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1、,乙肝六项的操作、注意事项及检验结果的解释,乙肝六项操作HBSAg(双抗体夹心法）,原理在微孔条上预包被，被纯化的乙肝表面抗体，配以酶标记抗体（HBsAb-HRP）及TMB等其它试剂，采用夹心法原理检测人血清（或血浆）中乙肝表面抗原（HBsAg）。,乙肝六项操作HBSAg(双抗体夹心法）,操作步骤一.准备1.1平衡：将试剂盒各组分别取出，平衡至室温（18-25），1.2配液：浓缩洗涤液配制前充分摇匀（如有晶体应充分溶解），浓缩洗涤液和蒸馏水或去离子水按25倍稀释后使用。1.3编号：将微孔条固定于支架，按序编号。,乙肝六项操作HBSAg(双抗体夹心法),二.HBSAg操作2.1加样：分别用加样器
2、在对照孔中加入阴、阳性对照血清各75l于相应孔中。2.2温育：置37温育60分钟。2.3 加酶：不用洗涤，分别在每孔中加入酶标记抗体50l，轻轻混匀。2.4 温育：置37温育30分钟，室温平衡5分钟。2.5 洗涤：用洗涤液充分洗涤5次，洗涤完扣干（每次应保持30-60秒的浸泡时间）。2.6显色：每孔加入底物A、B各50l，轻拍混匀，置37暗处30分钟。2.7终止：每孔加终止液50l，混匀。三.HBSAg测定用酶标仪单波长450nm或双波长450/630nm测定各孔OD值（用单波长测定时需设空白对照一孔，30分钟内完成测定，并记录结果）。,乙肝六项操作HBSAg(双抗体夹心法),结果判断与分析
3、临界值（C.O.）的计算：Cutoff临界值=阴性对照孔OD值N2.1，阴性对照OD均值大于0.05时按实际OD值计算，小于0.05时以0.05计算。结果判定：样品OD值S/C.O=1者为HBsAg阳性样品OD值S/C.O1者为HBsAg阴性,乙肝六项操作HBeAb检测（ELISA)竞争法,一.试剂准备同上 二.HBeAb操作 加样：分别用加样器在对照孔中加入阴、阳性对照血清各50l于相应孔中。加酶：分别在每孔中加入酶标记抗体50l，轻轻混匀。温育：置37温育30分钟，室温平衡5分钟。洗涤：用洗涤液充分洗涤5次，洗涤完扣干（每次应保持30-60秒的浸泡时间）。显色：每孔加入底物A、B各50l，
4、轻拍混匀，置37暗处15分钟。终止：每孔加终止液50l，混匀。三.HBeAb测定用酶标仪单波长450nm或双波长450/630nm测定各孔OD值（用单波长测定时需设空白对照一孔，30分钟内完成测定，并记录结果）。,乙肝六项操作HBeAb检测（ELISA)竞争法,四.结果判断与分析临界值（C.O.）的计算：临界值（阴性对照孔OD值N+阳性对照孔OD值P）0.5，结果判定：样品OD值S/C.O1者为HBeAb阴性注意：加底物显色，显色的强弱与待测标本中HBeAb的含量成反比。,乙肝六项操作HBCAb测定（竞争法）,原理在微孔条上预包被，被纯化乙肝核心抗原（HBcAg），配以酶标记抗体（HbcAb-
5、HRP）及TMB等其它试剂，采用竞争抑制法原理检测人血清（或血浆）中乙肝核心抗体（HBcAb）。,乙肝六项操作HBCAb测定（竞争法）,试剂准备同上加样：每测定孔加入50l样品。对照孔中加入阴、阳性对照血清各50l。作为临床诊断依据，必须将原倍血清样品按1：30稀释后再检验，稀释液应采用生理盐水；（作为流行病学调查依据，使用原倍血清检验）。加酶：每孔加入酶标记抗体50l，轻拍混匀。育温：置37温育30分钟，室温平衡5分钟。洗涤：用洗涤液充分洗涤5次，洗涤完扣干（每次应保持30-60秒的浸泡时间）。显色：每孔加入底物A、B各50l，轻拍混匀，置37暗处30分钟。终止：每孔加终止液50l，混匀。测
