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1、乳糖操纵元(lac operon),内容提要：乳糖操纵元的结构酶的诱导lac体系受调控的证据乳糖操纵元调控模型影响因子,一、乳糖操纵元的结构,i基因 P O lacZ lacY lacA,代谢激活蛋白结合位点,乳糖操纵元的结构,图 Lac操纵元及各组分详图,乳糖操纵元的结构,1)结构基因：分解乳糖的三种酶，使乳糖分解，产生能量。2)操纵基因3)启动子4)CAP5)i基因：上游，产生阻遏物。,结构基因,lacZ编码-半乳糖苷酶：将乳糖水解成葡萄糖和半乳糖lacY编码-半乳糖苷透过酶：使外界的-半乳糖苷（如乳糖）能透过大肠杆菌细胞壁和原生质膜进入细胞内。lacA编码-半乳糖苷乙酰基转移酶：乙酰辅酶
2、A上的乙酰基转到-半乳糖苷上，形成乙酰半乳糖。,Two physiologically important reactions catalyzed by-galactosidase,2003 John Wiley and Sons Publishers,异乳糖,一些化学合成的乳糖类似物，不受-半乳糖苷酶的催化分解，却也能与R特异性结合，使R构象变化，诱导lac操纵元的开放。例如异丙基硫代半乳糖苷(isopropylthiogalactoside,IPTG)就是很强的诱导剂，不被细胞代谢而十分稳定。X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-半乳糖苷)也是一种人工化学合成的半乳糖苷，可被-半乳糖苷酶水
3、解产生兰色化合物，因此可以用作-半乳糖苷酶活性的指示剂。IPTG和X-gal（分子式见图）都被广泛应用在分子生物学和基因工程的工作中。,如果某种物质能够促使细菌产生酶而本身又不被分解，这种物质被称为义务诱导物，如IPTG（异丙基-D-硫代半乳糖苷）。,义务诱导物(gratuitous inducer)：,IPTG,二、酶的诱导lac体系受调控的证据,乳糖操纵元的双调控系统：(1)受乳糖与阻遏蛋白调控的、可诱导的负调控系统;(2)受cAMP与CAP调节的、可诱导的正调控系统。葡萄糖通过调节cAMP的合成间接监控这一过程。以此保证大肠杆菌灵活、经济、有效地适应外界环境，只有在必需的时候（只有乳糖，
4、没有葡萄糖）才启动乳糖操纵子的表达。,三、乳糖操纵元调控模型,（一）阻遏蛋白的负性调节：（分解代谢）可诱导调控（二）CAP的正性调节（三）协调调节,（一）阻遏蛋白的负性调节（分解代谢）可诱导调控,1、乳糖操纵元调控模型主要内容2、阻遏蛋白的负性调节：（分解代谢）负控诱导,1、乳糖操纵元调控模型主要内容,Z、Y、A基因的产物由同一条多顺反子的mRNA分子所编码。该mNA分子的 启动区（P）位于阻遏基因（I）与操纵区（O）之间，不能单独起始半乳糖苷酶和透过酶基因的高效表达；操纵子(operater)是DNA上的一小段序列（仅为26bp），是阻遏物的结合位点。当阻遏物与操纵基因结合时，lac mRN
5、A的转录起始受到抑制。,诱导物通过与阻遏物结合，改变它的三维构象，使之不能与操纵基因结合，从而激发lac mRNA的合成。当有诱导物存在时，操纵基因区没有被阻遏物占据，所以启动子能够顺利起始mRNA的合成。,乳糖操纵元调控模型主要内容：,Repressor and RNA polymase bind at site that overlap aroud the startpoint of the lac operon,GC,操纵位点的回文序列,Center of symmetry,图 当无诱导物时阻遏物结合在操纵基因上,图 诱导物和阻遏物成为调节操纵元的开关,2、阻遏蛋白的负性调节：（分解代谢
6、）负控诱导,1)无乳糖存在时，阻遏物可以结合在操纵基因上阻止转录过程基因关闭2)有乳糖存在时，乳糖与阻遏物结合阻遏物变构阻遏物不能结合操纵基因转录进行基因开放,可诱导调控的操纵元，其基因表达产物都是利用某种营养物的酶体系（分解代谢）有营养物 相应基因开放 无营养物 细胞就没必要产生相应的酶,1调控机理：CAP：Catabolite activator protein，分解代谢活化剂蛋白，由活化剂基因(A)编码。也叫环腺苷酸受体蛋白(cAMPreceptorprotein,CRP)。,（二）CAP的正性调节,cAMP：Cyclic AMP,ATP在腺苷酸环化酶的作用下转变成环腺苷酸(cyclic
7、 adenosine monophosphate,cAMP)。,The adenyl cyclase-catalyzed synthesis of cyclic AMP(cAMP)from ATP,2003 John Wiley and Sons Publishers,CAP有2种状态：,无活性态：CAP未与cAMP结合时是没有活性的，不能与特定的DNA序列结合。活性态：CAP与cAMP结合后，发生空间构象的变化而活化，能以二聚体的方式与特定的DNA序列结合，从而增强RNA聚合酶的转录活性，可使转录提高50倍。,在lac操纵元的启动子Plac上游端有一段与Plac部分重叠的序列，能与CAP特异
