《清毒栓对 SiHa 细胞 P53 泛素化降解途径的影响1.doc》由会员分享，可在线阅读，更多相关《清毒栓对 SiHa 细胞 P53 泛素化降解途径的影响1.doc（5页珍藏版）》请在三一办公上搜索。
1、精品论文推荐清毒栓对 SiHa 细胞 P53 泛素化降解途径的影响1于妍妍 1，金哲 21 北京中医药大学东方医院，北京（100076）2 北京中医药大学东方医院妇科，北京（100078）E-mail:jinzhe1954摘要；目的：研究中药清毒栓对宫颈癌SiHa细胞生长的调节作用，从细胞生物学及分子生物学水平探讨中药清毒栓对宫颈癌SiHa细胞增殖抑制及P53泛素化降解途径中各个蛋白表 达的情况研究。方法：以4含药血清培养液作用于SiHa细胞，设立正常对照组、空白血清 组、清毒栓组及保妇康组、干扰素组，通过MTT法检测含药血清对细胞增殖抑制的影响； 同时运用 Western-Blot的方法检测
2、HPV16E6、P53、E6AP蛋白的表达情况。结果：经含药血 清培养液作用后各组细胞数量减少，其中以4%浓度含药血清作用72h时对细胞抑制作用最 强，与空白血清组比较，差异有显著性（P0.01）；同时含药血清有升高P53蛋白的表达， 降低HPVE16、E6-AP的表达。结论：清毒栓含药血清可能是通过调控P53泛素化降解途径而 达到抑制肿瘤的目的。关键词：清毒栓；SiHa细胞；P53泛素化降解途径子宫颈癌（carcinoma of cervix）是发展中国家妇女最常见的恶性肿瘤，居女性生殖器官 恶性肿瘤的首位1。宫颈癌成为目前人类所有癌症中唯一病因明确的癌症，唯一可以预防的 癌症2。大量研究发
3、现高危型 HPV16、18 的某些亚基因结构是宫颈癌发病及发展的癌基因， 在一定条件下与某些因素协同作用而引起组织细胞异型性变，最后导致恶性转化，发生癌变。 抗癌基因的失活与癌基因的激活参与人类各种肿瘤的形成和发展，在抗癌基因 P53、P21、 P27、Rb等中，由于人类恶性肿瘤中至少有 50发生了 p53 基因的变化，因此其最受瞩目。 目前西医对HPV感染引起的宫颈病变没有特效的药物预防和治疗，临床上中医药在治疗女性 生殖道HPV感染方面取得了一定的成效3-5。因此，本文主要针对以上问题，从分子角度， 就p53 这一经典的抗癌基因，探讨中药在抗p53 泛素蛋白酶体（ubiquitin-pro
4、teasome pathway,UUP）降解途径方面的作用机制。进一步探讨中药在HPV相关宫颈癌细胞中抗病 毒、抗肿瘤的机制。1材料与方法1.1 试剂胎牛血清(购自元享圣马公司) ；DMEM全培养液（购自美国GIBCO公司）；青霉素和链 霉素(购自华北制药厂)；胰酶及EDTA（购于SERVA公司及赛多利斯公司）；噻唑蓝（MTT） 购于北京欣源佳和生物科技有限公司；二甲基亚砜（DMSO）为上海华舜产品；一抗p53为 小鼠单克隆抗体（上海博士德公司）,一抗HPV16E6为小鼠单克隆抗体（Santa Cruz），一抗 E6-AP为兔多克隆抗体（Santa Cruz）,一二抗为辣根酶标记山羊抗兔IgG
5、和辣根酶标记兔抗小 鼠IgG（中衫金桥公司）。蛋白质分子量Marker（美国MBI公司），硝酸纤维素膜（美国Millipore 公司）、其余试剂丙烯酰胺，双丙烯酰胺，丽春红，十二烷基硫酸钠，-巯基乙醇等均为国 产分析纯。显影液、定影液（上海冠龙照相器材公司）。1基金项目：高等学校博士学科点专项科研基金（中药对 HPV 相关宫颈癌细胞 PTEN-MDM2-P53 网络及泛素化 影响,No：20050026003）- 5 -1.2 细胞株人宫颈癌细胞系SiHa细胞为HPV16表达阳性的人宫颈鳞癌细胞系（美国ATCC细胞 库），由北京大学人民医院干细胞中心妇科实验室魏丽惠教授惠赠。1.3 药物1.3
6、.1 研究药物 清毒栓：为中药制剂，主要组成药为莪术、紫草、黄柏等。均购自北京同仁堂药店，将复方药物分别醇提（紫草）、提油（莪术）、水煎（黄柏）去渣浓缩后配成药液，2375g生药制作成560毫升的液体，终浓度约为4.2g/ml，高温消毒后于4冰箱保存；中药阳性对照药 按保妇康栓组成比例（主要成分为莪术油及冰片）6制成的口服溶液，西药阳性对照药重组 人干扰素2b水针剂 7（安徽安科生物工程股分有限公司生产）。以上药物均按人临床给 药剂量的等效剂量10倍制成药物留用（200g体重大鼠给药剂量60 kg体重人给药剂量0.01810）。1.3.2 血清药的提取 选取SD雌性大鼠40只，体重为20025
