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1、实验设计,乙酰胆碱酯酶抑制剂活性研究,大纲,一、研究背景；二、研究内容；三、实验材料及方法；四、实验数据分析；四、后续工作展望。,一、研究背景,乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase,AChE)及其抑制剂 乙酰胆碱酯酶在人体中主要存在于神经肌肉组织的突触后膜上,已知其主要功能是催化乙酰胆碱的分解,在胆碱能神经纤维的信号传导中扮演重要角色。乙酰胆碱酯酶催化乙酰胆碱的分解，直接造成神经信号传递失败,引起老年痴呆症。AChE抑制剂 AChE抑制剂可竞争性或非竞争性的抑制乙酰胆碱酯酶的活性，使得乙酰胆碱正常释放，神经冲动正常进行，可起到治疗老年痴呆症的作用。,二、研究内容,1.实验模型
2、：硫代乙酰胆碱(ATch)在乙酰胆碱酯酶(AChE)作用下分解,生成硫代胆碱,硫代胆碱与显色剂二硫代二硝基苯甲酸（DTNB)迅速作用,生成在412 nm处有光吸收的黄色物质,在酶催化反应的稳态阶段其 OD 值即可代表起始反应速率。2.AChE抑制剂对AChE IC50值的测定(IC50:即抑制率为50%时的抑制剂浓度).3.样品中AChE抑制剂对AChE的抑制类型研究。,三、实验材料及方法,实验主要仪器、试剂 1.仪器：分光光度计 2.主要试剂：乙酰胆碱酯酶(AChE);50mmol/L、pH8.0的PBS;15 mmol/L二硫二硝基苯甲酸(DTNB)溶液(用50mmol/L,pH8.0PB
3、S配制),15 mmol/L 硫代乙酰胆碱(Acetylthiocholine,ATch,用50 mmol/L,pH8.0 PBS配制),4%十二烷基硫酸钠(SDS)等。,三、实验材料及方法,试验方法,三、实验材料及方法,1.样品提纯及处理。提取样品后，烘干后，用PBS缓冲液定容到终浓度10 mg/L。2.通过实验选择适当底物浓度范围。,反应体系中的酶量为120 L 15 mM/3 mL。通过一系列的底物浓度，确定最适浓度范围。,三、实验材料及方法,3.硫代乙酰胆碱标准曲线的绘制。分别吸取20，40，60，80，100，120 L 15 mM 硫代乙酰胆碱标准液，加入等量显色剂二硫二硝基苯甲酸
4、（DTNB)，以PBS缓冲液定量至3 mL测定412 nm处吸光值。横轴为5 mL测试液中硫代乙酰胆碱微摩尔数，纵轴为吸光值，绘制标准曲线。（用于后面的浓度定量。）,三、实验材料及方法,4.AChE抑制剂对AChE IC50值的测定 2.65 mLPBS(pH 8.0),50L 乙酰胆碱酯酶(0.85 U/mL),100 L 15 mM DTNB 和样品溶液100L加入试管，37 预热 2 min，然后加入100 L15 mM 硫代乙酰胆碱（起始浓度是0.5 mM），在 37 保温 20 min 后立即加入1 mL 0.4SDS 终止反应，将所得溶液立即在412nm下测量吸光值并根据下式计算抑
5、制率：抑制率()=A对照-(A 样品-A 样品空白)/A对照100。按照公式计算抑制率，以横坐标为酶促反应体系中抑制剂的浓度，纵坐标为抑制率，绘制曲线，计算其抑制率为50%时的抑制剂浓度，即为IC50。,三、实验材料及方法,5.抑制剂对乙酰胆碱酯酶抑制类型的确定（1）抑制作用是否可逆 在酶促反应体系中加入不同浓度的酶液，加入一定量抑制剂，以酶浓度为横坐标，以初速度为纵坐标，绘制曲线。根据曲线形态判断抑制作用是否可逆。（2）抑制动力学常数的测定及类型判定 以不同浓度的硫代乙酰胆碱为底物，加入一定量抑制剂或不加抑制剂，测定反应速度。采用Lineweaver-Burk双倒数作图法和Dixon作图法，
6、确定抑制动力学常数并判断抑制类型。,四、实验数据分析,可逆抑制，判断其抑制类型。竞争性抑制?or非竞争性抑制?or反竞争性抑制?,四、实验数据分析,米氏方程,判断可逆不可逆,四、实验数据分析,四、实验数据分析,四、实验数据分析,四、实验数据分析,二、研究内容,Dixon作图法求Ki,只要以I为横坐标，以1/v为纵坐标，采用1个以上的S，给出不同S时的直线，由这些直线的交点即可求得Ki.,四、实验数据分析,五、后续工作展望,阿尔茨海默病(Alzheimerps disease,AD)又称早老性痴呆(presenile dementia),是发生于老年和老年前期以进行性痴呆为特征的大脑退形性病变。
7、老年人中AD的发病率较高。随着我国人民生活水平的不断提高和健康卫生事业的不断发展,不少城市的人口老龄化现象日益严重,如北京、上海等地,60岁以上人群中就约有5%AD患者。AD的临床表现为进行性认知功能减退,并伴随行为障碍及情绪异常等,直至生活不能自理。其发病率和死亡率较高,故AD日益成为当前老年医学面临的最为严峻的问题之一。AD病人的胆碱能系统受到损害导致突触部位乙酰胆碱含量降低,从而使病人的学习和记忆能力丧失。因此针对提高AD病人脑中的乙酰胆碱含量,促进胆碱能神经功能的药物不断出现,尤其是乙酰胆碱酯酶抑制剂类药物的研究倍受关注.,五、后续工作展望,化学结构鉴定提纯工艺优化探索化学合成方法医药开发相关指标测评作为食品添加剂相关测评,THANK YOU!,