8、结合，称为CAP结合位点(CAPbindingsite)。,（二）CAP的正性调节,在什么条件下cAMP能够与CAP结合呢？,当葡萄糖浓度高时，cAMP浓度降低，CAP不能被活化，lac操纵元的结构基因表达下降（如下图）。当葡萄糖浓度低时，cAMP浓度升高，CAP被活化，lac操纵元的结构基因表达上升（如下图）。,2、CAP正调控的意义,葡萄糖、乳糖同时存在时，葡萄糖先利用1）有葡萄糖存在时，cAMPcAMP-CAP，不能结合CAP位点上，正调控作用乳糖操纵元不能表达。（虽然有乳糖存在，乳糖操纵元不开放基因）,2）无葡萄糖存在时，cAMPcAMP-CAP正调控作用基因表达。CAP正调控的意义在
9、于保证经济有效地利用碳源。对lac操纵元来说CAP是正性调节因素，lac阻遏蛋白是负性调节因素。两种调节机制之间是何种关系呢？,CAP和lac阻遏蛋白两种调节机制根据存在的碳源性质及水平协调调节lac操纵元的表达。当阻遏蛋白封闭转录时，CAP对该系统不能发挥作用如无CAP存在，即使没有阻遏蛋白与操纵序列结合，操纵元仍无转录活性。cAMPCAP复合物与启动子区的结合是转录起始所必需的。,（三）协调调节,单纯乳糖存在时，细菌利用乳糖作碳源；若有葡萄糖或葡萄糖/乳糖共同存在时，细菌首先利用葡萄糖。葡萄糖对 lac 操纵元的阻遏作用称为分解代谢阻遏(catabolic repression)。,The
10、 Lac Operon:When Glucose Is Present But Not Lactose,RNAPol.,Hey man,Im constitutive,Come on,let me through,No wayJose!,The Lac Operon:When Lactose Is Present But Not Glucose,Lac,This lactose has bent me out of shape,RNAPol.,Yipe!,Bind to mePolymerase,The Lac Operon:When Neither Lactose Nor Glucose I
11、s Present,Bind to mePolymerase,RNAPol.,STOPRight therePolymerase,Alright,Im off to the races.,Come on,let me through!,四、影响因子,1、lac操纵元的本底水平表达2、大肠杆菌对乳糖的反应3、阻遏物lac I基因产物及功能4、葡萄糖对lac操纵元的影响5、cAMP与代谢物激活蛋白(P239),1、lac操纵元的本底水平表达,有两个矛盾是操纵元理论所不能解释的：诱导物需要穿过细胞膜才能与阻遏物结合，而转运诱导物需要透过酶，后者的合成又需要诱导物诱导。解释：一些诱导物可以在透过酶不存
12、在时进入细胞？一些透过酶可以在没有诱导物的情况下合成？,真正的诱导物是异构乳糖而非乳糖，前者是在-半乳糖甘酶的催化下由乳糖形成的，因此，需要有-半乳糖甘酶的预先存在。解释：本底水平的组成型合成：非诱导状态下有少量的lac mRNA合成。,2、大肠杆菌对乳糖的反应,培养基：甘油 按照lac操纵元本底水平的表达，每个细胞内有几个分子的-半乳糖苷酶和-半乳糖苷透过酶；培养基：加入乳糖：,透过酶,进入细胞,-半乳糖苷酶,异构乳糖,诱导,lac mRNA的生物合成,大量乳糖进入细胞,多数被降解为葡萄糖和半乳糖（碳源和能源）,异构乳糖,少量乳糖,透过酶,乳糖,H,图 乳糖分解的不同产物,诱导物的加入和去除
13、对lac mRNA的影响,Induced level,Add Inducer,Remove Inducer,3、阻遏物lac I基因产物及功能,Lac 操纵元阻遏物mRNA是由弱启动子控制下组成型合成的，每个细胞中有5-10个阻遏物分子。当I基因由弱启动子突变成强启动子，细胞内就不可能产生足够的诱导物来克服阻遏状态，整个lac操纵元在这些突变体中就不可诱导。,强启动子区,4、葡萄糖对lac操纵元的影响,如果将葡萄糖和乳糖同时加入培养基中，lac操纵元处于阻遏状态，不能被诱导；一旦耗尽外源葡萄糖，乳糖就会诱导lac操纵元表达分解乳糖所需的三种酶。代谢物阻遏效应,5、cAMP与代谢物激活蛋白(P2