7、0g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司（京动许字（2000）第004号总049号。随机分成四组：空白血清组（给生理盐水），阳性药组（清毒栓），中药对照药组（保妇康），西药对照药组（安达芬）。每组10只，每日同一时间给药，6天后腹主动脉取血，将血液静止30min后，3000rpm/min,离心10min，取上清分装到1ml无菌EP管中，保存至86C冰箱备用，用前56C度水浴30min，灭活补体。1.4 实验方法1.4.1 血清药的提取 选取SD雌性大鼠40只，体重为200250g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司（京动许字（2000）第004号总049号。随机分成四组：空白血清组（给生理
8、盐水），阳性药组（清毒栓），中药对照药组（保妇康），西药对照药组（安达芬）。每组10只，每日同一时间给药，6天后腹主动脉取血，将血液静止30min后，3000rpm/min,离心10min，取上清分装到1ml无菌EP管中，保存至86C冰箱备用，用前56C度水浴30min，灭活补体。1.4.2 MTT法测定含药血清对SiHa细胞的抑制影响 取对数生长期细胞制成单细胞悬液，计数，细胞浓度为3104个细胞/ml，每孔100l，排枪接种于96孔培养板中, 设空白调零孔。在37C 5%CO2培养箱中培养48h后，用含2.5%胎牛血清的培养基分别稀释含药血清浓度为4%、8%，终体积为100ul/孔，每种浓
9、度设立6个平等 对照，并设正常对照，置正常培养条件下培养。每24h换液 1 次，作用24、48、72h后，弃 去孔中培养液，每孔加入MTT100ul，反应4h后，弃去每孔中的液体，加入DMSO，100ul/ 孔，振荡10min后，选择492nm波长，在酶标仪上测定各孔吸光值（OD）值，记录结果。1.4.3 Western-blot法测定p53、HPVE16E6-AP的含量 用细胞刮子分别收集以4%浓度不同含药血清培养液作用72h及对照组细胞的蛋白，冰上1h。然后4离心10min,将上清移至预冷的EP管中，Bradford 法测定蛋白含量后，将剩余蛋白样品加入等体积上样缓冲液,沸水中煮5min。
10、制胶后上样，以电泳缓冲液冲洗加样孔数次。分别将处理好的80g各组蛋白样品按按照预定的顺序加入浓缩胶的上样孔内。经过电泳及转膜、封闭，封闭结束后，将膜移入杂交袋中，加入用适当漂洗液稀释的一抗E6-AP为1：2000； p53为1：200； HPV16E6为1：50），封口，4孵育过夜，加入漂洗液稀释的辣根过氧化 物酶标记的二抗（E6-AP为1：7500； p53为1：5000；HPV16E6为1：2000），振荡温育后 感光、拍照。用Band Leader 3.0软件对扫描图象的目的条带进行灰度分析。2. 统计学方法所有检测数据采用 SPSS12.0 软件包进行统计学处理，采用单因素方差分析。3
11、. 结果3.1 MTT 法测定含药血清对 SiHa 细胞的抑制影响各血清药组与空白血清组比较均出现活细胞数量减少（P0.05），各组含药血清在各时 间点（24h、48h、72h）对 SiHa 细胞均有抑制作用，尤以 72h 为显著，与空白血清组比较有 显著性差异（P0.01）（见表 1）。西药阳性药组抑制作用最强，清毒栓组次之，再次为保 妇康组。但清毒栓组与西药阳性对照组安达芬组比较，有显著性差异（P0.05）；表 14%含药血清作用不同生长时间细胞生长及增殖情况（od 值，s）组别N细胞生长时间正常对照组624h0.3810.01248h0.4680.01472h0.6410.034空白血清
12、组60.3740.0570.4460.0220.6200.013清毒栓组60.3030.044*0.4110.015*0.5440.015*保妇康组60.3040.031*0.4210.009*0.5640.021*安达芬组60.3680.048*0.3980.008*0.4960.022*注：与空白血清组比较，*P0.01；与清毒栓组比较P0.053.2 western-blot 法对 p53、HPVE16、E6-AP 蛋白含量测定经Western-Blot并测定电泳条带灰度值，计算p53、HPVE16、E6-AP灰度值，可见各组 含药血清与对照组相比，HPVE16、E6-AP的表达量均降低
13、（P0.01），以清毒栓组最佳，安 达芬组次之，p53的表达量均升高（P0.05），P53清毒栓组最佳，安达芬组次之。（见表2、 图1）表 2各组含药血清作用 72h 后 p53、HPV16E16、E6-AP 蛋白表达比较 （XS，N=3）正常对照组56.100.0276.210.02100.280.05空白血清组清毒栓组49.380.0482.760.03*74.250.0138.720.04*104.430.0430.780.02#保妇康组56.580.0249.240.02*60.720.03*安达芬组72.960.06*44.130.05*49.140.01#组别p53HPV16E6E
