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1、HPLC-UV-ESI-MS-TLC联用筛选乙酰胆碱酯酶抑制剂,目录,前言实验结果与讨论结语与展望,第一部分 前言,选题意义研究现状实验策略创新之处,1.1 选题意义,乙酰胆碱酯酶抑制剂是治疗老年性痴呆病的临床药物。本实验以合成的混合物为研究对象，把高效液相色谱法、质谱法以及薄层色谱法成功地应用于筛选乙酰胆碱酯酶抑制剂的合成产物，为寻找更多的药物信息提供了一种新的方法。,1.2 经典研究方法,先导药物,合成,分离提纯,测定生物活性,主要合成产物,副产物,易提纯体系,难提纯体系,经典方法的局限性：1)只适合易提纯体系；2)只注重主要合成产物的信息,？,？,1.3 实验策略,合成混合物,二维TLC
2、分离检测混合物,条件优化,最佳展开剂的确定,最小检测量的确定,测定抑制活力,HPLC定量,分离,定量,条件优化,pH的影响,离子对试剂的影响,三乙胺的影响,LC-MS定性,借助氢谱,结论,1.4 创新之处,合成产物的混合体系不经提纯直接进行筛选，特别适合难提纯体系对合成过程中的副产物进行筛选，从而获得更多有用信息实现了各种色谱方法的联用发展了多维薄层色谱法分离同分异构体，同时在薄层板上检测其生物活性,第二部分 实验,研究体系仪器试剂实验方法,2.1 研究体系,主要合成路线,氢谱图,质谱图,红外图谱,2.2 仪器,TLC aluminium sheets Silicagel 60 F254(me
3、rck公司）可调式移液器（Thermolabsystems,0.510L）1100型高效液相色谱仪（Aligent公司），配有二级管阵列检测器，化学工作站（Agilent ChemStation for LC 3D）液相质谱联用仪（Thermo Finigan公司），配有ESI离子源，化学工作站,2.3 主要试剂,乙酰胆碱酯酶抑制剂混合物（合成产物）乙酰胆碱酯酶（Sigma公司）氯化乙酰胆碱（Sigma公司）5，5二巯基双2硝基苯甲酸（Sigma公司）,2.4 实验方法,二维薄层色谱法分离测定抑制活力HPLC分离测定混合物LC-MS定性,展开剂体系,第一维：三氯甲烷：甲醇9：1；0.4 mL
4、0.1 mol/L的三乙胺甲醇溶液；0.3 mL 0.1 mol/L的HCl甲醇溶液；1.0 mL 10 mmol/L的十二烷基硫酸钠甲醇溶液。流动相走过的距离为5.3 cm；第二维：三氯甲烷：甲醇9：1，流动相走过的距离为8.0 cm两维之间的干燥时间：5 min,2.41 二维薄层色谱法分离混合物,2.42二维薄层色谱法测定抑制活力,取2.5 L 样品溶液点板，在二维展开剂体系展开。逐次喷上氯化乙酰胆碱溶液、DTNB溶液，待硅胶板干燥后喷上新鲜的酶液。5分钟后观察现象。分别配制20.05 mmol/L 的样品溶液，依照上述方法，测定该方法的最小检测量,实验结果,结论：用薄层色谱法可以鉴别出
5、具有抑制能力的化合物。同时，可以粗略地测出各种化合物的抑制能力的大小。,混合物经二维TLC的分离结果,最小检测量的测定结果 1：2 mmol/L 2:1 mmol/L 3:0.5 mmol/L 4:0.2 mmol/L 5:0.1 mmol/L 6:0.05 mmol/L,pH的影响,结论：在不加入其它改善剂时，随着pH值的变化，面积及保留时间几乎没有什么变化；但pH越大，造成的拖尾现象越严重。因而，小的pH有利于分离。,2.42高效液相色谱法分离测定混合物,条件优化,离子对试剂的影响,改变十二烷基苯磺酸钠溶液的浓度，按照同一梯度进行测定。观察其浓度对于分离的影响。结论：加入了离子对试剂后，各
6、组分由于分子的空间结构不同，从而在固定相上的保留不同，进而得以分离。我们采用的十二烷基苯磺酸钠的浓度为30 mmol/L,未加入三乙胺,100：2,100：4,100：6,结论：从上图可以看出三乙胺的加入可以改善峰型的拖尾。当1甲酸三乙胺100：4时，各种化合物已经基本达到分离；当继续增加三乙胺的量，分离又逐渐变差。本实验采用的1甲酸三乙胺的比例为100：4。,三乙胺的影响,色谱条件色谱柱：Hypersil ODS2 C18 4.6mm50mm 5um检测波长：426 nm流速：1 ml/min进样量：20L流动相：甲醇；1 甲酸三乙胺100：4；30 mmol/L十二烷基苯磺酸钠 采用以下淋
7、洗梯度进行分离测定,梯度淋洗,t/min A%B%D%0 20 78 2 6 20 78 2 8 20 65 1517 100 0 023 100 0 0其中，A为甲醇；B为1 甲酸三乙胺溶液；D为十二烷基苯磺酸钠溶液。,实验结果,混合物经HPLC的分离结果,HPLC三维色谱图,混合物中各种物质的相对含量,2.33 液相质谱确定分子结构,色谱条件：色谱柱：Hypersil BDS C18 2.1 mm50 mm 3 um 毛细管温度：350 喷射电压：3500 V辅气：鞘气进样量：20 L流动相：甲醇、1 甲酸,梯度条件,t/min A%B 0 5 95 6 10 90 12 70 30 25
8、 100 0,其中，A为甲醇；B为1 甲酸,实验结果,tr9.275 tr11.775,tr13.080 tr19.880，20.066,398,261,226,398,261,226,398,261,226,758,255,480,结论,其中，、分别为保留时间9.275、11.775、13.080、20.066所对应的结构式。而19.880的结构式有待进一步确定。,第三部分 实验结论,抑制能力最强的是和号化合物。,其次是、和号化合物，而这三者的抑制能力相似。,结语与展望,本实验成功地把各种色谱方法应用于合成产物的筛选中，进而提供更多的药物信息。如果能把该方法应用于天然产物的筛选，则对于寻找新药有着重大的意义。,致谢,本论文是在马志玲副教授直接指导下完成的。马老师悉心的指导，让我不仅学会了各种仪器的使用，还学会了她待人处世的态度和一丝不苟的敬业精神。借此机会，我对马老师表示最衷心的感谢！在实验的过程中，我同时得到了吴京洪老师的细心的指导和帮助。在此，我对吴老师表示衷心的感谢!在实验的过程中，我还得到了陆毅和庞朝乐师兄的热心帮助。在此，我对他们表示衷心的感谢！另外，本论文的顺利完成和何文蔚、杨欣卉等同学的配合与帮助是分不开的，在此作一并致谢！,谢谢大家!,
