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1、乙型肝炎病毒的异质性 及临床意义,成 军 博士、教授 北京地坛医院,HBV的感染过程,第一部分乙型肝炎病毒的血清型,1 决定因素乙型肝炎病毒的血清型，由膜主蛋白序列来决定。2 亲水结构区HBsAg有两个亲水区：32-76 aa和110-156 aa。HBsAg亲水赖氨酸改变，抗原活性消失。3 共同决定簇139-147 aa是共同簇抗原a必需的最小序列。,乙型肝炎病毒的血清学分型,1 排斥决定簇主蛋白还携带两对相互排斥的亚型决定簇d/y（122-134 aa指令d/y决定簇）和w/r（159-160 aa指令w/r决定簇）。2 四个主要亚型组成4个主要亚型：adw、adr、ayw和ayr。,四个
2、主要亚型,除了4个主要亚型外，还有adyr、adwr、adyw/aywr和adywr等复合亚型。不同亚型在外膜蛋白的前-S区序列和全基因组序列亦有相应的差异。,复合亚型,第二部分乙型肝炎病毒的基因型,HBV基因型的定义,分型方法是根据HBsAg主蛋白基因或全基因组核苷酸序列差异性进行的基因型分型，差异大于8%即被确定为另一基因型，按照这种分型方法，将HBV分为6种基因型，分别命名为A-F型，另有学者新定义了G、H型，尚待确定。,国内流行病学资料,国内主要的基因型为B、C两型，台湾省的研究资料提示除E型外，其他基因型均可在华人HBV感染者中检出，B和C型占患者人群的85%。,HBV 的异质性 基
3、因型,基因型*地理分布 A 北欧、西欧、美国、非洲 B 中国、印度尼西亚、越南 C 中国、越南、朝鲜、日本 D 地中海区、中东、印度 E 西非 F 美国（印地安拿人）、波利尼西亚 G 欧洲、美国*根据 HBV 全序列中核苷酸差异 8%Chu CJ et al.Hepatology 2002;35(5):1274,第三部分乙型肝炎病毒基因准种的特点,问 题 不同的慢性乙型肝炎患者之间血清中乙型肝炎病毒基因序列是不同的，因此可以根据序列的差别分成不同的血清型（adr、ayw、adw 等），也可以分成不同的基因型（A、B、C、D、E、F、G、H）。问：同一个患者血液中不同的乙型肝炎病毒之间其基因序列
4、是否相同？答：相同！或 不同！,型与准种,基因型（不同个体之间）血清型（不同个体之间）准 种（单一个体）,乙型肝炎病毒准种的定义 乙型肝炎病毒在长期复制过程中，由于逆转录过程其多聚酶缺乏严格的校正机制，从而产生自发点突变，造成子代病毒基因序列之间的微小差别，因而血清中的乙型肝炎病毒基因序列是不同的。这种差别一般小于全长基因组的5%。有微小基因序列差别、但序列十分相近的乙型肝炎病毒组成的病毒群，这一病毒群时刻处于动态变化之中，乙型肝炎病毒的这种存在状态称为“准种”。英文：quasispecies,为什么以前没有注意？方法比较,既往方案：收集血清提取血清中HBV DNA设计重叠PCR引物PCR扩增
5、产物直接测序（单一克隆序列）,本研究方案收集血清提取血清中HBV DNA设计PCR引物PCR扩增 TA克隆入质粒载体中随机选择单克隆测序（多个克隆序列）,S基因准种的特点（前-S1、前-S2、S）,Protocol of Human Somatic Gene Therapy,S 基因全长 PCR,1400 bp,1 2 3 4 M 5 6 7,1 400 bp,HBV全S基因RFLP结果,遗传树分析,E853-A3,E845-A12,E845-B4,E845-A16,E845-A8,Renbao Gan,N19 E5,N19 A3,N19 A8,N19 E19,EJ1 B13,EJ1 A4,E
6、67 B5,E67 A1,E67 A8,E67 B1E67 B8,N19 E5,EJ1 B6EJ1 A12,EJ1 B16,HBV准种特点分析 HBV DNA S Region HBV DNA X Region HBV DNA P Region HBV DNA C Region HBV DNA Pre-C 区 HBV DNA 全长 HBV DNA,基因准种的个体化特点,HBsAg氨基酸序列,RT702 A3 MENTT-LFGGA-VPFAQWFAG-RT702A14 MENTT-LFGGA-VPFAQWFAG-RT702 B3 MENTT-LFGGA-VPFAQWFAG-RT702A10 M
7、ENTT-LFGGA-VPFAQWFAG-RT522 B7 MESTT-LFGGA-VPFVQWFVG-RT522 A5 MESTT-LFGGA-VPFVQWFVG-RT522B11 MESTT-LFGGA-VPFVQWFVG-RT XJ A2 MENTT-LFGEA-VPFVQWFVG-RT XJ A6 MENTT-LFGEA-VPFVQ*FVG-RT XJ B5 MENTT-LFGEA-VPFVQWFVG-RT XJ C4 MENTT-LFGEA-VPFVQWFVG-,变异的一些特点（逆转录酶区）,RT702 A3-SSNLSWLS-SHPIVLGF-VIGSWGTLPQEHIVLKIK-
