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1、专题2微生物的培养与应用,课题1微生物的实验室培养,.微生物的类群,微生物,原核类:,真核类,非细胞类：,细菌、支原体、衣原体、放线菌、蓝藻,个体微小、结构简单,酵母菌、霉菌、食用菌,真菌：,原生生物：,显微藻类、原生生物（如：草履虫、变形虫等）,病毒、类病毒、朊病毒,微生物的共同特点：,一.微生物基础知识,1.细菌的形态,拟核，大型环状DNA,质粒(小型环状DNA，含抗生素，抗药性，固氮基因),其成分为肽聚糖,2.细菌的结构,芽孢,有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形的休眠体，叫做芽孢。芽孢的壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力。（抗逆性极强）注：不是繁殖体,例如，
2、有的细菌的芽孢，煮沸3小时以后才死亡。芽孢又小又轻，可以随风飘散。当环境适宜（如温度、水分适宜）的时候，芽孢又可以萌发，形成一个细菌.,细菌主要是以二分裂的方式进行增殖（如右图）,3.细菌的繁殖,4.细菌的菌落,.定义：,单个或者少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，会形成一个肉眼可见的、具有一定形态结构的子细胞群体，叫做菌落。,.特征：,大小、形状、光泽度、颜色、硬度、透明度等。,.功能：,每种细菌在一定条件下所形成的菌落，可以作为菌种鉴定的重要依据。,几种菌落及其形态,几种菌落及其形态,5.病毒的结构,:由核酸和蛋白质构成。,病毒的结构,吸附,注入,合成,释放,组装,6.病毒的繁殖,病毒的增殖
3、一般可分五个阶段，即：吸附注入核酸合成核酸和蛋白质组装释放,6.病毒的营养方式,：寄生,培养微生物需要解决的两个问题是什么？,1、为微生物提供合适的营养条件和环境 条件2、防止杂菌的入侵,培养基、培养条件,无菌技术(获得纯净培养物关键）,思考:,微生物需要的五大类营养要素物质是：,.微生物需要的营养物质及功能,1.碳源 2.氮源 3.生长因子 4.无机盐 5.水,1.碳源：,为微生物提供碳元素。,2.氮源:,N2,NH3等,有机物中的氮（还有尿素）,无机氮,牛肉膏、蛋白胨,为微生物提供氮元素。,氨盐、硝酸盐等是常用的氮源氮源主要用于合成蛋白质、核酸以及含氮的代谢产物,自养型微生物与异养型微生物
4、的培养基的主要差别是()A碳源 B氮源 C无机盐 D特殊营养物质,A,3.生长因子,.常见的生长因子：,.概念：,.作用：,微生物生长不可缺少的微量有机物。,酶和核酸的组成成分。,维生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶等。一些天然物质如酵母膏、蛋白胨、动植物组织提取液等可为微生物提供生长因子,（4）来源：,注意：,最常用的碳源是糖类，尤其是葡萄糖最常用的氮源是铵盐、硝酸盐对异养生物而言，含C、H、O、N的化合物既是碳源，有时氮源，如蛋白质之所以补充生长因子，是由于缺少合成这些物质的酶或合成能力有限,思考：,C,（三）培养基,培养基（培养液）是由人工方法配制而成的，专供微生物生长繁殖使用的混合营养液。,1.
