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1、亲子鉴定的基本原理和方法,荣 媛武汉大学中南医院检验科&法医司法鉴定所,2,亲子鉴定发展概况,不科学,3,亲子鉴定与遗传标记,亲子鉴定：应用生物学技术方法来检测遗传标记，并依据遗传学理论进行分析，从而对被检者之间是否存在生物学亲缘关系所作的科学判定，实质是一种特殊的个体识别,血液细胞表面的标记血液蛋白质的标记,蛋白质标记,DNA标记,限制性酶切片段多态性 DNA长度多态性（微卫星STR）DNA序列多态性,4,蛋白标记：红细胞ABO,Ph,MN,Kell,Duffy,P等21个血型系统 白细胞HLA-A，-B，-C，-D，-DP，-DQ，-DR,DNA标记：RFLP，VNTR，STR，SNP,蛋
2、白标记：血清型 Hp，Gc,Bf,Tf,C2,酶型 PGM，EsD，ACP，GPT,遗传标记分类,5,蛋白质遗传标记（血型检查）,由等位基因决定的红细胞表面抗原的差异，为最早用于亲子鉴定的遗传标记，有ABO、MN、P、Rh等21个血型系统。特点：遗传性状简单，符合孟德尔遗传规律遗传多态性，不易受年龄、性别、疾病影响操作简单、重复性好，结果明确,6,ABO血型检查,人的ABO血型是受A,B,O三个复等位基因控制的，O为隐性基因，A、B为显性基因。决定ABO血型的基因型AO,AA,BO,BB,OO,AB等6种，表现型有4种：A型、B型、AB型和O型；根据孟德尔遗传规律，即可计算出孩子的可能血型的概
3、率。,7,红细胞ABO血型检查,孩子的血型不是唯一确定的 除了A型血与B型血的人婚配外，其他血型组合都有概率为0的不可能事件,只能否定,8,蛋白质遗传标记检测的局限性,对检材需要量大，且对时限要求较高，蛋白质容易失活而得不到理想的结果，不适用于陈旧、微量检材（HLA分型要求采血后16-24小时内必须检验）多态性信息含量有限，鉴别能力有限，只能用于父权排除，准确率较低，不宜用于父权肯定和同一认定存在有生理或病理性变异（如：A，O型血的人受大肠杆菌感染后B抗原的检测可能呈阳性）,9,DNA分子遗传标记的检测,DNA指纹技术（RFLP）：第一代遗传标记PCR分型技术：第二、三代遗传标记的检测(微卫星
4、STR位点和单核苷酸多态性SNP),线粒体DNA SNP,核内染色体 STR,10,1985 英国 Jefferys Nature人源小卫星 DNA 用作基因探针，同人体核 DNA 的酶切片段杂交，获得了由多个位点上的等位基因组成的长度不等的杂交带图纹，这种图纹极少有两个人完全相同，故称为 DNA指纹 实验程序：基因组DNA的提取 限制性内切酶消化酶切 电泳分离 印迹转移 探针制备和标记 分子杂交和自显影,DNA指纹技术（RFLP）,11,DNA指纹技术（RFLP）,实验结果（DNA指纹图谱）：优点：群体多态性高，稳定遗传，孟德尔遗传缺点：操作繁琐、对检材的质、量要求较高、灵敏度低、没有种属特
5、异性,12,PCR分型技术（现代DNA亲子鉴定方法）,PCR扩增序列多态性标记（PCR-SNP分析）,PCR扩增长度多态性标记（PCR-STR分型）,优点：快速、简便、灵敏、特异，适用于微量陈旧的生物学检材,13,TAGA,TAGA,TAGA,TAGA,TAGA,TAGA,1 2 3 4 5,微卫星DNA，简短串联重复（STR）是一种广泛分布在人类基因组中具有长度多态性的DNA序列。由2-6bp的核心序列头尾相连串联重复构成，通常重复4-60次不等（串珠结构）,PCR扩增长度多态性标记,14,(TTTTA)4 76bp(TTTTA)4 TTTTA 81bp(TTTTA)4 TTTTA TTTT
6、A TTTTA 91bp(TTTTA)4 TTTTA TTTTA TTTTA TTTTA 96bp(TTTTA)4 TTTTA TTTTA TTTTA TTTTA TTTTA 101bp(TTTTA)4 TTTTA TTTTA TTTTA TTTTA TTTTA TTTTA 106bp(TTTTA)4 TTTTA TTTTA TTTTA TTTTA TTTTA TTTTA TTTTA 111bp,Apo(a)基因,15,STR的特点,多态性（Polymorphism）：主要由核心序列拷贝数目即重复次数的变化，产生长度多态性目前国内外最广泛应用的遗传标记多态性信息含量大，准确率高达99.9999
7、9%，可用于个体识别扩增片段较短（100-300bp），易于检测，适用的生物检材类型广泛灵敏度高，50pg，对于检材要求不高,16,17,DNA条带、重复次数与遗传的关系,18,STR等位基因命名,等位基因通过PCR产物长度来区分和命名,19,20,检材的收集,血液精液颊粘膜病理切片头发牙齿骨骼组织石蜡包埋组织,21,22,Figure 3.1,J.M.Butler(2005)Forensic DNA Typing,2nd Edition 2005 Elsevier Academic Press,DNA的提取,23,24,多重荧光PCR,25,PCR product size(bp),Figu
8、re 5.4,J.M.Butler(2005)Forensic DNA Typing,2nd Edition 2005 Elsevier Academic Press,D3S1358,TH01,D21S11,D18S51,Penta E,D5S818,D13S317,D7S820,D16S539,CSF1PO,AMEL,VWA,D8S1179,TPOX,FGA,PowerPlex 16 kit(Promega Corporation),ILS600 CXR size standard,CXR(Red),FL(Blue),JOE(Green),TMR(Yellow),D3S1358,TH01,D