14、6-APp53HPV16E6E6AP注：与空白血清组比较，*P0.05,# *P0.0112345图 1：1 正常对照组 2 清毒栓组 3 保妇康组 4 安达芬组5 空白血清组4. 讨论p53 蛋白可通过 UUP 降解，导致宫颈癌前病变及宫颈癌8。实验研究表明，p53 表达的 降低与宫颈癌的发生密切相关。目前，运用中药抗病毒、抗肿瘤防止宫颈癌是研究的热点问 题，但如何发挥其抗病毒、抗肿瘤的作用，也正是本实验研究的目的。高危 HPV 感染与宫颈癌的发生密不可分，在宫颈癌形成过程中，HPV 通过 UUP 介导 降解 p53（抑癌基因）导致 p53 蛋白表达而获得的 9。UUP 由泛素、泛素启动酶系
15、统、泛 素再循环酶、26S 蛋白酶体组成。其中泛素启动酶系统由泛素活化酶（E1）、泛素结合酶(E2）、 泛素蛋白连接酶（E3)）组成， E6AP 属 E3 酶。高危 HPV(如 16 ,18 型)编码的 E6 癌蛋白可 结合 p53(此结合需 E6 相关蛋白 E6-AP 的存在)。促进 p53 通过 UPP 发生降解, 引起癌细胞 内 p53 含量降低。E6 癌蛋白促进连接酶与底物蛋白结合，病毒通过利用自身编码的蛋白激 活宿主细胞的 E6-AP（具有 E3 酶的作用）10，E2 酶是催化泛素与蛋白底物结合所需的第一 个酶11，在 E2 类酶或转录因子 E2F-1 存在下，E6-AP 可与泛素形
16、成硫醇酯复合物，使泛素 活化导致 p53 被 26S 蛋白酶体降解，而避开 p53 的抑制作用，使感染细胞不能正常进行 DNA 修复，突变的积累最终导致癌变的发生。其中 HPVE6、E7 癌蛋白发挥着至关重要的作用12。从实验结果可以看出，空白血清组与正常血清组无论在细胞增殖抑制实验还是Western- Blot实验，其检测结果相较均无显著性差异，排除动物血清造成实验结果假阳性的可能。在 细胞增殖抑制实验中，三组含药血清均有抑制宫颈癌SiHa肿瘤细胞增殖的作用，并且随着作 用时间的延长，有明显的时间依赖关系，其中以安达芬组为最佳，清毒栓组次之。通过含药 血清最佳浓度和时间作用于宫颈癌SiHa细
17、胞，运用Western-Blot实验方法检测，p53蛋白的表 达量与空白含药血清相比均有升高，而HPV16E6及E6AP蛋白表达较之降低。以此说明，清毒栓可通过降低HPV16E6及E6AP的含量，从而减慢p53被泛素化降解途径降解的过程，使得p53蛋白表达含量升高，达到抗癌、抗病毒的作用。综上所述，中药复方制剂清毒栓抗宫颈 癌、抗病毒的作用机制可能是通过直接降低HPVE6癌蛋白的表达，降低p53被泛素化降解途 径中必要的E3酶降解而起作用的，而在此途径中发挥E2酶作用的蛋白还有待进一步深入研 究。参考文献1 Gemma G. Kenter， J.P.et al. Phase I Immunot
18、herapeutic Trial with Long Peptides Spanning the E6 and E7 Sequences of High-Risk Human Papillomavirus 16 in End-Stage Cervical Cancer Patients Shows Low Toxicity and Robust Immunogenicity Clin. Cancer Res,2008,14(1):169-177.2 Gemma G. Kenter， J.P.et al. Phase I Immunotherapeutic Trial with Long Pep
19、tides Spanning the E6 and E7Sequences of High-Risk Human Papillomavirus 16 in End-Stage Cervical Cancer Patients Shows LowToxicity and Robust Immunogenicity Clin. Cancer Res， 2008; 14（1）: 169 177.3 金哲，楼姣英清毒栓治疗宫颈人乳头瘤病毒亚临床感染的临床研究中华中西医临床杂志，2006.02(2)：20-25.4 李云波，金哲. 清毒栓含药血清对宫颈癌SiHa细胞MDM2基因的影响中国中西医结合杂志，
20、2007，27(2)：147-150.5 金哲，李云波. 清毒栓含药血清对宫颈癌 SiHa 细胞 p53 基因调控作用的研究中国中西医结合杂志，2007，27(2)：47-50.6 商宇红，白丽霞，魏丽惠.中药保妇康栓对宫颈癌细胞抑制作用的分子机制研究J.中国妇产科临床杂 志,2003,4（5）336-338.7 宋利琼，张昌菊. 莪术油联合干扰素对小鼠宫颈癌端粒酶活性和细胞凋亡的影响J. 上海中医药杂 志,2006,40（7 ）：68-69.8 Ghosh M,Huang K,Berberich SJ.Over expression of MDM2 and MdmX fusion prote