5、培养基的类型及用途,按物理性质分,是,是,否,分离、计数等,观察微生物的运动、鉴定菌种等,工业生产,固体培养基：菌落,半固体培养基：,无动力 有动力(弥散),液体培养基：,表面生长,均匀混浊生长,沉淀生长,按化学成分分,否,是,主要用于工业生产,分类、鉴定,按培养基的功能（用途）分,加入某种化学物质,加入某种试剂或化学药品,依据某些微生物对某些物质的抗性,依据微生物的代谢产物与特定试剂或化学药品反应，产生明显的特征变化,从众多微生物中分离所需的微生物,鉴别不同种类的微生物,加入青霉素分离得到酵母菌和霉菌,伊红和美蓝培养基可鉴别大肠杆菌,选择培养基,加入青霉素的培养基加入高浓度食盐的培养基 不加
6、氮源的无氮培养基不加含碳有机物的无碳培养基,分离酵母菌、霉菌等真菌,分离金黄色葡萄球菌,分离固氮菌,分离自养型微生物,（三）培养基,（1）按物理状态分：（2）按功能分：（3）按成分分：,总结：1.培养基的类型,2.不同的微生物往往需要采用不同的培养基配方,不管哪种培养基，一般都含有水、无机盐、碳源和氮源等营养物质，另外还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的要求,3.培养基的成分,血清中含有：多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等）多种金属离子；激素；促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等。各种生长因子转移蛋白不明成分,人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充
7、一定量的天然培养基（如血清）。,（四）无菌技术,1.无菌技术的概念,无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。,成功地培养微生物的关键。,2.消毒与灭菌的概念及两者的区别,3.常用的消毒与灭菌的方法,煮沸消毒法：100煮沸5-6min。巴氏消毒法：70-75下煮30min或 80下煮15min。化学药剂消毒法：用75%酒精、新洁尔灭等进行皮肤消毒；氯气消毒水源。紫外线消毒。,消毒的方法：,3.常用的消毒与灭菌的方法,（1）日常生活经常用到的是 煮沸 消毒法；（2）对一些不耐高温的液体，则使用 巴氏 消毒法（例如牛奶）；（3）对接种室、接种箱或超净工作台首先喷洒 石炭酸或煤酚皂
8、等溶液以增强消毒效果，然后使用 紫外线 进行物理消毒。（4）实验操作者的双手使用 酒精 进行消毒；（5）饮水水源用 氯气 进行消毒。,消毒的方法,1、灼烧灭菌,灭菌的方法：,接种环、接种针、试管口等的灭菌,2、干热灭菌：160-170 下加热1-2h。3、高压蒸气灭菌：100kPa、121 下维持15-30min.,如玻璃器皿、金属用具等的灭菌,如培养基、无菌水等的灭菌,高压蒸气灭菌的原理是（）A高压使细菌DNA变性 B高压使细菌蛋白质凝固变性 C高温烫死细菌 D高温使细菌DNA变性,B,灭菌的方法：1、灼烧灭菌2、干热灭菌3、高压蒸气灭菌4、紫外线灭菌如表面灭菌和空气灭菌等，所 用器械是 紫
9、外灯。,关于灭菌和消毒的不正确的理解是A消毒和灭菌实质上是相同的 B灭菌是指杀死环境中的一切微生物 的细胞、芽孢和孢子C接种环用烧灼的方法灭菌 D常用灭菌方法有加热法、过滤法、红外线法、化学药品法,A,1.无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？,2.请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。（1）培养细菌用的培养基与培养皿（2）玻棒、试管、烧瓶和吸管（3）实验操作者的双手,答：无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。,答：（1）、（2）需要灭菌；（3）需要消毒。,旁栏思考,二、微生物实验室培养的基本操作程序,1、器具的灭菌2、培
10、养基的配制3、培养基的灭菌4、倒平板5、微生物接种6、恒温箱中培养7、菌种的保存,涂布器,接种环,接种针,a.制备牛肉膏蛋白胨培养基（用于培养细菌）,配方：,1计算、称量2溶化3调pH：pH764过滤：这一步可以省去。5分装：分装过程中注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。分装三角烧瓶的量以不超过三角烧瓶容积的一半为宜。6加塞7包扎,操作步骤,8灭菌:将50ml培养基用玻棒转移至三角锥瓶中，塞上棉花塞，包上牛皮纸，再放入高压蒸气灭菌锅，在压力为100kPa、温度为121，灭菌1530min。将培养基用旧报纸包裹，放入干热灭菌箱内，在160170 下灭菌2h。9倒平板:待培养
11、基冷却到50 左右时，在酒精灯附近倒平板。（倒平板操作见课本）2d后观察平板，无杂菌污染才可用来接种.10无菌检查：将灭菌的培养基放入37的温室中培养2448小时，以检查灭菌是否彻底。,倒平板操作,1.无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？,2.请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。培养细菌用的培养基与培养皿玻棒、试管、烧瓶和吸管实验操作者的双手,答：无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。,答：（1）、（2）需要灭菌；（3）需要消毒。,答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板