14、39),细菌中的cAMP含量与葡萄糖的分解代谢有关：当细菌利用葡萄糖分解供给能量时，cAMP生成少而分解多，cAMP含量低；相反，当环境中无葡萄糖可供利用时，cAMP含量就升高。,ATP,腺甘酸环化酶,cAMP（环腺苷酸）,大肠杆菌中：无葡萄糖，cAMP浓度高；有葡萄糖，cAMP浓度低,无葡萄糖，cAMP浓度高时促进转录,有葡萄糖，cAMP浓度低时不促进转录,CAP,CAP,CAP的正调控,9.4 色氨酸操纵元（trp operon）,内容提要：色氨酸操纵元的结构色氨酸操纵元的阻遏系统色氨酸操纵元的弱化机制,一、色氨酸操纵元的结构,色氨酸是构成蛋白质的组分。一般的环境难以给细菌提供足够的色氨酸
15、，细菌要生存繁殖通常需要自己经过许多步骤合成色氨酸。但是一旦环境能够提供色氨酸时，细菌就会充分利用外界的色氨酸、减少或停止合成色氨酸，以减轻自己的负担。细菌所以能做到这点是因为有色氨酸操纵元(trpoperon)的调控。,调控基因 结构基因 催化分枝酸转变为色氨酸 的酶,一、色氨酸操纵元的结构,trpR,trpR,P,Leader前导序列,(1)trpR和trpABCDE不连锁；(2)操纵基因在启动子内(3)有衰减子(attenuator)/弱化子(4)启动子和结构基因不直接相连，二者被 前导序列(Leader)所隔开,色氨酸操纵元的特点,二、trp 操纵元的阻遏系统,低Trp时：阻遏物不结合
16、操纵基因;高Trp时：阻遏物+Trp 结合操纵基因,trp 操纵元的阻遏系统,trpR,trp,trpR,P,调控基因 结构基因 催化分枝酸转变为色氨酸 的酶,三、trp 操纵元的弱化机制,衰减子（attenuator）/弱化子前导序列（leader sequence）,现象：实验观察表明：当色氨酸达到一定浓度，但还没有高到能够活化R使其起阻遏作用的程度时，产生色氨酸合成酶类的量已经明显降低，而且产生的酶量与色氨酸浓度呈负相关。机制：仔细研究发现这种调控现象与色氨酸操纵元特殊的结构有关。,1、弱化子：DNA中可导致转录过早终止的一段核苷酸序列（123-150区）。,123150,Attenua
17、tor sequence,研究引起终止的mRNA碱基序列，发现该区mRNA通过自我配对可以形成茎-环结构，有典型的终止子特点。,图 trp弱化子mRNA的终止区,2、前导序列：在trp mRNA5端trpE基因的起始密码前一个长162bp的mRNA片段。,3、弱化机制（P244）,a),如果当其他氨基酸短缺(注意：短开放读框编码的14肽中多数氨基酸能由环境充分供应的机会是不多的)或所有的氨基酸都不足时，核糖体翻译移动的速度就更慢，甚至不能占据1的序列，结果有利于1和2、3和4发夹结构的形成，于是RNA聚合酶停止转录，等于告诉细菌：“整个氨基酸都不足，即使合成色氨酸也不能合成蛋白质，不如不合成以
18、节省能量”。,b)Low tryptophan levels,当色氨酸浓度低时，生成的tRNAtrp就少，核糖体在序列1的trp密码子处暂停，序列2和3之间形成配对结构，阻止了衰减，因为序列3不再与序列4之间形成衰减结构，RNA聚合酶得以沿DNA前进，继续去转录其后trpE等基因，trp操纵元就处于开放状态。,当色氨酸浓度增高时，tRNAtrp浓度随之升高，核糖体快速翻译序列1(前导肽阅读框)，占据到2的机会增加，1和2生成发夹结构的机会减少，3和4形成类似终止子的衰减子结构的机会增多，导致RNA聚合酶终止转录。,c)High tryptophan levels,前导肽,转录终止结构,细菌通过
19、弱化作用弥补阻遏作用的不足，因为阻遏作用只能使转录不起始，对于已经起始的转录，只能通过弱化作用使之中途停下来。阻遏作用的信号是细胞内色氨酸的多少；弱化作用的信号则是细胞内载有色氨酸的tRNA的多少，它通过前导肽的翻译来控制转录的进行。在细菌细胞内这两种作用相辅相成，体现着生物体内周密的调控作用。,在trp操纵元中，对结构基因的转录，阻遏蛋白的负调控起到粗调的作用，而衰减子起到细调的作用。细菌其他氨基酸合成系统的许多操纵元(如组氨酸、苏氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸等操纵元)中也有类似的衰减子存在。,其他操纵元,一、半乳糖操纵元二、阿拉伯糖操纵元,一、半乳糖操纵元(galactose oper
20、on),异构酶(galE)乳糖-磷酸尿嘧啶核苷转移酶(galT)半乳糖激酶(galk)。,gal操纵元的结构,gal操纵元的特点：,它有两个启动子，其mRNA可从两个不同的起始点开始转录；它有两个O区，一个在P区上游，另一个在结构基因galE内部。,二、阿拉伯糖操纵元（arabinose operon),araB基因、araA基因和araD,形成一个基因簇，简写为araBAD 三个基因的表达受到ara操纵元中araC基因产物AraC蛋白的调控。,ara操纵元的调控有两个特点：,第一，araC表达受到AraC的自身调控。第二，AraC既是ara操纵元的正调节蛋白（需cAMP-CRP的共同参与，起始转录），又是其负调节蛋白。这种双重功能是通过AraC蛋白的两种异构体来实现的（Pi和Pr)。,