21、ins alters p53 mediated transactivation, ubiquitination, and degradationJ .BioChem,2003,42(8);2291-2299.9 张旭红. 泛素蛋白酶体复合通路在妇科恶性肿瘤中的研究. 国外医学妇产科学分册,2006,33(4):225228.10 Petric K, The Role of the Ubiquitin Ligase E6-AP in Human Papillomavirus E6-mediated Degradation ofPDZ Domain-containing Protein s J.
22、The journal of biological chemistry,2007, 282:65-71.11 WU Hui-juan,ZHANG Zhi-gang.Ubiquitin-Proteasom a pathway and its significanceJ. Journal ofInternational Pathology and Clinical Medicine,2006,26(1):140-143.12 Kyung WH, Xiaobo Z,et al. Human Papillomavirus Type 16 E7 Oncoprotein Associates with t
23、he Cull-in 2Ubiquitin Ligase Complex, Which Contributes to Degradation of the Retinoblastoma Tumor Suppress-or J. Journal of virology,2007,81:9737-9747.Study on QingDuShuan impacting p53 ubiquitin degradation patyway of cervical cancer SiHa cell Yu Yan-yan，Jin ZheDepartment of gynecology BeiJjing ,T
24、raditional Chinese of medicine of DonFang Hospital & BeiJjing(100078)AbstractObjective: From the cell biology and molecular biology level discussing the role of QingDuShuantreating SiHa cells of cervical cancer proliferation and p53 ubiquitin degradation patyway in various protein expression.Methods
25、: 4% containing serum Cultivate SiHa cells, establishing a normal control group, blank serum group and QingDuShuan group ,BaoFukang group, interferon control group, detecting the influence of drugs inhibiting and proliferating siha cell by MTT assay .At the sametime ,use of Western-Blot method detec
26、tHPV16E6、p53、E6AP protein expression. Results：Afterculture medium containing drug serum decrease in the number of cells, 4 % concentration of serum for72h was strongest.Compared with the control group,there were significant differences (P 0.01). At the same time , the containing serum elevated expression of tumor suppressor protein of p53, reduce cancerprotein expression of HPVE16、E6-AP.Conclusion：QingDuShuan containing serum inhibit tumorthrough regulating p53 ubiquitin degradation patywayKeywords: QingDuShuan；SiHa cells；p53 ubiquitin degradation patyway