8、RT702A14-SSNLSWLS-SHPIVLGF-VIGSWGTLPQEHIVLKIK-RT702 B3-SSNLSWLS-SHPIVLGF-VIGSWGTLPQEHIVLKIK-RT702A10-SSNLSWLS-SHPIVLGF-VIGSWGTLPQEHIVLKIK-RT522 B7-SSNLTWLS-SHPIILGF-VIGSWGTLPQEHIVLKLK-RT522 A5-SSNLTWLS-SHPIILGF-VIGSWGTLPQEHIVLKLK-RT522B11-SSNLTWLS-SHPIILGF-VIGSWGTLPQEHIVLKLK-RT XJ A2-SSNLSWLS-SHPIIL
9、GF-VIGCWGTLPQEHIVLKIK-RT XJ A6-SSNLSWLS-SHPIILGF-VIGCWGTLPQEHIVLKIK-RT XJ B5-SSNLSWLS-SHPIILGF-VIGCWGTLPQEHIVLKIK-RT XJ C4-SSNLSWLS-SHPIILGF-VIGCWGTLPQEHIVLKIK-,前-S2基因缺失突变的研究,线 索：S基因研究中发现前-S2区多个缺失突变株的存在,HBV在慢性患者人群中的准种现象,前-S2区缺失突变分析,总数 无缺失 缺失百分比HBeAg 阳性 36 23 13（36%）抗-HBe 阳性 15 1 14（93%）合计 51 24 27（5
10、2%）,前-S2区缺失突变位点分析 位点 范围 702-4 nt 43-66 24 bp ZH-A6 nt 52-66 15 bp ZH-B4 nt 37-66 30 bp ZH-B12 nt 37-66 30 bp N314-5 nt 25-66 42 bp N314-7 nt 25-66 42 bp 811-B12 nt 52-66 15 bp,不同病毒株突变位点adr MQWNSTTFHQALLDPRVRGLYFPAGGSSSGTVNPVPTTASPISSIFSRTGDPAPN702-1-A-I-H702-4-A-I-702-9-G-A-T-I-702-10-G-A-T-I-314-1-
11、T-Q-L-I-314-5-L-314-7-L-314-9-T-Q-ZH-A6-Q-ZH-B4-ZH-B6-ZH-B11-ZH-B12-142-A3-142-A7-142-A8-H811-A7-811-A8-811-B12-,本研究的一些重要发现,慢性乙肝患者体内存在有HBV准种群。HBV准种群中存有缺陷型病毒，即部分ORF编码序列经突变终止了正常表达。前C/C区、X区、前-S2区内部存有缺失突变，尤其以后2个区域多见。HBV变异存在个体化现象。血液中发现了截短型表面抗原中蛋白,关于准种研究的一些问题,乙型肝炎病毒的高变区与高保守区的界定？乙型肝炎病毒准种与感染慢性化的关系？乙型肝炎病毒准种群
12、的漂变规律与肝纤维化的关系？乙型肝炎病毒准种群的漂变规律与肝细胞癌的关系？干扰素治疗与乙型肝炎病毒准种群的漂变？拉米夫定治疗与乙型肝炎病毒准种群的漂变？耐药株与准种漂变规律的关系？需要多靶位的“联合、序贯”的治疗？,乙型肝炎病毒研究的临床意义,第 一 首先是改变了我们既往对乙型肝炎病毒存在状态的看法。概念：1 差别，2 相似，3 种群，4 动态。,第 二 提高了我们的科研设计水平，以及学术论文的鉴赏水平。治疗前后比较病情变化前后比较 印度寓言：盲人摸象,第 三 提高了我们对于乙型肝炎病毒标准株或参考株的判断水平。早期克隆的病毒株为标准序列？Consensus序列为标准序列？,第 四 有利于深入
13、、正确认识拉米夫定用药过程中YMDD变异等问题。是药物选择的结果，不是诱导的结果。,拉米夫定对野生型HBV的抑制,核苷类似物,拉米夫定,ss(-)DNA,抑制,HBV 聚合酶(野生型),高亲和力,M,D,Y,D,Y=酪氨酸M=蛋氨酸D=天门冬氨酸,拉米夫定和 YMDD 变异株HBV,Y=酪氨酸V=缬氨酸D=天门冬氨酸 I=异亮氨酸,在细胞培养体系中YMDD变异株复制水平显著低于野生株（Melegari et al，Hepatology 1998;Allen et al,Hepatology 1998）YMDD 变异株（YVDD and YIDD）与核苷类似物的结合能力显著下降(Chayama
14、et al，Hepatology1998;Back et al，EMBO J，1996),第 五 正确认识将来的乙肝疫苗的免疫预防效果。应该及早设计新型疫苗！,第 六 正确认识目前的诊断试剂的漏检率会不会逐渐提？应该及早试验新型诊断试剂！,第 七 献血员的筛选方法是否继续有效，输血是否安全？应该及早重视新的献血员筛选办法！,第 八 多少药物，什么样的药物才能完全解决抗乙型肝炎病毒的治疗问题？越来越多的抗生素也不能完全解决细菌感染问题？,第 九 如何选择抗病毒药物？不同的乙肝病毒准种群对不同的抗病毒药物敏感性存在差别，为什么没有把乙肝病毒的准种特点这一因素，作为选择抗病毒药物选择的条件之一？细菌体外药敏试验有什么提示？,第 十 我们不能全部消灭细菌，我们最终能全部消灭病毒吗？人与细菌的长期共存有什么提示？,结 论 准种是乙型肝炎病毒存在的基本方式。如果不充分重视乙型肝炎病毒准种的研究，将来的某一天，目前的诊断方法不再有效、治疗的药物不再敏感、输血不再安全、疫苗的预防覆盖率显著下降，乙型肝炎病毒感染的问题将持续存在。,新北京地坛医院全貌图由近及远：行政办公楼、门诊医技楼、病房楼,谢 谢！,