9、21S11,D18S51,Penta E,AMEL,VWA,D8S1179,TPOX,FGA,PowerPlex 16 kit(Promega Corporation),ILS600 CXR size standard,CXR(Red),FL(Blue),JOE(Green),TMR(Yellow),D3S1358,TH01,D21S11,D18S51,Penta E,AMEL,VWA,D8S1179,TPOX,FGA,PowerPlex 16 kit(Promega Corporation),ILS600 CXR size standard,CXR(Red),FL(Blue),JOE(Gre
10、en),TMR(Yellow),AmpFlSTR Identifiler kit(Applied Biosystems),6-FAM(Blue),VIC(Green),NED(Yellow),PET(Red),D8S1179,D21S11,D7S820,CSF1PO,D3S1358,TH01,D13S317,D16S539,D2S1338,D19S433,D18S51,TPOX,VWA,AMEL,D5S818,FGA,GS500 LIZ size standard,LIZ(Orange),AmpFlSTR Identifiler kit(Applied Biosystems),6-FAM(Bl
11、ue),VIC(Green),NED(Yellow),PET(Red),AMEL,D5S818,FGA,GS500 LIZ size standard,LIZ(Orange),26,27,Figure 12.3,J.M.Butler(2005)Forensic DNA Typing,2nd Edition 2005 Elsevier Academic Press,扩增产物电泳和检测在ABI基因分析仪上完成,28,ABI遗传分析仪家族,29,3130遗传分析仪的正面结构,30,技术核心（电泳与检测同时进行）毛细管电泳技术：PCR产物片段越长，迁移越慢，到达荧光检测窗口所需要的时间越长 荧光检测技
12、术：CCD（将收集到的荧光信号转换为电信号传输入电脑）,遗传分析仪的基本原理,31,32,33,步骤1 毛细管灌胶,每次电泳前毛细管都会灌胶，替换已经用过的旧胶，不会污染新的样品,34,步骤2 样品盘移动,样品盘X、Y、Z三维移动支持96孔或384孔样品盘有专门的盛放缓冲液、水及废液的4个槽,35,步骤3 自动电进样和电泳,毛细管和电极进入样品溶液仪器开始加电压荷负电的DNA分子进入毛细管，并在电场的作用下向阳极泳动,36,步骤4 荧光激发及检测分析,五色荧光标记的DNA片段按大小依次通过激光检测区，小片段在前，大片段在后激光激发荧光分子，产生荧光信号发射的荧光信号被CCD收集数据收集软件自动
13、将光学信号转换成电泳图谱中的有色峰，并通过自动分析软件进行分析,37,38,39,结果分析,40,肯定案例,41,排除案例,42,结果的判定,每个位点都符合遗传规律，则肯定大于三个位点不符合，则排除小于三个位点不符合，则考虑是遗传变异,43,肯定案例,44,排除案例,45,STR分型检测的应用,已婚夫妇，丈夫怀疑孩子非己所生私生子超生子女血缘鉴定移民案件怀疑育婴室调错婴儿拐卖儿童，失散儿童,大型灾难中受难者身份识别无名尸体身份鉴定移植鉴定病理切片来源鉴定刑事案件中犯罪现场生物检材来源鉴定,亲权鉴定,个体识别,46,Y染色体STR在亲子鉴定中的应用,47,男性所特有的性染色体，它处于半合子的单倍
14、体状态，呈父系遗传，同一父系的所有后代均具有相同的Y染色体特异性基因（除非是发生了突变）,Y染色体STR,48,作为常规亲子鉴定的有力补充，用于父子单亲鉴定，叔侄，兄弟，祖孙亲缘关系的鉴定性侵犯案件发生48小时后仍可以检出，男女混合斑的检查个体识别：刑侦过程中确定性别，提供线索，缩小侦查范围人类迁移的研究：父系进化史,Y染色体STR的应用,49,Modern Use of Y-STR Testing,Captured December 13,2003,Is this man really Sadaam Hussein?,Butler,J.M.(2005)Forensic DNA Typing,
15、2nd Edition,Box 23.1,p.534,50,DNA序列多态性标记,51,线粒体DNA多态性在亲子鉴定中的应用,52,稳定的母系遗传：母系血缘亲属具有完全相同的mtDNA 拷贝数多：有利于微量检材；检测敏感度高 片段短：抗降解，有利于降解检材，如角化组织（毛发等）突变率高：多态性高，个人识别能力强,线粒体DNA特征,53,Heavy(H)strand,Light(L)strand,Figure 10.1,J.M.Butler(2005)Forensic DNA Typing,2nd Edition 2005 Elsevier Academic Press,Coding Region,54,线粒体DNA多态性分析,DNA提取引物设计合成和HVI和HVII的PCR扩增PCR产物测序序列比对,55,线粒体DNA序列分析结果解读,若两份检材的DNA序列相同，则表明这有可能来自同一个母系亲属 检材和嫌疑人检测结果有1-2个bp不一致，而且碱基的位置为异质性热点，则倾向于不排除 3个碱基序列不同时，在排除污染、细胞核假基因扩增产物的情况下，并按照国际法医遗传学会mtDNA标准操作方法执行的，可以做出排除结论。,56,线粒体DNA多态性在亲子鉴定中的应用,母子鉴定同胞兄妹鉴定母系血缘鉴定,57,Thank you for your attention！,
