe DNA酶,选择性实时荧光定量PCR检测cccDNA,1.选择性PCR(普通PCR、套式PCR、荧光PCR)侵入者探针法（Invader assaay）3.嵌合引物荧光PCR法,现有的几种cccDNA检测技术简介,2.侵入者探针法(Invader assay),两个体系：两种特殊的探针：invader probe和primary probe，后者含与待测模板无关的5侧翼的碱基片段。荧光共振能量转移系统：被核酸内切酶(cleavase,裂解酶)特异地切割5侧翼碱基片段作为第二个invader，与荧光共振能量转移盒（FRETC）结合，裂解酶切割FR
8、ETC上含有荧光基团的短臂，发出荧光信号。特点：一个模板可以重复使用，每“结合裂解结合裂解”一次为一个循环，每循环一次产生一个荧光信号，呈线性信号放大,侵入者探针法定量检测cccDNA的优缺点,优点：线性信号放大，特异性比荧光 PCR法强缺点：灵敏度低：104copy/ml,1.选择性PCR(普通PCR、套式PCR、荧光PCR)2.侵入者分析法（Invader assaay）嵌合引物荧光PCR法,现有的几种cccDNA检测技术简介,3.嵌合引物荧光PCR法,Shao,et al.J Virol Methods 2003；112：45-52,N：与HBVDNA非同源片段,rcDNA,cccDNA
9、,3.嵌合引物荧光PCR法,嵌合引物荧光PCR的优缺点,优点：克服了荧光PCR法的部分缺陷，灵敏 度比侵入法提高 缺点：仍不能完全避免待测标本中存在的 rcDNA被非特异性扩增,无论是选择性荧光PCR，还是侵入者探针法或嵌合引物荧光PCR，本身都不能解决在高rcDNA背景条件下的假阳性问题，必须结合抽提分离、酶切纯化等步骤，以提高特异性。,三、影响cccDNA池的因素,1.cccDNA池的自身恒定,cccDNA池：感染肝细胞核内HBV cccDNA的 含量在无外来干扰的情况下保 持恒定(550copy/cell)病毒自身调节：关于病毒的进化 关于病毒的“思维”病毒自身的调节 外来压力：打破病毒
10、含量自身恒定的结果,2.抗病毒药物对cccDNA的影响,现有抗病毒药物，包括干扰素和各种核苷类似物，可以一过性地减少cccDNA，但均不能清除cccDNA细胞核内cccDNA含量的相对稳定性，决定了长疗程抗病毒治疗的必要性,抗病毒药物对cccDNA的影响,（文献举例）,阿德福韦治疗48周结果,Hepatology 2005;42:302-308,举例,3.肝外组织也是cccDNA的储存池？,肝外组织细胞中HBV标志的存在情况：肾、胰腺、肺、心肌、心包膜、胃肠黏 膜、皮肤、睾丸、前列腺、唾液腺、PBMC 等组织或细胞中均检测到HBV的标志物HBV吸附？暂居？建立感染状态？依据：从上述组织细胞中检
11、测到cccDNA，但必须解决检测技术问题,(1)有关PBMCs中cccDNA检测的研究,PBMCs中cccDNA检测结果不一的原因,方法学的问题:假阳、阴性率？灵敏度？目前报道阳性结果者均采用套式PCR！研究模型的选择？病毒因素？细胞数量的多少？其他：免疫功能状态、实验室条件等,(2)关于血清中是否存在cccDNA的问题,(2)关于血清中是否存在cccDNA的问题,“血清中rcDNA含量越高，cccDNA阳性率 越高和含量越高”的现象，使我们对方法 学提出质疑肝衰竭的病人在一定病期有可能大量释放 cccDNA入血细胞坏死后，cccDNA释放入血是必然的，但是，裸露的核酸分子在血清中存在多少 时间？,四、今后需要研究的问题,加强HBV慢性感染者不同病情和病期肝组织和肝外 组织中cccDNA水平研究研究HBV cccDNA在血液中的降解时间对血清检测 的意义以肝移植患者为研究对象，探究肝外组织cccDNA 池，并据此研究HBV慢性感染者肝外损害的机制等能否通过血清中可能存在的cccDNA及其含量的动 态观察，对HBV感染肝衰竭患者进行预后分析？能否把cccDNA检测作为研制新的抗病毒药物疗效 的评价标准？生物疗法（包括基因疗法）是否应该“聚焦”核内 cccDNA？,Thank you,