6、定：用酶标仪单波长450nm或双波长450/630nm测定各孔OD值（用单波长测定时需设空白对照一孔，30分钟内完成测定，并记录结果）。结果判断与分析临界值（C.O.）的计算：临界值阴性对照孔OD值N0.5（未稀释临界值阴性对照孔OD值N0.3）结果判定：样品OD值S/C.O1者为HBcAb阴性 注意：加底物显色，显色的强弱与待测标本中HBCAb的含量成反比。,乙肝六项操作HBCAb-lgM(捕获法）,测定原理采用兔抗人HbcAg-IgM包被固相载体反应板，加入待测标本，同时加入HbcAg-HRP，当标本中存在HbcAb时，该HbcAb-IgM与包被HbcAg结合并与酶结合形成HBcAg-Hb
7、cAb-HBcAg-HRP复合物，加入TMB底物产生显色反应，反之则无显色反应。,乙肝六项操作HBCAb-lgM(捕获法）,操作步骤 1.待测样品用生理盐水作1:1000稀释，每孔加人稀释样品100微升，设阴、阳性对照各2孔，每孔加人阴性对照(或阳性对照)各100微升(或2滴)，并设空白对照1孔，封板，置37 孵育20分钟。2.手工洗板:弃去孔内液体，用洗涤液注满各孔，静置5秒，甩干，重复3次后拍干。洗板机洗板：选择洗涤3次程序洗板后拍干。3.每孔加入HBcAg30微升(或1滴)，酶结合物50微升(或1滴)(空白对照孔除外)，充分混匀，封板，置37孵育20分钟4.手工洗板:弃去孔内液体，用洗涤
8、液注满各孔，静置5秒，甩干，重复5次后拍干。洗板机洗板:选择洗涤5次程序洗板后拍干。5.每孔加显色剂A液，显色剂B液各50微升(或l滴)充分混匀，封板，置37 孵育10分钟。6.每孔加人终止液50微升(或1滴)，混匀。7.用酶标仪读数，取波长450nm(建议使用双波长的酶标仪比色，参考波长630nm)，先用空白孔校零，然后读取各孔OD值。记录结果）。,乙肝六项操作HBCAg-lgM(捕获法）,8.结果判断与分析8.1 临界值（C.O.）的计算：临界值阴性对照孔OD值N4，阴性对照OD均值小于0.05时以0.05计算，大于0.05时应实际OD值计算。8.2 结果判定：样品OD值S/C.O=1者为
9、阳性 样品OD值S/C.O1者为阴性9.质量控制：每次均应有阴阳对照，其OD值应在要求范围内。,乙肝六项操作HBCAb-lgM(捕获法）,10.参考值范围：参考值cut-off value(COV)=阴性对照平均OD值x 4阴性对照OD值低于0.050作0.050计算，高于0.050按实际OD值计算。示例1：阴性对照孔1 COV:0.016.阴性对照孔2 COV:0.010.0.05040.200示例2：阴性对照孔 COV:0.056 阴性对照孔 COV:0.060（0.056+0.060）/240.232,ELISA法检测乙肝六项的注意事项 及结果分析,酶联免疫吸附试验(简称 ELISA 法
10、)检测乙型肝炎免疫学标志物问世以来，由于测定灵敏高、特异好和操作简便等诸多优点，具有实用性和可操作性，并广泛应用于各类医院实验室，作为检测乙肝血清标志物的首选，但通过对临床乙肝六项检测的观察、存在不同血清物质变化及各种影响因素，直接或间接的影响检验结果的正确表达。综合资料和实践，作如下探讨：,1 样本的采集与处理影响,1.1 样本离心处理不全，使得标本严重溶血及混有红细胞的血清易沉淀或附着在聚乙烯孔内不易洗净，残留在孔内的血红蛋白，具有过氧化物酶样的活性，催化底物显色造成假阳性，溶血标本禁用。,1.2 正常血液采集后半个小时至两小时开始凝固，有时工作中为了快速检测，常会在血液未开始凝固时，即强