12、了。,2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？,答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。,问题讨论,1.培养基灭菌后，需要冷却到50 左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？,3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？,4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？,答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。,答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。,b.纯化
13、大肠杆菌,接种方法有：平板划线法和稀释涂布平板法,微生物的接种技术：,接种方法有：平板划线法和稀释涂布平板法,平板划线法:通过接种环在琼脂固体培养基表面连续画线的操作,将聚集的菌钟逐步稀释分散到培养基的表面.在数次画线后,可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体,这就是菌落.,平板划线的操作,1.接种环只蘸一次菌液,但要在培养基不同位置连续划线多次.2.划线首尾不能相接3.划线后,培养皿倒置培养,划线分离法注意事项:,其他画线分离图：,答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线
14、时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。,问题讨论,1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？,2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？,答：以免接种环温度太高，杀死菌种。,3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？,答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，
15、最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。,稀释涂布平板的操作方法,答：应从操作的各个细节保证“无菌”。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围等等。,问题讨论,涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第2步应如何进行无菌操作？,微生物的恒温培养,微生物的恒温培养,微生物的恒温培养,伊红美蓝培养基是鉴别培养基，可以用来检测自来水中的大肠杆菌是否超标，因为的代谢产物与伊红美蓝结合，使菌落呈黑色并带有金属光泽，使大肠杆菌的菌落显示出来，并没有促进大肠杆菌的生长和抑制其他微生物的生长。,例如：鉴别大肠杆菌培养基,大肠杆
16、菌呈黑色中心,有或无金属光泽,菌种的保存,1、临时保藏：接种到固体斜面培养基，菌落长成后置于4冰箱保存。2、长期保存：甘油冷冻管藏法,结果分析与评价,.培养基的制作是否合格如果未接种的培养基在恒温箱中保温12d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。.接种操作是否符合无菌要求如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合大肠杆菌菌落的特点，则说明接种操作是符合要求的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中，无菌操作还未达到要求，需要分析原因，再次练习。.是否进行了及时细致的观察与记录培养12h与24h后的大肠杆菌菌落的大小会有明显不同，及时观察记录的同学会发现
17、这一点，并能观察到其他一些细微的变化。,本课题知识小结:,【典例解析】,例:关于微生物营养物质的叙述中，正确的是()A.是碳源的物质不可能同时是氮源 B.凡碳源都提供能量 C.除水以外的无机物只提供无机盐 D.无机氮源也能提供能量,解析：不同的微生物，所需营养物质有较大差别，要针对微生物的具体情况分析。对于A、B选项，它的表达是不完整的。有的碳源只能是碳源，如二氧化碳；有的碳源可同时是氮源，如NH4HCO3；有的碳源同时是能源，如葡萄糖；有的碳源同时是氮源，也是能源，如蛋白胨。对于C选项，除水以外的无机物种类繁多，功能也多样。如二氧化碳，可作为自养型微生物的碳源；NaHCO3，可作为自养型微生
18、物的碳源和无机盐；而NaCl则只能提供无机盐。对于D选项，无机氮源提供能量的情况还是存在的，如NH3可为硝化细菌提供能量和氮源。,D,例2：下面对发酵工程中灭菌的理解不正确的是()A.防止杂菌污染 B.消灭杂菌 C.培养基和发酵设备都必须灭菌 D.灭菌必须在接种前,解析：灭菌是微生物发酵过程的一个重要环节。A说的是灭菌的目的，因为发酵所用的菌种大多是单一的纯种，整个发酵过程不能混入其他微生物（杂菌），所以是正确的；B是错误的，因为灭菌的目的是防止杂菌污染，但实际操作中不可能只消灭杂菌，而是消灭全部微生物。C是正确的，因为与发酵有关的所有设备和物质都要灭菌；发酵所用的微生物是灭菌后专门接种的，灭菌必须在接种前，如果接种后再灭菌就会把所接菌种也杀死。,B,例3右表是某微生物培养基成分，请据此回答：（1）右表培养基可培养的微生物类型是。（2）若不慎将过量NaCl加入培养基中。如不想浪费此培养基，可再加入.（提示：金黄色葡萄球菌具耐盐性）,自养型微生物,含碳有机物,（3）若除去成分，加入（CH2O），该培养基可用于培养。（4）表中营养成分共有 类。（5）不论何种培养基，在各种成分都溶化后分装前，要进行的是。,固氮微生物,3,调整pH,（6）右表中各成分重量确定的原则是。（7）若右表培养基用于菌种鉴定，应该增加的成分。,依微生物的生长需要确定,琼脂（或凝固剂）,