11、行离心分离血清。特别是在冬天 使得血清中残留部分纤维蛋白原，在 ELISA 测定过程中可以形成肉眼可见的纤维蛋白凝块附着在酶标反应孔壁内使得不易洗掉 易造成假阳(阴)性、影响结果。因此血液标本采集后要使其充分凝固后再分离血清，标本离心时，可加大离心转速，延长离心时间 或者要节约时间就用带分离胶的采血管采集标本。,1.3 血清标本应避免细菌污染，细菌的一些内源性酶本身会对相应酶作标记测定方法产生干扰。,1.4 标本储存时间不宜过长，应新鲜 4 保存不宜超过7天，以免因标本中的 IgG 聚合导致本底加深 甚至假阳性，影响判断结果。,2 试剂的影响,2.1 试剂盒在运输中时间太长，温度过高会使显色偏
12、淡，灵敏度偏低，要求试剂盒应存放于 2-8 冰箱中，从冷藏环境中取出的试剂盒、全部瓶装试剂以及待测标本所需的微孔反应板，都应预先在室温下平衡后，再开启使用。余者应及时封存于冰箱。不同批号试剂盒中的组份、不能进行交叉使用，包括试剂瓶盖，相互交叉使用，有可能出现显色浅或本底高，花板情况。所以不同试剂瓶盖不能混淆，试剂盒不要使用超过有效期。,2.2 不同厂家出产的试剂特异性和敏感性不相同。有的厂家酶标板空间 A 值差 15%，标记酶活性及显色液的稳定性较差，使用劣质试剂必然导致结果的假阳性或假阴性。选择高质量的试剂是保证检验结果准确的关键之一,3 操作技术的影响,3.1 加样吸嘴的洁净和吸液量的准确
13、性直接影响结果，移液器吸量不足，移液抽吸排放太快，吸头内壁挂液太多或内壁不清洁，所以要定期校正移液器，吸头要配套，每次装吸头要吻合紧密，移液不宜过快，排放应完全，尽可能使用同一移液器和装紧吸头移液时用力及抽吸速度均匀一致 加样后要充分混匀，在 100 ul和 50 ul的移液不精密度应 在1%范围以内，分别在99-101 ul和 49.5-50.5 ul之间。,3.2 温浴影响 96 孔酶标板结构特别，易产生边缘效应，抗原抗体结合及酶促反应对温度要求严格，标本要贴好密封膜，防止水蒸气和污物浸入，放置 37 水浴箱时，应让反应孔底部 2/3 浸入水中，才能减少受热不均 避免边缘效应，干浴与水浴存
14、在明显的差异，尽可能使用水浴，并控制好水浴时间。,3.3 洗涤是 ELISA 法操作的重要环节，洗涤液的配制要严格按照说明书进行操作，不能用自来水代替蒸馏水配制 因为自来水中的次氯酸钠会影响结果，手洗易交叉污染 尽量使用洗板机洗涤，血清中残留的纤维蛋白或洗涤瓶，未经常清洗而留有的污垢，结晶易使洗板机针孔全堵塞或半堵塞，造成未结合标记酶洗脱不彻底，导致花板而造成假阳性或假阴性，所以操作洗板机过程中要不时观察洗板机针孔内洗液的通畅情况，及时纠正调整，洗板机要做好维护保养，不用时应用去离子水清洗几遍。,3.4 显色剂应避光保存 滴加显色剂 A、B 时，顺序不能颠倒，注意不要漏加，显色时间要严格控制，
15、可用计时器来计时，保证准确，肉眼判断结果时，显色浅不易观察，影响结果准确性，必须使用酶标仪检测结果，以保证结果一致性，滴加终止液后随着时间的增加，吸光度值逐渐下降，而且浓度越高其吸光度随时间下降越快，可能会产生假阳性或假阴性结果，建议在终止反应后立即比色。,4 钩状效应(Hook)影响,随着 ELISA 一步法的应用，在日常工作中会发现 HBsAg阴性而 HBeAg 阳性的现象，其原因就是当标本中的抗原浓度过高时产生的钩状效应(Hook)现象，从而出现假阴性造成真阳性的漏检，即随着被测物浓度增高反而显色减弱甚至不显色，往往造成假阴性结果，采用同步稀释测定或用线性范围高的乙肝六项定量法可以减少
16、Hook 效应的发生。,有学者认为大约 40%的人血清标本中含有非特异性干扰物质，可以不同程度影响检测结果，常见的干扰物质有：类风湿因子、补体、异嗜性抗体、治疗性抗体、溶菌酶、总蛋白浓度等，某些自身抗体都会影响结果造成假阳性。,5.干扰物质的影响,6 药物的影响,高效价的乙肝免疫球蛋白会与表面抗原形成复合物,影响 HBsAg 的检出,所以一些 HBsAg 阳性患者注射乙肝免疫球蛋白后,HBsAg 检测会呈阴性反应,导致乙肝两对半少见模式的出现。为预防乙肝，部分 HBsAg 阴性人群在接种乙肝疫苗后的 1 2 周内，血清中可检出 HBsAg 成分，形成一过性HBsAg 阳性，这可能是乙肝疫苗主要
17、成分是 HBsAg，建议接种乙肝疫苗后 1 个月内不应作 HBsAg 检测。总之,没有严格的室内质控,没有规范的操作规程,结果判定用肉眼而不用仪器,操作随意(如试剂自冰箱取出后不复温,温育时不封板,洗板后无扣板过程),试剂、仪器、器材(如微量移液器)质量差等。而对一些操作细节(如温育时间的控制)的忽视都可能导致结果的不同。乙肝六项检测必须排除各种影响因素的干扰，才能为临床提供正确可靠的检测依据。,乙肝表面抗原前S1,HBSAg前S1：1.主要存在于完整乙肝病毒表面,2.肝细胞膜上存在有前S1蛋白受体,3.诱导乙肝病毒吸附在肝细胞表面,4.促使病毒进入肝细胞内.,乙肝核心抗体临床意义,乙型肝炎核
18、心抗体是人体感染乙型肝炎病毒后第一个出现的抗体,是人体感染乙型肝炎病毒血清学标志物之一.乙型肝炎核心抗体又可分为乙型肝炎核心抗体IgM（抗HBc.IgM）和乙型肝炎核心抗体IgG(抗HBc.IgG)两种,前者随ALT升高而不断增长.大约在乙型肝炎病毒感染后1-2个月时,随者ALT升高而不断增长.大约在乙型肝炎病毒感染后1-2个月时,随之产生的便是乙型肝炎核心抗体IgG.目前认为,抗HBc.IgM是乙型肝炎病毒新近感染或持续复制的标志,这种抗体持续阳性提示疾病迁延,而抗HBc.IgG的持续存在只能说明以往有过乙型肝炎病毒感染.因此,乙型肝炎核心抗体IgM和IgG平行检测,有助于对急性乙型肝炎与隐
19、匿型乙型肝炎和乙型肝炎病毒携带者急性发作之间的鉴别.约有20%急性乙型肝炎病人的血清中查不到乙型肝炎表面抗原,而乙型肝炎核心抗体IgM可阳性,而且与病情变化相一致,病情恢复,乙型肝炎核心抗体IgM阴转.当病情重新活动时,ALT重新出现异常时,乙型肝炎核心抗体IgM亦重新出现阳性,滴度上升.所以说,乙型肝炎核心抗体IgM是用来评价乙型肝炎病情的较好指标,常见乙肝六项检验结果的解释,乙肝五项常见模式,1-过去和现在未感染过HBV。2-+(1)既往感染未能测出抗-HBs；(2)恢复期HBsAg已消，抗-HBs尚未出现；(3)无症状HBsAg携带着。3-+(1)既往感染过HBV；(2)急性HBV感染恢复期；3)少数标本仍有传染性。HBV感染已过；抗HBs出现前的窗口期,4-+-(1)注射过乙肝苗有免疫；（2)既往感染；假阳性。5-+-+急性HBV感后康复。6+-+(1)急性HBV感染；(2)慢性HBsAg携带者；(3)传染性弱。7-+-+既往感染，仍有免疫力。HBV感染，恢复期。,乙肝五项常见模式,乙肝五项常见模式,8+-+(1)急性HBV感染趋向恢复；(2)慢性HBsAg携带者；(3)传染性弱。即俗称的“小三阳”。9+-+-+急性或慢性乙型肝炎感染。提示HBV复制，传染强。即俗称的“大三阳”。,谢 谢！,
